酶检测法范文

酶检测法范文（精选12篇）

酶检测法 第1篇

检测使用的材料和设备

扩张青霉菌脂肪酶、橄榄油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、乙酸对硝基苯酚酯和辛酸对硝基苯酚酯、聚乙烯醇等。

具体采用的设备有恒温水浴摇床、高速捣碎机、超声发声仪器、滴定电极及光度计。

检测方法比较

抽提酶的具体方法

准备检测所需数量的酶粉经过甘氨酸缓冲液实施溶解, 使用玻璃棒实施研碎, 在低温环境下静止放置, 将上清液全部放到容量瓶中, 可以把一定量的缓冲液与沉淀部分混合, 如此反复实施冲洗, 直至在容量瓶中放置所有的上清液, 同时实行定容, 摇晃均匀准备接下来使用。

制备底物乳化液

▲聚乙烯醇溶液

称取40 g聚乙烯醇, 添加800m L, 0.04 mol/Lp H9.4的甘氨酸缓冲液, 70~80℃溶解, 保持1 h温度之后进行冷却处理, 视情况进行过滤, 定容到100 m L。

▲制备乳化液

第一次制作乳化液选择高速捣碎机。将4%PVA溶液100 m L和底物混合, 可以在冰箱中静置5~10℃保持1~2 h, 随后向捣碎机转移, 这样操作9 min 3次, 乳化液可以保存在冰箱中, 在之后的每一次使用时重新实施乳化。

第二可以选择乳化液初步选择超声波制作方式, 充分混合4%PVA溶液100 m L和底物。将冰箱设置为5~10℃静止放置1~2 h, 在底部溶液中放置超声发生器变幅杆, 通过间歇方式, 在规定的功率下严格实施超声乳化处理, 在对底物乳化温度控制时可以考虑使用水浴, 在冰箱中储存乳化液, 再一次应用时需要重新实施乳化。

检测脂肪酶活力的方法

▲抽提正己烷方法

在甘氨酸缓冲液中放置1 m L橄榄油, 添加规定数量的酶液在37℃的情况下反应10 min, 利用乙醇-丙酮终止反应, 混合10 m L水饱和正己烷抽取产生脂肪酸, 将上层2.5 m L干燥的酚酞放置在锥形瓶中并且和乙醇溶液定形产生脂肪酸。当发生上述反应时, 认真定位每分钟催化形成的脂肪酸的酶量单位。

▲酸碱直接滴定法

将4 m L甘氨酸缓冲液和底物乳化液分别放置在三角瓶中, 并且在37℃水浴中放置5 min, 随后将1 m L酶液准确倒入, 保持10 min的温度, 立即加入乙醇直到反应停止, 在滴定之前可以采取水进行稀释。通过0.05 mol/LNa OH滴定水解产生游离的脂肪酸, 利用PH电极指示滴定终点。

▲光谱检测法

将硝基苯乙酯与乙腈相溶, 仅制作了2.5 mol/m L对硝基苯乙酯溶液。称量了2.75 m L通过一定温度进行保温的p H 9.4胺氨酸缓冲液, 添加200μl于90℃加热灭活20 min的酶液。再加入底物, 检测底物自从分解形成对硝基苯乙酯变化曲线, 相同情况下添加适当稀释的酶液。

结果分析

底物影响脂肪酶活力稳定性的情况

检测脂肪酶活力可以采用三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、橄榄油、乙酸对硝基苯酚酯与辛酸对硝基苯酚酯作为底物。由于存在着不同的检测原理, 可以分别对比这些底物。

通过对比可知, 辛酸对硝基苯酚酯拥有很快的水解速度, 因此, 对脂肪酶活力检测时, 会产生一定的误差。而乙酸对硝基苯酚酯拥有较为缓慢的水解速度, 实验误差相对较小。上述两种物质并非天然脂肪酶的底物, 一般也并不适合应用到脂肪酶活力检测过程中, 此外把乙酸对硝基苯酚酯作为底物, 对比来讲可以获得较为科学的检测活力。该物质具体应用在脂肪酶筛选或较小酶量的脂肪酸检测。另外, 由于该物质成本较高, 国内很少有人应用。

当底物是三丁酸甘油酯和三油酸油脂时, 可以得到比较稳定的脂肪酶活力检测结果;当橄榄油作为底物时, 检测结果误差依然比较大。可是因为这两种物质全部属于进口的脂肪酶底物, 成本相对较高。相对来讲, 国产橄榄油成本低廉, 可以将其作为反应底物。

乳化方法影响脂肪酶活力稳定性的情况

为了充分表现出脂肪酶的功能, 反应界面必须实现最大化, 一般利用搅拌与震荡通常会产生短期的不稳定乳化形态, 油珠无法获得所需的表面积, 与此同时也会出现很差的重复性。经过对乳化剂的持续加入, 同时搭配不断地搅拌与震荡和超声处理等, 能有效分散油的微粒形态, 形成的乳化剂也会拥有很好的稳定性。这样做的目的就是避免实验形成误差, 提升了检查脂肪酸活力的稳定程度。在检测脂肪酶活力的过程中, 采取橄榄油作为底物时, 结果一般缺乏稳定性, 具体原因便是乳化方法缺少科学性。

通过研究表明, 采取了乳化处理的稳定性显著比不采取乳化处理的要高, 乳化经过超声处理之后效果显著优于通过搅碎机搅拌的效果。此外, 乳化处理底物之后脂肪酶活力很显然好于乳化处理前。

检测方法影响脂肪酶活力稳定性

检测过程中将底物设置为橄榄油, 一般可以选择酸碱滴定作为检测方法, 也可以选择脂肪酸与铜离子产生的铜皂检测脂肪酶活力, 这一方法被称为分光光度法, 可是因为实验需要萃取的铜皂数量庞大, 污染问题很大并且危害人身安全, 所以很少人采取这个方法。在酸碱滴定法的应用过程中, 建议利用直接滴定, 此外, 采取疏水有机溶剂对脂肪酶活力进行检测时, 在实施滴定。由于缓冲液起到缓冲作用, 导致人们开始质疑是否需要采取直接滴定法。

