耐药性检测范文

耐药性检测范文（精选9篇）

耐药性检测 第1篇

目前, 临床上主要以药敏试验来检测结核分枝杆菌的耐药性, 但由于该方法存在的诸多弊端, 不能及时获得耐药信息, 限制了个体化治疗方案的实施, 不合理的用药也导致获得性耐药及传染源得不到及时控制。探索结核分枝杆菌耐药性检测新方法已成为全球关注的热点和难点。本文通过比较分析传统的绝对浓度法和单链探针反向杂交 (Line probe assay, LiPA) 检测结核分枝杆菌耐药性, 为临床药敏试验提供参考。

1 材料

1.1 标本来源

我市结核病防治研究所临床送检及分离的结核菌株30例, 结核杆菌标准菌株H37RV购自中国药品生物制品检定所。

1.2 药物及试剂

利福平 (RFP) 纯品, 硫酸链霉素 (SM) 粉针剂, 异烟肼 (INH) 注射液;盐酸乙胺丁醇 (EMB) 纯品;改良罗氏培养基;末端脱氧核苷酸转移酶, 脱氧胸腺嘧啶核苷酸, 硝酸纤维膜, 小牛胸腺DNA, 预杂交液 (4×SSC, 5×Denharts, 0.1mg/ml小牛胸腺DNA, 0.5%SDS) , 洗液Ⅰ[100mmol/L Tris-HCl, 150mmol/LNaCl, 2mmol/LMgCl2, 20.05%Tritonx-100 (pH7.5) ], 洗液Ⅱ[100mmol/LTris-HCl, 150mmol/LNaCl, 1mmol/LMgCl2, 20.05%Tritonx-100 (pH9.5) ], 链亲和素碱性磷酸酶, BICP/NBT显色系统。

2 方法

2.1 绝对浓度法药敏试验

2.1.1 菌悬液的制备及接种:

将2~3周菌龄的分枝杆菌用接种环小心取出, 置于含0.5%Tween80的无菌试管内, 研磨成乳酪状, 生理盐水稀释, 与麦氏比浊管比浊, 配成1mg/ml的菌悬液, 1∶100稀释, 各吸取0.1ml分别接种于每支含药培养基的斜面上, 并接种2支空白对照管 (不含药的改良罗氏培养基) 。以标准菌株H37RV做培养基质控。接种完毕后, 置35℃恒温箱内培养, 4周后观察结果。

2.1.2 药敏试验结果观察:

以无药对照管生长, 含药高、低浓度管均不生长为敏感;含药低浓度管生长、高浓度管不生长, 则中度耐药;高、低浓度管均生长为高度耐药。H37RV株各药均耐药。

2.2 LiPA技术药敏检测

2.2.1 菌标本的处理:

菌标本用1mlddH2O溶解混匀, 13 000rpm离心10min, 去上清, 沉淀, 用700μmol/LnaoH37℃液化2h, 13 000rpm离心10min, 去上清, 沉淀, 用1mlddH2O溶解混匀, 13 000rpm离心10min, 重复水洗1次, 沉淀用200μl裂解液裂解, 加20mg吸附剂 (Chelex100) , 煮沸15min, 震荡3min, 13 000rpm离心5min, 取上清。对上清进行纯化 (UNIQ-10柱) 并浓缩至150μl作为PCR反应模板。

2.2.2 膜片的制备:

膜片 (Biodyne C, Pall Biosupport公司) 用10%EDC液浸泡15min, 蒸馏水清洗数次。取1μl寡核苷酸探针 (5pmol/μl, 溶于0.5mol/LNaHCO3缓冲液, pH8.4) 点模, 反应15min, 再用100mmol/LNaOH处理, 水洗晾干备用。

2.2.3 PCR扩增目的rpoB基因:

取制备好的模板2μl进行PCR反应扩增目的rpoB基因, 程序为:50℃5min, 95℃15min, 95℃45s, 65℃30s, 72℃45s, 35℃45s, 72℃5min。

2.2.4 电泳:

PCR产物取5μl, 点样于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶上, 100V电压, 电泳30min。对照组为不含模板 (不含结核杆菌) 的反应体系进行PCR的产物。

2.2.5 变性及杂交:

取15ml离心管, 放入已编号的膜片, 加Ⅰ液 (2×SSC, 0.1%SDS, pH7.4) 5ml, 60℃预热30min。将PCR产物98℃加热10min, 立即置于冰上5min, 然后加入装有相应编号膜片并预热好的离心管中, 放入59℃杂交箱中杂交2h。取50ml离心管, 加Ⅱ液 (0.5×SSC, 0.1%SDS, pH7.4) 40ml, 放入59℃恒温箱45min。

2.2.6 洗膜显色:

取出膜片, 置装有预热Ⅱ液的50ml离心管中, 59℃轻摇洗涤10min, 放入20mlⅢ液 (含5μlStreptavidin-POD, 过氧化物酶标记的链霉素亲和素蛋白) 30min, 再用Ⅰ液室温洗涤2次。用Ⅳ液 (0.1M柠檬酸钠, pH5.0) 洗涤2min, 浸泡于显色液 (19mlⅣ液, 1mlTMB四甲基联苯胺, 10μl3%H2O2现配) 避光显色10min, 显色后立即泡入清水中。

3 结果

3.1 绝对浓度法检测耐药性结果

见表1。

3.2 LiPA技术药敏检测结果

见表2。

注:R-耐药, S-敏感, *无数据。

3.3 绝对浓度法和LiPA技术药敏检测所需时间比较

见表3。

4 讨论

耐药性结核在WHO调查的109个国家都存在[2], 全球每年有30万MDR-TB新病例[3]。我国结核杆菌培养及利福平 (RFP) 、异烟肼 (INH) 、链霉素 (SM) 和乙胺丁醇 (EMB) 4种药物的初始耐药率是14.8% (浙江) ~42.1% (辽宁) ;获得性耐药率为33.7% (广东) ~66.0% (河南) [4]。在我国每年发生的425 000例新MDR-TB病例中, 有多达14%的病例使用标准药物治疗无效[5]。长期以来, 临床结核杆菌的耐药性检测大多采用传统的绝对浓度法, 该方法存在操作繁琐、菌株分离培养速度慢、耗时长等缺陷。