而正己烷抽提法与直接酸碱滴定法比较, 前者的稳定性更好, 但是若比较脂肪酶水解活力则后者要好。因此检测脂肪酶水解活力较为适当的方法是正己烷抽提法。

结语

检测水中有机磷农药的酶传感器 第2篇

检测水中有机磷农药的酶传感器

摘要：采用丝网印刷技术制作厚膜型电极,通过交联法将乙酰胆碱酯酶固定在电极上,开发快速检测水中有机磷农药的酶传感器.采用循环伏安法对电极所做的检测结果表明电极彼此间的差异在10%以内,具有较好的一致性.通过在交联剂、酶和底物等方面优化传感器的工作参数,确定了戊二醛、酶和底物的浓度分别为0.2%、0.5 mg/mL和10 mmol/L时,传感器响应最好.在交联固定酶的情况下,根据酶活受到有机磷抑制的原理,采用时间-电流法对特丁硫磷和对硫磷进行了检测.结果表明:这2种有机磷的.检测限都可以达到1 ng/mL,线性区间1～10 000ng/mL.在物理吸附固定酶的情况下,采用循环伏安法对特丁硫磷进行了检测.结果表明:采用循环伏安法检测的灵敏度比采用时间-电流法的灵敏度要高.作 者：陈向强 何苗 蔡强 朱仕坤 施汉昌 CHEN Xiang-qiang HE Miao CAI Qiang ZHU Shi-kun SHI Han-chang 作者单位：清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京,100084期 刊：环境科学 ISTICPKU Journal：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE年，卷(期)：,27(8)分类号：X859关键词：酶生物传感器 丝网印刷电极 乙酰胆碱酯酶 有机磷农药

酶检测法 第3篇

关键词：阿维菌素类药物 酶联免疫法 快速检测

中图分类号：S854文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）14-0019-04

Abstract： The method of enzyme-linked immune-sorbent assay （ELISA） was used to detect the residues of AVMs in food. The judgment of positive and negative were the same when using ELISA and HPLC to detect the samples. The ELISA method was sensitive with high repeatability and specificity， and suitable for detecting AVMs residues in food.

Key Words： AVMs enzyme-linked immune-sorbent assay（ELISA） quick-tested

食品行業是一个关系到人们健康的敏感行业，食品安全问题引起了全社会前所未有的关注。尽管科技进步显著降低了疾病对人类的危害，但随着新型农药、兽药的大量使用，农、兽药残留仍然是人类健康的威胁之一。阿维菌素（Avermectins）是一种应用广泛使用的杀虫、杀螨剂，是一种具有十六元环结构的大环内酯类抗生素。由于其具有高效、广谱、低残留、相对安全等特点，一直被广泛用于农药和畜牧业中。目前，主要采用仪器检测对农畜牧产品中的阿维菌素药物残留进行检测控制，但仪器设备及试剂较昂贵、耗费长、需配备专业的检测人员，不便于现场检测，给检测造成了很大的困难。

本研究在何方洋[1]已经成功研制出阿维菌素抗原及单克隆抗体的基础上，自制阿维菌素抗原和阿维菌素单克隆抗体，以酶标记后采用间接竞争ELISA试剂盒原理制作出快速检测试剂盒，以满足灵敏度高、成本低廉及检测及时的筛查工作。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

阿维菌素标准品购自北京标准物质研究中心；牛血清白蛋白（BSA）、氯化钠、磷酸盐等均购自北京百欣试剂公司；酶标仪（最大量程为4.0）上海雷勃分析仪器有限公司；涡旋仪、均质器湖南湘立科学仪器有限公司；牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVASigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗美国Jackson公司；底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化氢，B液为四甲基联苯胺；2%氯化钠溶液、洗涤液、封闭液、终止液；实验室自制。

1.2 实验方法

1.2.1 AVM抗原的制备

AVM抗原的制备参照朱蓓蕾[2]等人的方法。

1.2.2 AVM单克隆抗体制备及鉴定

（1）动物免疫方法。以AVM-BSA为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠（8～12周龄）。首次免疫每鼠用100g的AVM-BSA（以载体蛋白计）与等量FCA混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。二免和三免时，将FCA换成FICA，剂量和方法同首免。每次免疫间隔2周。融合前3天每只小鼠腹腔注入50gAVM-BSA进行加强免疫。

（2）免疫细胞培育。四免后第3天，无菌条件下取小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合（10：1）。融合剂为50%的PEG2000，静置2min，加入25ml无血清DMEM营养液，静置5min，8000g/min离心15分钟，用20mlDMEM营养液悬浮混匀，铺种于2块96孔细胞培养板（含饲养细胞），每孔100l。待细胞长至孔底的1/2～1/3时，阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。10～14天后，取细胞上清检测，计算阳性率。阳性率100%时，得到稳定的细胞株。

（3）单克隆抗体制备。采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将BALB/C小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后，再注入阳性细胞1×106个/只，10天后抽取腹水。离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。阳性细胞经过3次亚克隆，阳性率达100%，得到稳定分泌单克隆抗体的细胞。

（4）单克隆抗体的鉴定。经琼脂扩散沉淀试验、间接ELISA检测、染色体计数和SDS-PAGE电泳检测，确认该单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1，分子量为165.7KDa，染色体数目为89～94条，亲和常数为1.80×1010M-1。

（5）羊抗鼠抗抗体及酶标记抗抗体的制备。参照杨利国[3]等人的方法，以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体；再采用过碘酸钠法将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联，得到酶标记抗抗体。

1.2.3 试剂盒的制备

以100uL适宜稀释倍数的阿维菌素抗原稀释液包被96孔酶标板，37℃孵育2h，然后用洗涤液洗板3次，拍干，用150uL封闭液封闭，37℃孵育2h，取板后拍干。

1.2.4 阿维菌素类药物试剂盒配套试剂

96孔酶标板，标准品1～6（浓度为0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5ug/L）高浓度标准品（浓度为5mg/L），酶标二抗，抗体工作液（以最佳稀释浓度稀释的间克隆抗体），底物液A液，底物液B液，终止液，20×浓缩洗涤液，2×浓缩洗涤液。

1.2.5 样本前处理方法

nlc202309020217

本研究以鸡肉为样本，用均质器均质组织样本；称取3.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入9ml乙腈、3ml正己烷，用振荡器3000g振荡10min，15℃（59）离心5min；移取1ml下层液至10ml洁净干燥玻璃试管中，于50-60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动1min，超声波溶解10min，再用涡旋仪涡动1min。取出100μl溶解后的样本液，加入100μl复溶工作液，用涡旋仪涡动30s，混匀；取20μl用于分析。

1.2.6 试剂盒各技术参数的确定

分别对试剂盒的灵敏度、准确度、检测限、精密度、稳定性、交叉反应率进行试验，并将灵敏度、精密度和准确度与HPLC检测的灵敏度、精密度和准确度进行对比。

2 结果分析

2.1 最佳单克隆抗体浓度的确定

测定添加10μg/kg阿维菌素标准品的鸡肉样品OD450的结果见表1。

结果表明，抗体浓度为1×103時标准曲线扭曲变形相关参数无法计算，可以看出抗体浓度在4×104：1000倍稀释时，最大吸光值、回收率和50%抑制浓度均处于最佳状态。

2.2 最佳抗原包被浓度确定

由表中可见，随着包被浓度的降低，曲线的IC50值也在下降（即灵敏度在提高），AVM-OVA包被抗原3000倍稀释时，试剂盒IC50和最大吸光度值等技术指标均较好，6000倍稀释时试剂盒的吸光度值较低，因此选择3000倍的AVM-OVA稀释浓度进行包被。