实验显示, LiPA技术与传统的检测方法实验吻合度为77.7%, 两者相比, LiPA技术具有可直接对样本进行检测、实验危险性低、结果快捷等优势。但是, 因为基因检测方法需要一定量的分枝杆菌DNA, 当DNA扩增过程有某些抑制PCR反应的物质存在时, 或临床样本中极少部分亚群杆菌出现耐药时, 易出现假阴性、漏检等结果, 存在一定的局限性。

在检测结核杆菌耐药性时, 基因检测方法比传统药敏试验在检测所需时间上具有相当大的优势, 但一些基因型耐药和表型耐药可能存在不一致性, 且尚有部分结核杆菌的耐药机制不明, 故而在早期进行基因检测的同时, 还需与常规药敏试验相结合, 才能提高耐药性诊断结果的可信度。随着分子生物学的发展, 基因检测的应用前景必将不断扩大。

摘要：目的:对结核分枝杆菌耐药性的传统检测和基因检测技术进行比较, 为临床药敏试验提供参考。方法:收集我市结核病防治研究所临床送检及分离的结核菌株30例, 用绝对浓度法检测其耐药性。单链探针反向杂交技术 (LiPA) 检测其中9例单耐利福平的菌株。结果:绝对浓度法和LiPA技术检测结果吻合度为77.8%, LiPA检测技术所需时间为2448h, 绝对浓度法检测所需时间为4周。结论:LiPA技术检测结核分枝杆菌耐药性与传统检测方法相比较, 在时间上具有较大优势, 但该技术仅用于耐药基因已经明确的耐药菌株的检测, 在临床上可与常规的药敏试验相结合, 提高耐药菌株检测的可信度。

关键词：结核分枝杆菌,耐药性,LiPA技术

参考文献

[1]李凡, 刘晶星, 徐志凯.医学微生物学〔M〕.北京:人民卫生出版社, 2009:150.

[2]Espinal MA, Laserson K, Camacho M.Determinants of drug re-sistant tuberculosis:analysis of 11countries〔J〕.Int J TubercLung Dis, 2001, 12 (5) :887-893.

[3]Emken, E.A.Kai Barriers to reaching the targets for tuberculo-sis control:multidrug-resistant tuberculosis〔J〕.Bulletin of theWorld Heath Organization, 2007, 85 (5) :387-390.

[4]陈巍.我国结核病现状及对策〔J〕.中国实用乡村医生杂志2008, 15 (3) :5-6.

乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测 第2篇

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义

HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。

乙肝的治疗方式有哪些？

HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么？

HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种：

（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；

（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；

（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。

HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。

核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。为了持续抑制HBV的复制，NA抗HBV治疗的疗程往往需要数年。但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。

HBV对NA的耐药分析

1.拉米夫定(LAM)

LAM属于L-构型核苷，是目前用于临床最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。在LAM初次治疗时，1、2、3、4和5年YMDD突变的发生率约为23％、46％、55％、65％和7l％。LAM主要的耐药突变位点是rtM204V／I(YMDD变异)，rtM204V变异通常与其补偿突变rtL180M联合出现，rtM204V／I株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rtM204V、rtM204I和rtL180M，其他的突变位点有rtL80V／I、rtI169T、rtV173L、rtTI84S和rtQ215S这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M；(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L；(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。这些HBV耐药突变株常以准种的形式存在，当使用LAM治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。

LAM耐药的分子机制目前推断可能是rtM204位点参与形成了LAM与聚合酶的结合部位，rtM204位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使dNTP结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了LAM与dNTP底物的亲和力；(2)降低使LAM三磷酸根结合到正在复制的病毒DNA的催化活性，这些原导因致rtM204位点突变株的复制力减低，且与LAM的结合力低于野生侏，从而降低了LAM的抗病毒作用。

2.恩曲他滨（FTC）

FTC属低耐药基因屏障药物，在临床应用中应密切关注其耐药情况。体内与体外研究均表明FTC耐药位点与LAM相同，即rtM204V/I ± rtL180 M变异，FTC治疗1年的基因型耐药发生率为13%～16%，但缺乏长期的耐药数据。

在开始FTC治疗前应充分评估患者的治疗指征，详细了解患者既往治疗史。免疫耐受期的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者除非需接受免疫抑制剂治疗等特殊情况，一般不建议进行抗病毒治疗。首次出现ALT升高的CHB患者，应分析其可能的诱因，慎重开始抗病毒治疗。FTC治疗期间应督促患者规范服药、定期随访，尽可能提高患者依从性。如随访发现患者病毒学应答不佳或出现病毒学突破，应及时明确患者是否存在依从性问题。排除依从性问题后，应及时进行HBV基因型耐药检测以明确FTC耐药情况，相应调整治疗方案。

目前对于FTC耐药挽救治疗证据尚不充分。参照LAM耐药挽救治疗情况，可考虑加用ADV或TDF抗病毒治疗，亦可考虑换用TDF抗病毒治疗。

3.阿德福韦酯(ADV)

ADV属于无环嘌呤类核苷酸类似物。与LAM相比，在使用ADV初次治疗时，1～5年基因耐药变异的概率分别为0％、3％、6％、18％、29％，耐药发生的时间和机率都远低于LAM。然而，在已产生了LAM耐药的患者中，单独改用ADV治疗1年和2年，基因耐药变异率分别升高为6.4％和25.4％，ADV联合LAM治疗可降低耐药突变发生率，对于产生LAM耐药的患者，加用ADV为首选。

与LAM单点突变不同，ADV相关的耐药突变多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有rtA181T、rtA181V和rtN236T，组合方式主要有四种：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到，但是，该突变并未合并rtM204I／V的突变。有认为这是因为rtAl81V／T突变能改变rtM204密码子的位置，导致一个间接的催化位点空间位阻，从而使LAM的敏感性下降。有进一步研究表明A181V／T突变株对LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但对TDF仍然敏感。4.恩替卡韦(ETV)

ETV是一种脱氧嘌呤核苷酸类似物，ETV对初治患者很少发生耐药，1-5年的累积耐药发生率分别为0.2％、0.5％、1.2％、1.2％与1.2％。但对原有LAM耐药的患者，改用ETV，治疗1-5年后的临床耐药率分别为6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。因此，ETV在LAM失效患者中的耐药发生率明显增加，产生LAM耐药的患者不推荐首选ETV。这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上，再联合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位点上一个或多个的氨基酸突变。

其耐药变异主要有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2)rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。有体外试验证实，rtM250位点突变可引起ETV的敏感性下降，单独rtI169位点的突变对ETV只低度耐药，但rtI169联合rtM250位点突变则可阻止DNA链延伸，从而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位点的突变可以改变YMDD附近的核苷酸聚合酶结合袋的几何构像，影响C区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。ETV需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。由于ETV抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。