上述一系列实验表明，阿维菌素ELISA检测方法的最适条件分别为：包被抗原液稀释倍数为3000，单克隆抗体液稀释倍数为40000，酶标二抗液稀释倍数为1000。

2.3 试剂盒灵敏度和检测限试验

该方法对鸡肉样本的检测限为1.5g/kg，对其它不同种类食品检测限略有不同。具体结果见表3。

2.4 样本精密度和准确度试验

以5、10、20mg/kg三个浓度的阿维菌素分别对鸡肉样品进行添加，用三批试剂盒进行测试（测试数据见表4）。

从表4可以得出，样品平均回收率在68.5%～92.6%之间；批内、批间相对标准偏差均小于15%。

2.5 试剂盒稳定性试验

当试剂盒存放在4℃时，经过12个月的测定，从生产之日起到第9个月，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度、阿维菌素添加回收率均在正常范围之内。到第12个月时检测结果发现标准吸光度值在0.6以下，试剂盒灵敏度有一定下降，阳性样本加以率也有下降趋势。

当试剂盒存放在37℃时，该试剂盒在37℃经7天的保存试验，OD值有所下降，但零标准吸光度值仍在0.9以上。回收率在73.4%-97.3%；标准品板内变异系数在10%以下。将试剂盒在37℃保存的条件下放置7天，（据唐伟国著[4]《医学验诊断试剂的制备与应用》介绍，试剂盒在37℃每稳定一天，可相当于4～10℃保存一个半月）进行老化试验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。

从以上研究可得出阿维菌素类药物多残留试剂盒可以在4℃至少保存6个月以上。

2.6 交叉反应率试验

阿维菌素抗体与麦迪霉素、螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素和四环素等非阿维菌素类药物的交叉反应率均小于1%，而与阿维菌素类药物的交叉反应率大，说明抗体特异性高。结果见表5。

2.7 与高效液相结果比较

2.7.1 灵敏度比较

用本试剂盒和仪器方法[6]分别测定了随机鸡肉样品共10份样品，结果如表6。

由于仪器方法的最低检测限为1g/kg，低于1g/kg的样品不能检出；用试剂盒方法检测鸡肉样品的最低检测限为1.5g/kg，按照试剂盒最低检测限1.5g/kg判定，低于1.5g/kg的，表示符号为“-”，高于1.5g/kg的，按照实际检测结果报告。从表可知，试剂盒的准确度与仪器检测结果相同，阴阳性符合率为100%。

2.7.2 精密度和准确度比较

同等条件下，分别按照高效液相色谱和自制试剂盒检测提供的方法，以5g/kg浓度对空白鸡肉进行阿维菌素添加回收试验，比较仪器检测方法和自制试剂盒检测方法的平均回收率和变异系数。自制试剂盒检测方法中，将添加样品在3块不同酶标板上测定，做4个平行，计算变异系数。结果见表7。

由表7可见，高效液相色谱检测方法以5g/kg浓度添加，平均回收率为82.0%，变异系数为7.0%。自制试剂盒以5g/kg浓度添加时，平均回收率在73.4%～78.0%之间，批内、批间变异系数均小于15%，自研试剂盒适于实际样品的检测。

3 讨论

我国国家标准《动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定》[5]和农业部标准《动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定——高效液相色谱法》[6]，通过将样品处理后，进行衍生化后用液相色谱法进行测定，该标准对动物源食品中阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、埃普利诺菌素的检出限均是1.0μg/kg，而本研究中制备的试剂盒对应鸡肉、鸡肝、虾中阿维菌素的检测限分别为1.5、1.9、1.6μg/kg，与国标检测限比较十分接近。另外，由于样品衍生化需要一定的时间100min，再加上仪器检测时间就更长，因此利用酶联免疫试剂盒能够比国标方法更加快速、简便地检测出动物源食品中的阿维菌素类药物的含量，而该试剂盒的操作时间最长仅需25min，适合现场大量检测样本的检测，更符合快速检测的要求，实现了对阿维菌素类残留的简便、快速、精确检测。

参考文献

[1]何方洋等.阿维菌素类药物单克隆抗体的制备和鉴定[J].现代畜牧兽医，2010.07，48- 51.

[2]朱蓓蕾，动物性食品中阿维菌素类药物残留高效薄层色谱分析方法的研究[J].动物毒理学，1997， 12（2）： 11- 16.

[3]杨利国，胡少昶，魏平华等.酶联免疫技术[M].江苏：南京大学出版社，1998.

[4]唐伟国主编.医学检验诊断试剂的制备与应用[M].上海：上海科学技术文献出版社，1996.

[5]GB/T21321-2007，动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定—免疫亲和-液相色谱法[S].

[6]农业部781号公告-5-2006，动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定—高效液相色谱法[S].

[7]王永明，黄耀凌，王鹤佳等.链霉素酶联免疫检测试剂盒的稳定性研究[J].中国兽药杂志，2007，41（7）：23-24，31.

[8]唐伟国.医学检验诊断试剂的制备与应用[M].上海：上海科技文献出版社，1996：99.

132例心肌酶谱检测与分析 第4篇

关键词：心肌酶谱,检测,分析

心肌酶是人体心肌内含有的多种酶的总称, 一般分为:天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、α-羟丁酸脱氢酶 (α-HBDH) 、肌酸激酶 (CK) 及肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 几类[1,2,3]。我国通常将这几类与心肌损伤有关的酶合称为心肌酶谱, 当人体心肌受到损伤后会释放不同程度的心肌酶, 临床上可以通过对患者的心肌酶谱检测, 确定患者心肌受损的程度及其他相关疾病, 为医务人员临床诊断及治疗提供依据。现将笔者临床心肌酶谱检测的体会报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年1月至2010年12月我院共对132例患者进行心肌酶谱检测, 男89例, 女43例;年龄48~86岁, 平均年龄67岁。

1.2 心肌酶谱检测与分析

1.2.1 天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 的检测分析

天门冬氨酸氨基转移酶是人体内重要的转氨酶, 心脏内含有AST活性最高, 正常人血清中含量甚微[4,5]。正常情况下, 血清中含有的AST的范围是8~40U/L。临床上AST用于确定患者是否患有心肌梗死、心肌炎、肝硬化及肝癌的检查。当患者患有心肌梗死时, 其血清内AST含量在发病6~12h会明显上升, 48h后AST含量最高, 120h恢复正常, 且AST含量上升幅度与患者心肌梗死的病情成正比;当对患者的肝功能进行检查时, 可以将AST与谷丙转氨酶结合检测, 用以反应患者的肝功能状况, 谷丙转氨酶可以反映肝细胞受损的指标, AST可以反映肝细胞坏死的程度, 二者结合可以极大提高临床上肝硬化、肝癌的检测准确度, 如, 患者的谷丙转氨酶/AST比值<1.0为早期肝硬化的表现, 比值>1.0表示患者已有实质性的肝损伤。