5.替比夫定(LdT)

LdT与LAM同属于L-构型核苷，与LAM耐药基序相似，都发生在YMDD区，但其耐药发生率低于LAM，对初治患者的第l与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。而且LdT出现的耐药突变位点仅有rtM204I，尚未发现rtM204V变异。原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。也有文献报道LdT相关的耐药突变还可发生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位点，其意义还有待进一步明确。

6.替诺福韦(TDF)

TDF是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。在Ⅲ期临床实验中，替诺福韦治疗2年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗72周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定72周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。有报道称rtA194T变异与TDF耐药相关，能够改变DNA模板与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。体外实验发现，rtA181／T或rtN236T突变的ADV耐药株对TDF的敏感性下降34倍；若此位点与rtL180M+rtM204V联合出现，则能增加TDF半数抑制浓度10倍以上。

乙型肝炎病毒耐药基因检测的临床意义

（1）在初始治疗前检测，有助于判断是否感染耐药突变株，可以帮助选择初治药物；

（2）在治疗过程中检测，有助于及时发现基因型耐药，从而采取预防措施，避免发生病毒反弹；

（3）耐药发生后检测，可根据耐药情况及时换药加药或更改治疗方案，使患者获得更好的治疗效果。

我们可以提供的乙型肝炎病毒耐药基因和分型检测项目有哪些？

1.2.检测血液中乙肝病毒的DNA浓度（被称为乙肝病毒载量）。这项检测用于监测乙肝病毒在体内复制水平，从而衡量病人的受感染情况以及监测治疗情况。

检测乙型肝炎病毒耐药基因，与六种用于乙肝抗病毒治疗的核苷（酸）类药物相关的11个耐药位点的基因变异情况。

3.检测乙型肝炎病毒A、B、C、D、E、F、G、H八种基因型。

HBV耐药检测建议

    在使用核苷（类）药物治疗前，先做一次耐药检测，以确定用药种类 在治疗的最初两年，对于轻微肝病患者，推荐每6个月检测一次 两年后建议每3个月检测一次，因为这个时候耐药出现的可能性更高

对病情较重的患者来说，耐药的后果会迅速表现出来，并可能威胁生命，因此建议每3个月检测一次

检测的技术

1.即时定量PCR检测： 用于检测血液中乙肝病毒的DNA水平。

可以使用的试剂盒：GeneProof Hepatitis B Virus(HBV)PCR Kit

2.HBV基因分型检测

采用测序法，对HBV基因S区进行扩增及测序，获得病毒的型别信息。

3.HBV耐药基因检测

耐药性检测 第3篇

方法 用标准纸片扩散法检测ESBLs,头孢西丁三维试验法检测AmpC酶,药敏试验采用KB纸片法,依据NCCLS2006判断标准分析结果。结果182株肺炎克雷伯菌中检出产酶菌株117株,检出率为64.3%,其中单产ESBLs63株,单产AmpC酶32株,一并产ESBLs和AmpC酶22株,检出率分别为34.6%、17.6%和12.1%。产AmpC酶肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素高度耐药,耐药率达74%～100%;头孢吡肟耐药率为43.2%、头孢哌酮/舒巴坦耐药率为29.9%,而阿米卡星、左氧氟沙星的耐药率仅为16.4%、10.1%;对亚胺培南、美罗培南均100%敏感。产ESBLs菌株除对亚胺培南、美罗培南100%敏感,阿米卡星、左氧氟沙星耐药率分别为30.7%、28.8%外,其他头孢菌素、酶抑制剂的抗菌药物均表现较高耐药性。结论 老年医院患者感染肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶的状况相当突出,产酶株对多种抗菌药物耐药,对碳青霉烯类敏感性最好。

【关键词】 AmpC酶;ESBLs;肺炎克雷伯菌;耐药性;老年人

文章编号:1003-1383(2010)05-0560-02 中图分类号:R 378文献标识码:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.05.021

随着广谱抗生素的广泛应用,临床耐药菌株的产生相当突出和严重。肺炎克雷伯菌是临床分离及医院感染最重要的病原菌之一,而由该菌引起的感染难治性日益突现,尤其在老年病医院。肺炎克雷伯菌作为医院感染的重要致病菌,继超广谱β内酰胺酶(ESBLs)后,又出现质粒介导的AmpC酶,且质粒介导者因其具有较快的传播速度和较强的耐药性,日益受到人们的重视[1]。实验室注重产AmpC酶及ESBLs菌株的检测,对于指导临床合理应用抗生素,减少耐药菌株的产生及传播具有非常重要的意义。为此,本文对我院(老年病医院)老年患者感染肺炎克雷伯菌AmpC酶和ESBLs的产生情况及其耐药性进行分析,现报道如下。

材料与方法

1.材料 ①菌株:为我院2009年3月至2010年3月住院患者临床标本分离的肺炎克雷伯菌,共182株,患者年龄60～92岁,平均(67±3)岁。②药敏纸片及培养基均为英国OXOID产品。质控菌株:肺炎克雷伯菌ATCC603作为ESBLs检测的阳性对照株, 肺炎克雷伯菌T015作为AmpC酶检测阳性对照株。大肠埃希菌ATCC25922作为药敏质控株。均由卫生部临床检验中心提供。

2.病原菌的分离培养、鉴定及药敏试验细菌的分离培养按照《全国临床检验操作规程》(第三版)[2]进行,采用法国梅里埃公司ATB Expression自动细菌鉴定仪(配套相应的鉴定板)进行鉴定。药敏试验采用KB纸片法,根据NCCLS2006年版标准判定结果。

3.AmpC酶的检测 初筛试验:在KB纸片扩散法药物敏感性试验中,如果头孢西丁抑菌圈直径≤17 mm,提示该菌株为疑产AmpC酶菌株。确证试验:应用头孢西丁三维试验检测AmpC酶[3]。

4.ESBLs 的检测按照NCCLS 推荐的标准纸片扩散

法,头孢他啶/克拉维酸与头孢他啶抑菌圈直径相比≥5 mm,和(或)头孢噻肟/克拉维酸与头孢噻肟抑菌圈直径相比≥5 mm,可确证为产ESBLs菌株。

结果

1.ESBLs和AmpC酶检出结果 182株肺炎克雷伯菌中检出产酶菌株117株,检出率为64.3%,其中单产ESBLs63株,单产AmpC酶32株,同时产ESBLs和AmpC酶22株,检出率分别为34.6%、17.6%和12.1%。 

2.对常见抗生素的耐药情况 产AmpC酶肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素高度耐药,耐药率达74%～100%;头孢吡肟为43.2%、头孢哌酮/舒巴坦为29.9%。而阿米卡星、左氧氟沙星的耐药率仅为16.4%、10.1%;对亚胺培南、美罗培南均100%敏感。产ESBLs菌株除对亚胺培南、美罗培南100%敏感,阿米卡星、左氧氟沙星耐药率分别为30.7%、28.8%外,其他头孢菌素、酶抑制剂的抗菌药物均表现较高耐药性。见表1。

讨论

本文对我院老年患者感染的182株肺炎克雷伯菌产质粒型AmpC酶及ESBLs进行检测,共检出产酶菌株117株,检出率为64.3%,其中单产ESBLs63株,单产AmpC酶32株,一并产ESBLs和AmpC酶22株,检出率分别为34.6%、17.6%和12.1%,均比国内的文献报道高[1,4]。这可能与我院患者年龄偏高、免疫功能低下、病种特殊、住院周期长和过多使用广谱抗生素等有关。

本文表1结果凸显:产AmpC酶肺炎克雷伯菌对大部分抗生素耐药情况十分惊人。其中,对第三代头孢菌素表现出高度耐药,耐药率高达74%～100%;头孢吡肟为43.2%、头孢哌酮/舒巴坦为29.9%。而阿米卡星、左氧氟沙星的耐药率仅为16.4%、10.1%。但所有产AmpC酶菌株对亚胺培南、美罗培南仍然100%敏感。因此,对于产AmpC酶肺炎克雷伯菌引起的感染,临床不应使用第三或四代头孢菌素及酶抑制剂,可选用碳青霉烯类药物进行治疗。而产ESBLs肺炎克雷伯菌对酶抑制剂哌拉西林/他巴唑、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为49.1%、41.8%,这与胡军的产ESBLs株对β内酰胺酶抑制剂与抗生素复合制剂敏感率较高,如对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦敏感率多在70%以上的报道[1]存在差异。这可能与不同地区和不同医院产ESBLs菌株的流行耐药基因型有一定的差异有关。结果提示:所有产ESBLs菌株对亚胺培南、美罗培南100%敏感。临床医生可考虑选用碳青霉烯类抗生素。

在不同的地区和医院,细菌流行病学不同,各种抗生素的抗菌谱也有差异。老年人免疫功能下降,合并多种慢性疾病,经常预防性使用广谱抗生素等,使老年人感染产AmpC酶与ESBLs菌株的耐药性不断变化。因此,应切实加强对其监测,科学合理使用抗生素,使抗生素在老年人的感染治疗中发挥更重要的作用。

参考文献

[1]胡军.老年病医院产AmpC酶及ESBLs酶肺炎克雷伯菌检测结果分析[J].中国医药指南,2009,7(23):129-130.

[2]叶应妩,王疏三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006:744-745.

[3]赵虎,孔宪涛.AmpC内酰胺酶的检测[J].中华检验医学杂志,2003,6(26):6.

[4]卢艳萍.下呼吸道标本肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶的检测及耐药分析[J].海峡药学,2009,21(4):110-112.

(收稿日期:2010-06-10 修回日期:2010-08-26)

耐药性检测 第4篇

1资料与方法

1.1 菌株来源

选取2012年1～12月从我院门、急诊与住院患者分离、培养出的肺炎链球菌223株。菌株来源:痰或咽拭子标本192株 (86.10%) , 血液标本27株 (12.11%) , 引流液或脓汁3株 (1.34%) 。所有菌株均经微生物分析仪鉴定确认, 使用肺炎链球菌ATCC49619作为质控菌株。

1.2 试剂与仪器

哥伦比亚血琼脂基础培养基 (英国OXOID公司) 加5%脱纤维羊血作为试验用培养基, HF-90型CO2恒温培养箱 (中国上海力申公司) , Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏分析系统 (美国BD公司) 。

1.3 检测方法

采用K-B纸片扩散法进行药敏试验, 菌液浓度为0.5麦氏单位, 使用含有5%脱纤维绵羊血M-H培养基 (英国OXOID公司) 。严格按照2005年美国临床实验室标准化协会 (NCCLS) 制定的抗微生物敏感试验的标准进行操作[3]。质量控制采用质控菌株ATCC49619。

2结果

223株肺炎链球菌对万古霉素全部敏感, 无耐药菌株;而对其他常见抗菌药物均有不同的耐药率。223株肺炎链球菌对抗菌药物的耐药率由大到小排列依次为:红霉素、四环素、克林霉素、苯唑西林、氯霉素、左氧氟沙星。见表1。

3讨论

肺炎链球菌感染可导致呼吸道感染、鼻窦炎、中耳炎等疾病。有文献报道, 临床中感染肺炎链球菌的主要是老年和儿童患者[4], 这是由于老年人群与儿童的免疫功能较低, 易受到肺炎链球菌的感染和侵袭。临床中治疗感染性疾病时, 通常首先选用毒性较低的β-内酰胺类抗菌药物, 尤其在儿科中使用较为广泛。广谱抗菌药物的广泛使用, 会造成肺炎链球菌对抗菌药物产生一定的耐药性。因此, 对抗菌药物的合理、规范使用成为当前临床工作中的重点之一。本文结果显示:223株肺炎链球菌对左氧氟沙星的耐药率仅为5.83%, 对氯霉素的耐药率为15.69%, 对万古霉素无耐药菌株发现;而肺炎链球菌对红霉素、四环素、克林霉素的耐药率较大, 均超过50%, 这与相关文献[5]报道的结果类似。肺炎链球菌对红霉素耐药率较高与大环内酯类抗菌药物的大量应用有关联, 产生耐药性的主要分子生物学机制为:mefA耐药决定因子与低水平大内环酯类耐药有关, ermB基因与高水平大环内酯类耐药有关[6]。

综上所述, 目前我院肺炎链球菌耐药状况不容乐观, 左氧氟沙星、氯霉素、万古霉素等药物仍表现出较佳的抗菌活性, 因此可将喹诺酮类抗菌药物作为肺炎链球菌感染的临床经验治疗首选药物, 对于儿童患者仍首选β-内酰胺类抗菌药物, 而万古霉素一般用于重症患者。此外, 在今后的临床工作中应做好肺炎链球菌培养与药敏试验, 并根据药敏试验结果合理选择抗菌药物, 尽量减少经验性用药。