1.2.2 乳酸脱氢酶 (LDH) 的检测分析

乳酸脱氢酶是人体内的一种糖酵解酶, 在人体各组织器官内广泛存在。用电泳法可以分离出5种同工酶区带, 根据其电泳迁移率的快慢, 依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4及LDH5。正常情况下, 血清中LDH含量具有LDH2>LDH1>LDH3>LDH4>LDH5的排列规律。临床上LDH用于确定患者是否患有急性心肌梗死、肝炎及肺部疾病的检查。当患者发生急性心肌梗死时, 其血清中LDH1和LDH2活性及含量明显升高, 且LDH1升高更早、更快, 检测可发现LDH1>LDH2;当发生急性肝炎时, 患者血清内LDH5明显升高, LDH4变化不显著, LDH5/LDH4的比值>1, 若血清LDH5含量持续升高或先下降再升高, 可判定为慢性肝炎;当患者的肺部出现疾患时, 血清中LDH3会明显升高, 如肺梗死时LDH3、LDH4会同时升高且二者含量基本持平, 同时LDH1含量明显下降。

1.2.3 α-羟丁酸脱氢酶 (α-HBDH) 的检测分析

α-羟丁酸脱氢酶不是一个独立的特异酶, 是乳酸脱氢酶的一种同工酶。检测α-HBDH其实际反映的是乳酸脱氢酶同工酶LDH1和LDH2的活性。正常情况下, 血清中含有的a-HBDH的范围是90~220U/L。由于a-HBDH在人体心肌的含量较高, 所以临床上多用于心肌梗死后期的诊断。LDH/a-HBDH的比值有助于医务人员对患者心脏疾病与肝病的鉴别, 健康人LDH/a-HBDH的比值为1.2~1.6, 而心肌梗死的LDH a-HBDH比值较低为0.8~1.2, 实质性肝病的LDH/a-HBDH比率较高为1.6~2.5。

1.2.4 肌酸激酶 (CK) 的检测分析

肌酸激酶通常存在于心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中, 是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩有直接关系的重要激酶。正常情况下, 血清中含有CK的范围是8~60U/L。在临床上, 当采用心电图对患者心肌梗死进行早期诊断不明确时, 可以通过检测血清内CK活性是否升高作为心肌梗死的早期诊断的标准。当患者发生急性心肌梗死时, 其体内血清中CK的含量于2~4h上升为正常值10倍左右, 24h上升到最高值, 48h恢复正常。CK在血清内含量的上升幅度与患者心肌梗死的面积成正比, 其短时间上升并回落表示患者心肌梗死并没有扩展, 但持续升高则表示患者心肌梗死在恶化, 若CK反复升高表示患者心肌梗死范围再度扩展或有新的梗死病灶。

1.2.5 肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 的检测分析

肌酸激酶由三种同工酶的不同组合构成, 即CK-MM、CK-MB、CK-BB。其中CK-MB是检查心肌是否存在损伤的特异性标志, 患者血清中CK-MB大幅升高表示其存在心肌梗死, 比CK总活性测定更能准确判断心肌损伤的程度。正常情况下, 血清中含有CK-MB的范围是0~25U/L。当患者发生心肌梗死时, CK-MB通常在3~8h出现升高, 高峰时在发病后9~30h, 于48~72h恢复至正常水平。若梗死后120h仍持续升高, 表示患者心肌梗死仍在继续, 如患者胸痛48h内CK-MB未升高或<总活性的2%一般可排除心肌梗死。

2 结果

通过对132例患者进行心肌酶谱检测, 确诊患心肌类疾病78例, 其中心肌梗死患者43例、活动性风湿性心肌炎19例、急性病毒性心肌炎16例;患肝部疾病35例, 其中急性肝炎9例、慢性肝炎5例、肝硬化13例、肝癌8例;患肺部疾病19例, 其中肺梗死11例、肺炎8例。

3 小结

由于临床实验室检测诊断存在特殊性, 需要根据实际诊断的需要及相关检测指标的特性对灵敏度及特异性较低的指标进行组合检测及分析, 以便提高临床检测的准确性。心肌酶谱检测在临床上应用非常广泛, 在对各类相关疾病的诊断方面具有重要意义[6,7,8]。CK-MB可以高效地判定患者是否患心肌梗死, 但由于CK-MB的活性期短, 容易错过临床症状不明显患者的诊断期, 在临床检测时将CK-MB与可以较长时间在血清保持活性的LDH结合检测, 可以提高诊断效率。α-HBDH可以对患者心肌梗死后期的诊断有较大优势。心肌内AST的含量高出骨骼肌很多, 而CK较骨骼肌低4倍, 确定CK/AST的比值可以提高诊断的特异性及灵敏度。因此, 正确有效的使用心血酶谱检测可以为医务人员的临床诊断带来巨大的助益。

参考文献

[1]董素民.心肌酶谱检查对急诊检验项目的价值[J].中外医学研究, 2010, 8 (11) :69.

[2]林东.急性脑血管病心电图及心肌酶谱改变的临床分析[J].华夏医学, 2009, 22 (2) :24.

[3]张梅.肺炎支原体肺炎心肌酶谱变化分析[J].内蒙古医学, 2004, 36 (5) :39.

[4]孙健.心肌肌钙蛋白与心肌酶谱检验的体会[J].中国医疗前沿, 2007, 2 (24) :90.

[5]龚晓彬.48例AMI患者血清心肌酶谱与CTNI的检测分析[J].江西医学检验, 2005, 23 (6) :29.

[6]郑梅荣.急性心肌梗死病人心肌酶谱的动态变化及其临床意义[J].临床军医, 2002, 30 (5) :10.

[7]张磊.心肌酶谱与CTNI三联金标检测不同时段急性心肌梗死的评价[J].江西医学检验, 2005, 23 (4) :17.

酶检测法 第5篇

基于FIA和光学原理的酶传感器检测海水甲基对硫磷

将乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)传感器与流动注射系统(flow injection analysis system, FIA)相结合,通过光学方法测定固定化酶受农药抑制后的`残余活性,对海水中微量甲基对硫磷进行定量分析.该系统的适宜工作条件为:温度30 ℃;固定化酶的用量0.05 U;载液流速0.45 mL/min;进样时间20 min;底物(碘化硫代乙酰胆碱)溶液浓度0.100 mol/L,注射量100 μL.在0.1～100 μg/L之间,农药浓度的对数值与固定化酶活性的抑制率之间具有良好的线性关系(r=0.995?3).利用该系统检测含甲基对硫磷分别为0.8 μg/L和5.0 μg/L的模拟海水样品,获得了较好的准确度和精密度,平均相对误差和变异系数均小于10%.

作 者：孟范平刘强 刘娇 MENG Fan-Ping LIU Qiang LIU Jiao  作者单位：中国海洋大学环境科学与工程学院,山东,青岛,266100 刊 名：中国海洋大学学报（自然科学版）  ISTIC PKU英文刊名：PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA 年，卷(期)： 37(1) 分类号：P237 关键词：甲基对硫磷   乙酰胆碱酯酶(AChE)   流动注射系统(FIA)   生物传感器   海水  

酶检测法 第6篇

关键词：接骨木；苦碟子；纤溶酶；分离；活性检测

中图分类号：S567.01文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0315-02

心脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一。近30年来，我国人群心血管疾病的发病率及危险因素水平呈不断上升趋势。据卫生部心血管病防治中心发布的《中国心血管疾病调查报告2011》：目前，我国包括冠心病、脑中风、心力衰竭和高血压在内的心血管病病人估计已达2.3亿[1-2]。因此研发高效、特异、安全、副作用小的溶栓药物，一直是近年来医药界的热门课题[3]。随着对中医药认识的发展，溶栓中草药的研究也在不断发展，已有部分中药被制成了单味注射液，如刺五加、川芍、丹参、灯盏花、葛根素、红花等[4]；同时，一些学者也在不断研究新的溶栓药用植物。接骨木、苦碟子作为长白山道地药材，具有祛风、活血，治风湿筋骨疼痛，抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、抗骨质疏松及免疫活性等药理作用[5-6]，但有关其在溶栓方面的研究尚未见相关报道。因此本研究以长白山道地药材接骨木、苦碟子为试验材料，采用硫酸铵沉淀，透析除去小分子物质，用纤维平板法初步判断接骨木、苦碟子粗提物中的溶纤成分，并对其活性做初步研究，为进一步开发具有溶栓功能的长白山道地药材提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1中草药接骨木、苦碟子采自通化师范学院生命科学学院实验教学基地，经生命科学学院秦佳梅教授鉴定。

1.1.2主要试剂纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶购自中国药品生物制品检定所，标准尿激酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶购自天津生物化学制药厂。

1.2试验方法

1.2.1接骨木、苦碟子蛋白质的提取

称取接骨木、苦碟子干粉2g，浸于200mLPBS缓冲液中，4℃保存过夜，间隔时间振荡，离心（4℃，4000r/min）10min，取上清，加入80%饱和硫酸铵溶液，离心（4℃，8000r/min）10min，沉淀用PBS溶解，得到蛋白粗提液，装入透析袋用PBS缓冲液透析，每隔2h换1次溶液，取透析后的蛋白溶液冷冻干燥，-80℃冰箱中保存，备用。

1.2.2样品蛋白提取物浓度的测定

采用考马斯亮蓝（G-250）法[7]测定蛋白质含量：取待测粗酶蛋白样品溶液0.1mL，加入5.0mL考马斯亮蓝溶液，测定595nm处吸光度，计算供试样品的蛋白浓度。

1.2.3蛋白提取物的体外纤溶活性鉴定

纤维平板的配制及尿激酶标准曲线制作参照夏广清等的方法[8]。

1.2.3.1判断纤溶成分是否为蛋白质

将供试品在沸水浴中加热10min，点纤维蛋白板，若活性丧失，可初步判断起溶纤作用的物质为蛋白质。

1.2.3.2样品蛋白溶液酶活力测定

分别取10μL接骨木、苦碟子蛋白质提取液，加入纤维平板中，37℃培养箱培养18h，观察，如点样孔周围出现透明的溶圈，则证明被加样品有溶栓效果，测量溶圈直径，对照标准曲线可得到样品溶液相对尿激酶活力。

1.2.3.3蛋白提取物的溶纤比活力测定

蛋白比活力（U/mg）=相对尿激酶活力（U）/[蛋白浓度（mg/mL）×点样体积（mL）]。

1.2.4接骨木、苦碟子纤溶酶的SDS-PAGE检测

按汪家政等的方法[9]，对蛋白质进行12%SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝G-250染色。

2结果与分析

2.1接骨木、苦碟子粗酶提取液蛋白质含量的测定

根据标准蛋白的吸光度，绘制蛋白质浓度的标准曲线（图1），由标准曲线得到蛋白质浓度的计算公式为：y=0.0074x-0.0102。依据公式通过吸光度测得接骨木、苦碟子粗酶蛋白含量分别为1842μg/g及1976μg/g。

2.2接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鉴定及溶纤活力、比活力

根据尿激酶溶圈直径的平方绘制尿激酶标准曲线（图

2），由标准曲线得到酶活力计算公式为y=0.0102x+0.032。根据公式，由样品蛋白在纤维平板上的溶圈直径计算出接骨木及苦碟子粗提物蛋白比活力为分别0.795U及0.837U。

2.3接骨木、苦碟子粗酶提取物硫酸铵分级沉淀及体外溶栓试验

由图3-A可见，从接骨木、苦碟子中可以分离出具有溶纤活性的纤溶蛋白。硫酸铵沉淀试验结果表明，当硫酸铵饱和度在0～40%时，沉淀物无纤溶活性；当硫酸铵饱和度在50%～60%时，沉淀物活性较低；而当硫酸铵饱和度为70%～90%，沉淀物活性最高（图3-B），因此，后续试验均采取70%～90%饱和硫酸铵沉淀。

2.4接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鉴定

将提取到的接骨木、苦碟子粗酶提取物在沸水中煮沸5min，将煮沸后的样品进行溶纤试验，纤维平板上未见任何溶解现象，表明接骨木、苦碟子中具有溶栓作用的为蛋白质。

2.5接骨木、苦碟子纤溶酶的SDS-PAGE检测

对得到的接骨木、苦碟子粗酶进行SDS-PAGE电泳，结果表明，从这2种长白山道地药材中可分离到分子量为15～45ku的蛋白质（图4），经离子交换层析后，得到分子量大约为36ku的明显条带（图5），因此，初步判断接骨木、苦碟子纤溶蛋白酶的分子量大约为36ku。

nlc202309032134

3讨论

随着人们生活水平的不断提高，血栓性疾病已成为常见病、多发病，尤其是心脑血管疾病，严重影响人类的健康和寿命。目前预防和治疗血栓性疾病主要有3种方式：一是针对一些有高凝状态的病人用药物预防血栓；二是对已有血栓形成的患者给予抗凝治疗，以防止血栓的延伸、扩大，避免栓塞并发症；三是采用手术或服用溶栓药物，消除血栓，疏通血管，恢复正常血液流动，减少组织和脏器的损伤。前2种方式对于已经形成的血栓无法消除，而手术取血栓技术的难度和风险都较大，所以在临床上多采用溶栓药物法。溶栓药物以溶解纤维蛋白多聚体为主，使血栓纤维蛋白降解，形成可溶性的纤维蛋白降解产物，及时使血管再通，减轻脏器损害的范围和程度，大大提高病人的存活率。纤溶系统对纤维蛋白的溶解、对血液的循环有重要的影响，纤溶酶活性的降低是导致血栓形成的主要原因之一。目前纤溶酶主要来源于动物和微生物，源于植物的纤溶酶很少[10]。本试验从接骨木、苦碟子中分离得到纤溶酶并对其酶学性质进行了初步研究，表明可以从接骨木、苦碟子中分离出分子量约为36ku的具有溶栓活性的纤溶酶，有望将其开发成新型的溶栓类药物。

参考文献：

[1]徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2002：1347-1348.