摘要：目的 了解本地区肺炎链球菌对临床常用抗菌药物的耐药性。方法 对分离培养的肺炎链球菌223株进行药敏试验, 分析其对常见抗菌药物的耐药性。结果 223株肺炎链球菌对万古霉素全部敏感, 无耐药菌株;而对其他常见抗菌药物均有不同的耐药率。223株肺炎链球菌对抗菌药物的耐药率由大到小排列依次为:红霉素、四环素、克林霉素、苯唑西林、氯霉素、左氧氟沙星。结论 可将喹诺酮类抗菌药物作为肺炎链球菌感染的临床经验治疗首选药物。应做好肺炎链球菌的培养与药敏试验, 并根据药敏试验结果合理选择抗菌药物。

关键词：肺炎链球菌,耐药性,药敏试验,检验,感染

参考文献

[1]黄卫青, 赵自云, 马艳辉, 等.青岛地区部分医院2005-2008年肺炎链球菌的耐药性分析[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2009, 29 (11) :1014-1016.

[2]董一山, 黄文祥, 章成, 等.重庆地区临床分离肺炎链球菌血清型及耐药分析基因多态性[J].中国抗生素杂志, 2010, 35 (1) :59-64.

[3]罗圆, 怀扬, 余宏杰.发展中国家侵袭性肺炎链球菌病监测研究进展[J].中华流行病学杂志, 2010, 31 (7) , 816-819.

[4]杨启文, 徐英春, 谢秀丽, 等.全国10所医院院内与社区感染常见病原菌耐药性分析[J].中华医院感染学杂志, 2009, 19 (9) , 1133.

[5]吴金英, 李少君, 徐新波, 等.肺炎链球菌对大环内酯类抗菌药物耐药机制的研究[J].中华医院感染学杂志, 2008, 18 (12) :1681-1683.

猪源大肠杆菌耐药性的检测与分析 第5篇

1 材料

1. 1 菌株

药敏质控 菌株大肠 杆菌 ( 菌株编号 为ATCC25922) ,购自中国兽医药品监察所; 50株猪源大肠杆菌,来自于福建省龙岩地区不同猪场。

1. 2 培养基

伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、普通琼脂培养基、水解酪蛋白琼脂培养基,杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1. 3 药敏纸片

共23种药敏纸片,包括氨苄西林( AMP) 、阿莫西林/克拉维酸钾( AMC) 、氨曲南( ATM) 、庆大霉素( CN) 、卡那霉素( KAN) 、氟哌酸( NOR) 、环丙沙星( CIP) 、恩诺沙星 ( ENR) 、四环素 ( TE) 、多西环素( DO) 、复方新诺明( SXT) 、氟苯尼考( FFC) 、氯霉素( C) 、替加环素( TGC) 、美罗培南( MEM) 、多黏菌素E( CT) 、阿米卡星( AK) 、磺胺异噁唑( SF) 、头孢噻肟( CTX) 、安普霉素 ( APR) 、头孢噻吩( KF) 、氧氟沙星( OFX) 、头孢他啶( CAZ) ,购自杭州天和微生物试剂有限公司和OXIOD公司。

2 方法

2. 1 样本的采集

以灭菌棉签蘸取新鲜粪便或从饲养环境中采集,将样品放在灭菌的试管中,用冰瓶快速送到实验室。

2. 2 大肠杆菌的分离与鉴定

将样本接种于培养基上。在伊红美蓝琼脂平板上,形成具有金属光泽的紫黑色菌落。在麦康凯琼脂平板上,形成中等大小、表面光滑、湿润的粉红色菌落。在营养琼脂平板上,形成灰白色、半透明、圆形、凸起、湿润、边缘整齐的中等大小菌落。涂片染色镜检可见,两端钝圆、多数散在排列的革兰阴性杆菌。将其接种到微量生化发酵管中进行生化试验,根据生化特性鉴定分离的细菌是否为大肠杆菌。

2. 3 药敏试验

采用WHO推荐的Kirby - Bauer法[2]进行药敏试验。依据CLSI相关标准,每次测定均以质控菌作为对照,只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效。用游标卡尺量取抑菌圈直径,计算平均值。

2. 4 判定标准

按照Kirby - Bauer法[2]中的标准判定各菌株的敏感度,以敏感( S) 、中介( I) 、耐药( R) 3种形式对抑菌圈大小作出判定。

3 结果与分析

3. 1 大肠杆菌耐药性的测定结果

50株猪源大肠杆菌对23种药物均有不同程度的耐药性。猪源大肠杆菌各分离菌株对各种抗生素的敏感性不同。对四环素、多西环素高度耐药,耐药率为100% ; 对氨苄西林、氟苯尼考、氯霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑的耐药率也均在90% 以上; 对美罗培南、阿米卡星的敏感率在80% 以上。猪源大肠杆菌对23种药物的体外药敏试验结果见图1。

AMC. 阿莫西林 / 克拉维酸钾; AMP. 氨苄西林; ATM. 氨曲南; KAN. 卡那霉素; TE. 四环素; CIP. 环丙沙星; FFC. 氟苯尼考; CN. 庆大霉素; C. 氯霉素; TGC. 替加环素; MEM. 美罗培南; SXT. 复方新诺明; CT. 多黏菌素E; NOR. 氟哌酸; AK. 阿米卡星; SF. 磺胺异噁唑; CTX. 头孢噻肟; APR. 安普霉素; DO. 多西环素; KF. 头孢噻吩; OFX. 氧氟沙星; ENR. 恩诺沙星; CAZ. 头孢他啶。

3. 2 大肠杆菌重耐药性的测定结果

50株猪源大肠杆菌对23种药物存在不同程度的耐药现象。11耐菌株所占比例为20% ,13耐和15耐菌株所占比例为12% ,猪源大肠杆菌的多重耐药性测定结果见图2。

3. 3 大肠杆菌耐药类型的测定结果

在50株猪源大肠杆菌中,共有25种耐药类型,较为普遍的耐药类型是AMP - APR - KAN - TET -CIP - FFC - C - SXT - CT - SF - DO,猪源大肠杆菌耐药类型的测定结果见表1。