[2]郑红花，罗德生，罗丽芳，等.大鼠实验性肝损伤时山梨醇脱氢酸SOD活性及MDA含量变化[J].咸宁医学院学报，2000，14（4）：232-234.

[3]顾毅，时德，赵渝.肿瘤与静脉血栓形成的关系研究进展[J].中国癌症杂志，2002，12（1）：85-88.

[4]何叶喧.中草药牛膝、茜草纤溶酶的筛选与分离纯化[D].保定：河北大学，2006.

[5]欧阳富，刘远，肖辉辉，等.接骨木中木脂素类化学成分研究[J].中国中药杂志，2009，3（10）：1225-1227.

[6]秦岐行.苦碟子治疗心血管疾病活性成分筛选[D].长春：长春理工大学，2012.

[7]肖能庚，余瑞元，袁明秀，等.生物化学实验原理和方法[M].2版.北京：北京大学出版社，2005：262-270.

[8]夏廣清，宋金枝，刘伟.穿龙薯蓣纤溶酶分离及活性检测[J].通化师范学院学报：自然科学，2013，34（2）：42-43，86.

[9]汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2000.

[10]顾昌玲，朱宝成，周艳芬，等.延胡索纤溶酶的分离纯化及部分性质[J].中国生化药物杂志，2008，29（2）：81-84，88.

细菌耐药分析及耐药酶的检测探讨 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2008年3月至2011年3月院门诊与住院部收治患者所取得的2650例细菌血培养标本, 其中分离出菌株为610株。

1.2 仪器与材料

铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌够买自福建迈新生物技术开发公司;血培养仪和相关配套培养瓶、哥伦比亚琼脂及M-H琼脂提供自法国生物梅里埃公司;真菌药敏试剂盒购买自温州康泰生物科技有限公司;药敏纸片购买自广州市乐通泰生物科技有限公司。

1.3 实验方法

根据患者病情, 科室采集标本进行无菌操作。其中, 对儿童的采血量为3～5mL, 对成人的采血量为5～10mL, 分别将采得血液注入儿童瓶与成人瓶, 并迅速送往微生物室放置进全自动血培养仪中。当仪器提示阳性, 转种培养有细菌生长为阳性, 当仪器提示阴性, 标本培养五天盲转。实验所有菌株全部采用API鉴定系统鉴定, 细菌使用K-B法药敏, 根据NCCLS2000年的判断标准进行结果判定。“中介”具有统计学意义。

2 结果

2650例血培养中, 阳性标本610例, 阳性率为23.0%。其中革兰阳性球菌403株 (66.1%) , 革兰阴性杆菌17株 (29.0%) , 真菌19株 (3.1%) , 革兰阳性杆菌6株 (0.98%) 。主要病原菌有凝固酶阴性葡萄球菌226株, 约占37.0%;大肠埃希菌104株, 占17.4%;金黄色葡萄球菌91株, 占14.9%;肠球菌61株, 占10%;肺炎克雷伯菌21株, 占3.4%。革兰阳性球菌药敏试验结果, 见表1。革兰阴性杆菌对哌拉西林、头孢噻肟、氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林等耐药率高;真菌对于两性霉素B、制霉菌素、5-氟胞嘧啶具有较高敏感性, 对于伊曲康唑、咪康唑、氟康唑益康唑具有较高耐药率, 见表1。

3 讨论

本组数据表明, 血培养阳性菌株中, 凝固酶阴性葡萄球菌较多, 占比37.0%, 大肠埃希菌次之, 占比17.4%。随着抗生素在临床上的广泛应用, 细菌耐药率日渐高涨, 尤其是H L G R、M R S A、产E S B L s、M R C N S为代表的革兰阴性杆菌耐药问题, 这些问题并应引起足够重视。临床感染性疾病恶化甚至死亡的一大重要原因就是败血症与菌血症的产生, 提高对病原菌的检测水平, 以及合理使用抗生素是临床感染性疾病治疗的关键性因素。实践数据表明, 加强对血培养的监测, 并根据细菌药敏结果科学合理地选用抗生素, 对减少和延缓耐药菌株的产生具有及其重要的临床作用。

参考文献

[1]冯瑞华, 李志强, 赵希玲.我院2009年关于病原菌检测及抗菌药物耐药性分析[J].医护论坛, 2011, 8 (11) :172～173.

[2]叶惠芬, 李红玉, 赖福才, 等.广州地区菌血症常见病原菌及耐药性调查[J].中华医院感染学杂志, 2002, 12 (9) :707～708.

[3]邓丽华, 胡丽萍, 许美荣.血培养常见病原菌分布和耐药性分析[J].徐州医学院学报, 2006, 26 (2) :181～183.

酶检测法 第8篇

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015 年1 月至2015 年8 月于本院收治的80 例手足口病患儿为研究对象, 患儿均符合手足口病诊治标准, 将其设定为观察组。其中男43 例, 女37 例, 年龄6 个月至8 岁, 平均 (2.8±1.2) 岁。另选80 例来我院体检且检查结果正常的儿童为对照组, 其中男41 例, 女39, 年龄1~9 岁, 平均 (3.2±1.3) 岁。两组患者的性别、年龄等比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。参与本次调研的儿童的家长均知情并签署了同意书。

1.2 方法

两组儿童在入院时清晨空腹抽取其静脉血3 ml, 分离血清后采用全自动生化仪检测其血清心肌酶。其中, 各项心肌酶的参考值分别为:α- 羟丁酸脱氢酶 (α-HBDH) 72~182 U/L、乳酸脱氢酶 (LDH) 109~245 U/L、肌酸激酶 (CK) 26~174 U/L、肌酸磷酸激酶同工酶 (CK-MB) 0~25 U/L。两组患儿的血清心肌酶结果均与其正常值相比较, 若在参考范围之外者, 均记录为异常者。

1.3 统计学处理

采用SPSS16.0 统计软件进行数据的分析与处理, 计量资料以表示, 计数资料采用 χ2检验, 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