4 讨论

大肠杆菌作为肠道常在菌,在条件变差及其他病原感染后易继发致病,在实际生产中疫苗预防和药物防治效果并不理想[3]。目前,我国畜禽大肠杆菌的耐药性严重且复杂,对大多数抗菌药物都已产生了耐药性,甚至产生多重耐药性。20世纪60年代有报道显示,大肠杆菌分离菌株对四环素类、大环内酯类抗生素产生了耐药。徐小艳等[4]对1975—2002年大肠杆菌耐药性变化情况的调查显示,20世纪90年代所分离的致病性大肠杆菌对抗生素耐药的菌株比例逐渐上升,对抗生素敏感的菌株比例呈下降趋势。

从本研究结果可以看出,分离自福建省龙岩地区的猪源大肠杆菌对试验所采用的23种药物均有不同程度的耐药性,其中最少的耐药为2种,最多的耐药为18种。同时还可以看出,猪源大肠杆菌各分离菌株对各种药物的敏感性不同。对四环素、多西环素高度耐药,耐药率为100% ; 对氨苄西林、氟苯尼考、氯霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑的耐药率均在90% 以上; 对美罗培南、阿米卡星敏感率在80% 以上。福建省龙岩地区耐药现象的存在给该地区大肠杆菌病的药物防治提出了新的课题; 因此,应定期对菌株进行抗生素敏感性监测。临床用药或在饲料中添加药物时,尽量不要长期大量使用同几种药物,以免影响临床治疗效果及细菌耐药性的产生和扩散。

摘要：为了对福建省龙岩地区猪源大肠杆菌进行分离培养,开展大肠杆菌耐药性调查,试验采用纸片扩散法测定了各分离菌株对23种抗生素的敏感性。结果表明:大肠杆菌分离菌株对四环素、多西环素高度耐药,耐药率为100%;对氨苄西林、氟苯尼考、氯霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑的耐药率也均在90%以上;对美罗培南、阿米卡星敏感率在80%以上。说明福建省龙岩地区猪源大肠杆菌分离菌株对各抗生素的敏感性不同。

耐药性检测 第6篇

选取本院2014年1月1日~12月31日微生物实验室共收到的7138份标本, 分离出2149株病原菌, 阳性率为30.1%。本年度的标本总量比上年度增长了45.9%, 检测出的细菌总株数比上年度增长了13.6%。

2 结果

2.1 培养生长的2149株细菌标本主要分布及检出率, 见表1。

2.2 检出的不同部位主要病原体菌群分布情况, 见表2。

2.3 G阴性杆菌对临床常用药物的耐药情况 (耐药率%) , 见表3。

2.4 G阳性球菌对临床常用药物的耐药情况 (耐药率%) , 见表4。

3 讨论

3.1从以上数据来看, 今年接种标本较往年明显增多, 以痰、血、尿、烧伤分泌物为主, 比上年度增长明显的标本为分泌物和血液, 血液送检率增高, 主要送检科室是重症医学科和儿科二病区。而阳性率较高的标本为胆汁、静脉导管、尿、分泌物。其他如大便、脑脊液等标本阳性率较低。

3.2从今年所检测的病原菌来看, 仍以G阴性杆菌为主, 共1603株, 占总病原菌的74.6%, 与去年基本相同。G阳性球菌共316株, 占18.9%, 比去年增长了2.2个百分点。真菌共检测139株, 比例为6.47%, 比去年减低了2.09个百分点。检测部位以下呼吸道和泌尿道为主, 下呼吸道检测出1063株, 占总数的49.5%。检测的细菌中, 分布前10位的是, 铜绿假单胞菌 (430株) , 克雷伯菌 (356株) 大肠埃希菌 (293株) , 不动杆菌属 (189株) , 金黄色葡萄球菌 (153株) , 真菌 (139株) , 凝固酶阴性葡萄球菌 (121株) 、肠球菌 (92株) 肠杆菌属 (87株) 及变形杆菌 (82株) 。

3.3从检测的G阴杆菌对临床常用药物耐药的情况看, 铜绿假单胞菌对多粘菌素B、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南和头孢吡肟有较高的敏感率, 对亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率较上年度升高;大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南、美满霉素、哌拉西林/他唑巴坦、头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星显示有较好的敏感性, 除上述药物外, 克雷伯菌属对环丙沙星、左氧氟沙星也显示有较好的敏感性, 对其他药物均呈现较高的耐药性。而全年检测出165株铜绿假单胞对泰能耐药, 占总数的38.3%。不动杆菌属除对粘菌素、多粘菌素B、美满霉素和头孢哌酮/舒巴坦有较高敏感性外, 对其他药物均呈现较高的耐药性, 其对泰能的耐药率为51.6%。其他细菌均显示对泰能、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦有较好的敏感性。呋喃妥因对治疗尿路感染特别是大肠埃希菌感染敏感度较高。

检测出的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中产超广谱β-内酰胺酶分别是203株和126株, 各占69.3%和34.9%;大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶株所占比例与上年度相比均有所下降。

3.4检测出的金黄色葡萄球菌显示对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁有很好的敏感率, 耐药率均为0%, 而对青霉素、阿奇霉素、克林霉素、克拉霉素、红霉素、阿莫西林棒酸都有较高的耐药率。而凝固酶阴性的葡萄球菌同样显示对万古霉素、利奈唑胺、美满霉素、替考拉宁有较高的敏感性, 耐药率均为0%。而金黄色葡萄球菌中有92株是MRSA, 比率为60.1%, 较上年度略上升。检测的耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌MRCON有93株, 占76.9%, 较上年度下降。3.5

3.5检测出的肠球菌共92株, 较上年度略增加, 显示对万古霉素、替考拉宁、氯霉素有较高的敏感性, 而对其他药物均显示较高耐药率, 肠球菌85.2%是从泌尿道分离, 显示对呋喃妥因敏感度较上年度增加, 耐药率为37.5%。

大连地区猪源大肠杆菌耐药性检测 第7篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

生鲜销售地共采集了猪肉样品69个。包括猪五花肉, 后腿肉, 肥肉, 猪皮等主要销售样品。2012年11月在食用猪养殖场采集了猪饲料, 饮用水, 猪粪便等样品62个。

质控菌:Escherichia coli ATCC25922

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离和PCR鉴定

切采集的样品1~2g放进营养肉汤培养基里, 摇匀。放进摇床, 在37℃, 150rpm的转速下增菌16~18h。用25~30m L麦康凯培养基倒平板, 接种环沾菌液后在平板上Z形划线, 放进37℃恒温隔热培养箱, 培养24h。将红色或粉红色不透明单菌落放进营养肉汤进行纯培养。用煮沸法制备PCR模板。设定PCR反应程序:94℃预变性4min;94℃变性1min, 60℃退火, 72℃延伸1min, 30个循环;72℃延伸7min, 4℃保存。PCR产物经电泳鉴定。