手足口病患儿的各项血清心肌酶指标均有升高的现象, 观察组明显高于正常对照组 (P<0.05) , 见表1。

3 讨论

手足口病是1957 年在新西兰首先发现的一种疾病, 对于大多患者来说其发病程度轻, 一般在1~2 周后痊愈, 愈后状况良好, 无后遗症。但此病常发于抵抗力较低的儿童身上, 且由手足口病而引起的心肌炎致使患儿死亡的情况时有发生, 因此不能忽视手足口病患儿的心脏改变, 而血清心肌酶的检测有助于其诊断[2]。血清心肌酶大致包括α-HBDH, LDH, CK, CK-MB四种。本次调研结果显示, 观察组患儿血清中 α-HBDH及LDH的异常率极高, 分别为91.3% 和68.8%;而CK和CK-MB异常率亦达18.8% 和36.3%。相对于正常对照组均在10% 及以下的异常率而言, 手足口病患儿的血清心肌酶异常率是显著升高的。提示, 绝大部分儿童患手足口病后, 其血清心肌酶会发生异常, 尤其是 α-HBDH及LDH。虽因 α-HBDH及LDH是在体内分布较广, 其异常也有可能是非心脏因素影响的, 但并不排除产生心肌炎的可能。而CK-MB是心肌特异性同工酶, 对判断心肌损害具有高度的特异度, 我们应该足够的重视[3]。

综上所述, 我们应该密切关注手足口病患儿的血清心肌酶的异常情况, 并判断是否有心肌损害, 以便及时采取有效的治疗措施。

摘要：目的 探讨和分析手足口病患儿血清心肌酶检测的临床诊治意义。方法 选取2015年1月至2015年8月80例手足口病患儿为研究对象, 将其设为观察组, 另设80例体检健康的儿童为对照组, 检测并统计分析两组儿童的空腹血清中的心肌酶情况。结果 观察组患儿的血清心肌酶均有异常, 其含量显著高于对照组 (P<0.05) 。结论 测定手足口病患儿的血清心肌酶能及时了解到疾病对患儿心肌的损害程度, 预防心肌炎造成患儿死亡的现象, 其临床实用意义突出, 值得在临床上推广。

关键词：手足口病,患儿,血清心肌酶

参考文献

[1]马新晓.手足口病患儿血清心肌酶谱检测的临床意义[J].新乡医学院学报, 2014, 31 (8) :641.

[2]胡淑琴, 王绪韶, 冷建武, 等.手足口病患儿血清心肌酶谱检测的临床意义[J].临床合理用药, 2011, 4 (12a) :45-46.

酶检测法 第9篇

1 酶抑制法检测蔬菜中有机磷农药残留

1.1 样品前处理技术

检测样品的前处理过程包含提取过程和净化过程。提取是指将蔬菜中的农药溶解分离出来的操作步骤, 现阶段使用效果较好的提取剂有乙酸、甲醇、乙醇等, 而采用辅助设备能有效提高提取效率。净化指的是取出样品中无关成分干扰的过程, 对于农产品来说, 有机分子的成分复杂, 特别是大分子的蛋白质和氨基酸严重影响提取结果, 对于目标农药的检测会造成较大的影响。SPE萃取技术是现阶段应用较广的有机磷农药检测前处理技术, 先进的SPE萃取技术是一种结合了液固萃取和色谱技术的新型有机磷农药检测萃取技术。萃取柱是一种以氧化铝、硅胶等具有较强吸附能力的物质为主的离子交换柱, 该项技术具有溶剂使用量小、重复性高、环境友好等诸多优点, 在实际应用中与高压液相色谱技术相结合, 能有效检测有机磷农药残留。

1.2 乙酰胆碱酯酶检测有机磷农药残留

乙酰胆碱酯酶检测技术所依据的昆虫毒理学原理是:有机磷农药对于昆虫中枢神经和周围神经系统有一定影响, 主要体现在乙酰胆碱酯酶的活性方面, 导致乙酰胆碱的传输障碍并积累, 昆虫中毒致死。含有有机磷农药的样品在前处理工艺的处理之后, 加入到酶和底物的混合液中, 反应之后加入显色剂, 然后测定样品的吸光度, 就能够计算出胆碱酯酶的抑制程度, 通过抑制率与农药残留浓度的相关关系方程式, 就能够完成对于蔬菜中有机磷农药的检测。该方法主要用到分光光度计。

根据酶促反应的反映动力学原理, 当蔬菜中不存在有机磷农药和氨基甲酸酯类农药, 则底物会在酶的作用下分解, 反应速率可以通过吸光值随时间的变化速率求出。当反应混合物中存在有机磷农药, 则会在一定程度上抑制酶的活性, 从而对显色体系的反应速率造成一定影响, 此时求得吸光度随时间的变化速率, 有机磷农药的残留浓度可以通过两者的数量关系求得[1]。

1.3 植物酯酶抑制方法

乙酰胆碱酯酶方法的主要缺点在于使用成本较高, 在此背景下, 部分学者研究了植物酯酶抑制方法。植物酶具有来源丰富、制取方便等优势。使用植物酯酶抑制方法, 逐渐建立起相应的薄层-植物酯酶抑制技术。与乙酰胆碱酯酶一样, 该技术也是应用了有机磷农药对于植物酯酶的抑制作用, 当蔬菜中残留了有机磷农药, 则反应就会受到抑制, 反应产物相对减少, 显色剂显示出的颜色变化就能够对农药残留量进行判断[2]。

2 结语

有机磷农药在我国蔬菜杀虫中应用非常广泛, 近年来研究发现有机磷农药并非一种安全农药, 蔬菜中残留的有机磷农药对食用者身体健康影响较大。本文分析了现阶段应用较为成熟的乙酰胆碱酯酶检测技术和植物酯酶检测技术, 该项技术的推广能够在一定程度上推进蔬菜中有机磷农药检测技术的进步。

摘要：目前对于蔬菜中有机磷农药残留检测的研究有很多, 传统的气相色谱分析和液相色谱分析技术由于设备和操作方法的限制, 不能大规模推广。酶抑制法具有检测快速、设备简单、精度较高等优势, 近年来发展很快。

关键词：酶抑制法,有机磷农药,检测技术,植物酯酶

参考文献

[1]邱朝坤, 刘晓宇, 任红敏, 等.酶抑制法检测蔬菜中有机磷农药残留[J].食品与机械, 2010 (2) :40-42, 71.