1.2.2 大肠杆菌药敏试验

(1) 菌液制备 用营养肉汤稀释被复苏的保存菌液, 用分光光度计测量稀释菌液达到OD600=0.4~0.5。再按1:100稀释菌液至含菌量约为1106CFU/m L, 备用。

(2) 微量稀释法测MICs 将全部抗生素配为5120μg/m L的储存液存放在冰箱中待用。将储备药液分别稀释至256μg/m L的工作液。在无菌的96孔聚苯乙烯U型微量板内用排枪每孔加营养肉汤100μL, 256μg/m L的工作液100μL加在第一排, 混匀, 再把第一列的混合液吸100μL加在第二列, 以此类推同样方法操作至第12个孔, 最后第12孔的混合液吸100μL弃去。第一板1~8号药品, 第二板9~15号药品, 最后一排的前6孔加菌液作为阳性对照, 后6孔空白营养肉汤作为阴性对照, 以Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli ATCC35218作为质控。孔板加完药品后加盖标注样品号和药品号放进培养箱, 37℃培养16h后观察结果。

(3) 药敏试验判定标准 当阳性对照组细菌明显生长, 阴性对照组无细菌生长时, 以实验组小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC值, 即小孔内溶液不变混浊所对应的最低药物浓度。当出现单一跳孔时, 记录抑制细菌生长的最高药物浓度, 如多次出现跳孔现象, 则不记录结果, 需重新进行试验。

2 结果与分析

从样品中共分离到了69株菌, 经过PCR检测后61株为大肠杆菌, 占市场总样品数的88%。屠宰场样品中分离到了62株菌, 其中56株为大肠杆菌, 占总样品数的90%。

2.1 受试大肠杆菌耐药性分析

通过药敏试验发现大肠杆菌分离株对盐酸环丙沙星抗菌性最高, 达52株, 占受试菌株的88.5%, 其次为硫氰酸红霉素 (85.3%) , 土霉素 (83.6%) , 硫酸庆大霉素 (78.7%) , 阿莫西林 (78.7%) , 磺胺间甲嘧啶钠 (78.7%) , 硫酸黏菌素 (75.5%) , 烟酸诺氟沙星 (68.8%) , 恩诺沙星 (65.6%) , 硫酸新霉素 (65.6%) , 乙酰甲喹 (62.3%) , 乳酸环丙沙星 (57.4%) 等具有耐药菌株分别51株, 48株, 48株, 48株, 46株, 42株, 40株, 40株, 38株, 35株, 耐受率均超过50%, 受试菌株对盐酸多西环素最为敏感, 耐药菌株仅有13株占受试菌株的21.3%, 其次比较敏感的是盐酸沙拉沙星耐药菌株有22个占总受试菌株的36.1%, 其次是氟苯尼考 (45.9%) 。

2.2 多重耐药性的分析

大肠杆菌的多重耐药谱:全部61株受试菌株均表现为多重耐药, 至少是5重耐药, 最多重数是13重。其中10重耐药菌株最多, 占全部菌株的29.8%, 其次为12重 (22.9%) , 11重 (9.8%) , 7重 (9.8%) , 13重 (8.2%) , 6重 (6.5%) , 9重 (4.9%) , 8重 (4.9%) , 5重 (3.2%) 。13重耐药有3种耐药谱;12重耐药有5种;11重耐药有3种;10重耐药有8种;9重耐药1种;8重耐药3种;7重耐药4种;6重耐药1种;5重耐药1种。其中12重耐药中FLO-NEO-AMO-NOR-ERY-SOL-C/L-COL-TER-ENR-CIP-EMQ最常见, 共有5株 (8.2%) 菌株表现为此耐药谱。

目前, 细菌的耐药现象己经十分严重, 并有逐年上升趋势, 导致临床治疗效果差、治疗时间延长、死亡率和临床发生率增加、治疗费用上涨。细菌耐药菌株的传播和多重耐药菌株的出现, 是导致各类传染病治愈受限的主要原因之一。

本研究对61株大肠杆菌进行了15种抗生素的耐药性分析。结果这些菌对15种抗生素的耐药性均在20%以上。最高达到88.5%, 是对盐酸环丙沙星, 耐药性最小21.3%, 是对盐酸多西环素。

由此来看, 大连猪源大肠杆菌的耐药性明显提高, 致使许多养殖场越来越增加药品的用量。我国尚未建立完善的抗生素管理体系, 这样的恶循环不断出现, 滥用抗生素的行为导致细菌的耐药性会越来越高, 经济损失也将越来越大。

现如今, 提倡合理使用抗生素, 联合用药, 交叉用药或者研发新型抗生素, 进一步研究大肠杆菌的耐药机制和耐药谱, 方可实现对其耐药性的有效控制。

摘要：目的 为了对环境污染程度和生鲜食品的大肠杆菌污染情况进行调查。方法 以人们最常使用的肉类食品猪肉为对象, 在生鲜销售市场等共采集了69个样品, 屠宰场共采集62个样品, 通过大肠杆菌的分离及PCR鉴定技术, 88%鉴定为大肠杆菌, 屠宰样品90%鉴定为大肠杆菌。并对来源于销售猪肉的61株大肠杆菌进行15种抗生素药敏性试验。结果 销售猪肉及屠宰场的大肠杆菌污染很严重, 销售猪肉中大肠杆菌的耐药性非常高。

细菌耐药分析及耐药酶的检测探讨 第8篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2008年3月至2011年3月院门诊与住院部收治患者所取得的2650例细菌血培养标本, 其中分离出菌株为610株。

1.2 仪器与材料

铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌够买自福建迈新生物技术开发公司;血培养仪和相关配套培养瓶、哥伦比亚琼脂及M-H琼脂提供自法国生物梅里埃公司;真菌药敏试剂盒购买自温州康泰生物科技有限公司;药敏纸片购买自广州市乐通泰生物科技有限公司。

1.3 实验方法

根据患者病情, 科室采集标本进行无菌操作。其中, 对儿童的采血量为3～5mL, 对成人的采血量为5～10mL, 分别将采得血液注入儿童瓶与成人瓶, 并迅速送往微生物室放置进全自动血培养仪中。当仪器提示阳性, 转种培养有细菌生长为阳性, 当仪器提示阴性, 标本培养五天盲转。实验所有菌株全部采用API鉴定系统鉴定, 细菌使用K-B法药敏, 根据NCCLS2000年的判断标准进行结果判定。“中介”具有统计学意义。

2 结果

2650例血培养中, 阳性标本610例, 阳性率为23.0%。其中革兰阳性球菌403株 (66.1%) , 革兰阴性杆菌17株 (29.0%) , 真菌19株 (3.1%) , 革兰阳性杆菌6株 (0.98%) 。主要病原菌有凝固酶阴性葡萄球菌226株, 约占37.0%;大肠埃希菌104株, 占17.4%;金黄色葡萄球菌91株, 占14.9%;肠球菌61株, 占10%;肺炎克雷伯菌21株, 占3.4%。革兰阳性球菌药敏试验结果, 见表1。革兰阴性杆菌对哌拉西林、头孢噻肟、氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林等耐药率高;真菌对于两性霉素B、制霉菌素、5-氟胞嘧啶具有较高敏感性, 对于伊曲康唑、咪康唑、氟康唑益康唑具有较高耐药率, 见表1。

3 讨论

本组数据表明, 血培养阳性菌株中, 凝固酶阴性葡萄球菌较多, 占比37.0%, 大肠埃希菌次之, 占比17.4%。随着抗生素在临床上的广泛应用, 细菌耐药率日渐高涨, 尤其是H L G R、M R S A、产E S B L s、M R C N S为代表的革兰阴性杆菌耐药问题, 这些问题并应引起足够重视。临床感染性疾病恶化甚至死亡的一大重要原因就是败血症与菌血症的产生, 提高对病原菌的检测水平, 以及合理使用抗生素是临床感染性疾病治疗的关键性因素。实践数据表明, 加强对血培养的监测, 并根据细菌药敏结果科学合理地选用抗生素, 对减少和延缓耐药菌株的产生具有及其重要的临床作用。

参考文献

[1]冯瑞华, 李志强, 赵希玲.我院2009年关于病原菌检测及抗菌药物耐药性分析[J].医护论坛, 2011, 8 (11) :172～173.

[2]叶惠芬, 李红玉, 赖福才, 等.广州地区菌血症常见病原菌及耐药性调查[J].中华医院感染学杂志, 2002, 12 (9) :707～708.

[3]邓丽华, 胡丽萍, 许美荣.血培养常见病原菌分布和耐药性分析[J].徐州医学院学报, 2006, 26 (2) :181～183.

耐药性检测 第9篇

1.1 菌株

试验用31株鸭疫里默氏杆菌均为2008~2013年本实验室自济宁市各养殖场出现典型浆膜炎病变的病死鸭心脏、肝脏分离所得, 经纯化培养、鉴定后由本实验室冻干保存。

1.2 药敏纸片

呋喃妥因批号130517, 氧氟沙星批号130517, 阿米卡星批号130512, 庆大霉素批号130517, 链霉素批号130514, 四环素批号130517, 氯霉素批号130512, 环丙沙星批号130517, 头孢曲松批号130517, 卡那霉素批号130514, 等12种药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。-20℃保存备用。

1.3 培养基

马丁肉汤:本实验室制作

马丁琼脂:本实验室制作

1.4 主要仪器设备

PYX-DHS型生化培养箱 (上海跃进医疗器械一厂)

超净工作台 (Froma Scientific)

HZQ-C空气浴振荡器 (哈尔滨市东明医疗器械厂)

紫外可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)

台式电子天平 (北京赛多利斯ACCULAB)

2 方法

2.1 细菌的培养、计数

自-80℃超低温冰箱中冻存的鸭疫里默氏杆菌菌种中钩取少许, 划线接种于马丁琼脂平板上, 37℃蜡烛缸中厌氧培养24h, 挑取单个菌落继续划线接种于马丁琼脂平板上, 连续传3代进行纯化培养。挑取纯化培养好的单个菌落接种到10支盛有2m L马丁肉汤的试管中, 37℃振荡培养, 分别在3、5、7、9、11、13、15、17、19、21h后, 无菌吸取菌液测定OD600值。将已测定OD600值的菌液分别做10倍系列稀释, 进行细菌计数。根据National committee for Clinical Laborary Standays (NCCLS) , 找出对鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验的最合适的OD600值。

2.2 纸片扩散法药敏试验

按世界卫生组织 (WHO) 推荐的Kirby-Baure法进行。将在马丁琼脂平板上培养过夜的单个菌落接种到2m L马丁肉汤液体培养基中, 37℃振荡培养, 测其OD600值, 选取OD600值为0.149~0.185时进行药敏试验。吸取200μL上述菌液, 无菌、均匀涂于马丁琼脂平板上, 室温放置3~5min至菌液基本干燥, 然后在每个平板内均匀安放5个不同的药敏纸片, 倒置于37℃烛缸中培养12h后观察记录结果。

2.3 药敏纸片敏感度判定标准

参照NCCLs (2006) 公布的标准以敏感 (susceptible) 、中敏 (intermediate) 和耐药 (Resistant) 3种形式对抑菌圈大小进行解释。个别标准中没有列出的药物, 按杭州微生物试剂有限公司提供的标准进行解释。

3 结果

3.1 细菌的培养与计数

经纯化培养后的菌落大小、形态比较一致, 均为表面光滑、透明、馒头状、直径约为0.5~1mm的圆形菌落。通过在不同培养时间取样测定OD600值和进行细菌计数发现 (表1) , 该菌在培养3~13h之间, 繁殖速度最快, 呈直线上升状态。随后, 细菌繁殖速度明显放慢, 呈平缓过程, 但在培养到21h时, 细菌活菌数最高可达4.1109CFU/m L。因此, 我们把OD600值为0.149~0.185定为对该菌进行药敏试验的最合适浓度。

3.2 药敏试验结果

31株鸭疫里默氏杆菌对12种抗生素都有不同程度的耐药性。氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、氯霉素、环丙沙星和卡那霉素的耐药率较高, 而对于呋喃妥因、阿米卡星的敏感性较高。具体的统计数据见表1。

分离到的鸭疫里默氏杆菌产生耐药性的药物依次是卡那霉素、四环素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星, 这5种药物的耐药性都大于48.4%, 耐药性最严重的是四环素, 耐药率为71.0%;最敏感的药物依次为阿米卡星、呋喃妥因、庆大霉素, 其敏感率都达到了70%以上。