酶检测法 第10篇

关键词：贮存试剂,酶联免疫吸附测定,丙型肝炎病毒

0 引言

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是国家规定的献血者筛查项目之一,间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是HCV抗体筛查的常用方法[1],尤瑞纳斯(Uranus)全自动酶免分析系统(以下简称“Uranus”)以高效率、循环进样、直观、易操作等优点用于ELISA检测,很大程度上提高了血液检测的质量[2],已普遍用于献血者筛查项目的ELISA检测。我站于2011年引进Uranus AE280,厂家建议试验后将剩余酶免试剂以试剂槽4℃贮存,但对于有效贮存期限未给出明确的指导意见。以往研究报道[3,4],酶免试剂贮存不当会使试剂检测灵敏度下降,最终导致结果失控。为了探讨试剂槽贮存酶免试剂对检测结果的影响,我们将血站用于献血者HCV抗体检测的酶免试剂以Uranus试剂槽贮存,对不同确定结果的系列样本进行ELISA检测,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1实验样本

收集2012年11月至2013年11月无偿献血者血液样本,经2家HCV试剂盒检测,阴性样本20例,弱阳性样本(样本值/临界值(S/CO值)1~5)20例,阳性样本(S/CO值≥10)10例。其中,男39例,女11例。所有样本均无溶血、乳糜、黄疸,3 200 r/min离心15 min,分离血浆后,小心吸取上层血浆于新的Eppendorf管内,每管200μL,每例样本共分装5管,置-20℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 试剂

抗-HCV ELISA诊断试剂盒(国产某公司,批号:C20130508),经中国药品生物制品检定所批检合格;抗-HCV室内质控品,北京康彻思坦有限公司,批号为201303001,浓度为1 NCU/m L。所有试剂使用前经过确认,均在有效期内。

1.3 主要仪器

Uranus AE280全自动酶免分析系统(深圳爱康电子有限公司),台式普通高速离心机(德国TECAN公司)。

1.4 方法

1.4.1 试剂准备

将装有HCV抗体的ELISA试剂盒由4℃冰箱取出,平衡至室温(13~25℃),将HCV抗体试剂盒内样本稀释液、酶结合物、底物A、底物B、终止液分别倒入相应的Uranus试剂槽中,并放在相应的位置。

1.4.2 样本准备

取50例冻存的系列HCV样本,包括20例HCV阴性样本、20例HCV弱阳性样本、10例HCV阳性样本,将样本血浆于室温复融,并平衡至室温,实验前混匀。

1.4.3 实验

实验步骤严格按试剂说明书,设定空白对照、阴性对照、阳性对照、弱阳性室内质控孔,将系列HCV样本进行ELISA双孔检测,作为对照组(0 d)。在Uranus全自动酶免分析系统中进行稀释、加样、温育、洗板、读数,剩余试剂用Uranus试剂槽贮存置于4℃冰箱中,期间模拟日常实验时间将试剂槽取出于室温放置,并依次于7、14、21、28 d的同一时间分别取50例系列HCV样本进行ELISA双孔检测,实验均由同一操作人完成。

1.4.4 结果判断

取双孔的平均吸光度(A)值,S/CO值≥1.0判为阳性,<1.0判为阴性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件,计量资料均以“均数±标准差(±s)”表示,并进行正态分布及方差齐性检验,2组间的比较采用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同贮存时间的试剂槽贮存试剂对HCV抗体检测A值的影响(±s)见表1。

注:*与 0 d 的比较,P<0.05,有显著差异;**与 0 d 的比较,P<0.01,有极显著差异

由表1可见,虽然所有HCV系列样本以7 d内的贮存试剂检测,结果较0 d无明显变化(P>0.05),但自14 d后试剂槽贮存试剂对HCV抗体样本的检测A值的影响显著:20例HCV抗体阴性样本,自14 d开始,A值逐渐升高(P<0.05),及至21 d均显著高于0 d,差异有统计学意义(P<0.01);贮存试剂对弱阳性及阳性血液样本检测结果的影响更显著,20例HCV抗体弱阳性样本及10例阳性样本的检测结果显示:自14 d开始,检测样本的A值随试剂贮存时间的延长逐渐降低,均显著低于0 d,差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

丙型肝炎是世界各国及地区共同面临的严重传染病,特别是经济不发达地区。HCV是造成输血后肝炎的主要病因,经血传播是HCV传播的主要途径。全球已有1.17亿人受到感染,我国有感染者大约4 000万,有相当一部分慢性丙肝感染者会发展成肝硬化、肝癌,给家庭和社会造成沉重的经济负担[5,6,7]。因此,严把献血者丙肝病毒感染检测质量关,是切断输血传播丙型肝炎、保证临床用血安全的关键。

目前,ELISA法测抗-HCV是我国大多采供血机构用于献血员筛查丙肝病毒传染指标的最主要方法[8]。根据《血站质量规范》和《血站试验室质量管理规范》的规定,为了保证检测结果的可靠性,使酶免设备正常、高效地运行,要求对设备建立和实施维护、校准以及持续监控等管理制度,针对设备的性能,制定完善而有层次的维护保养方案,对设备定期实施不同层面的维护保养[9]。本研究旨在通过探究酶免试剂的试剂槽贮存时间对于献血者HCV抗体ELISA检测结果的影响,明确实验室对Uranus全自动酶免分析仪试剂槽的维护要求,为实验室优化设备维护程序提供数据支持。

研究显示,国产抗-HCV试剂可以用Uranus试剂槽贮存7 d而不影响阴性样本测定,自贮存14 d开始,血液样本的A值逐渐增高,直至28 d检测结果几乎接近“灰区”值(0.071~0.140),这表明试剂槽贮存试剂时间越长,其HCV检测的假阳性率将越高,一定程度上使假阳性样本增加,血液报废率提高,导致宝贵的血液资源浪费。阴性样本产生非特异性显色的原因可能与试剂槽贮存的样本稀释液有关。样本稀释液一般由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白以及试剂稳定剂等组成,其可以保证血浆样本最合适的ELISA反应环境及微量血浆样本与聚乙烯包被孔接触面积大小的一致性。良好的样品稀释液可有效降低非特异性反应,提高ELISA检测方法的敏感性和特异性,保证ELISA检测结果的准确[10]。在HCV试剂说明书中,写明样本稀释液不宜长时间暴露于空气中,每次使用样本稀释液后应尽快盖好瓶盖,否则会影响实验结果。试剂槽贮存的样品稀释液长时间暴露于一般环境中,随着贮存时间的延长,试剂稳定剂中的氨基酸、糖类等有机物易受到空气的氧化,可能会导致稀释液p H的改变以及试剂中蛋白成分的变性,在ELISA检测中不能发挥应有的作用,产生非特异性反应。另外,底物B对光敏感,底物溶液用试剂槽贮存一定时间后易变蓝,使ELISA板底增高,影响测定结果。

特别值得关注的是,当以试剂槽贮存试剂检测HCV抗体弱阳性和阳性样本时,自贮存的14 d开始,样本的A值随着贮存时间的延长逐渐降低,特别是28 d后的弱阳性样本A值低于临界值(0.140),这样对处于临界值水平的HCV样本,增加结果判断难度,稍有不慎,使样本的检测结果发生质的改变,导致弱阳性样本的漏检。这也表明试剂槽贮存的酶免试剂对弱阳性、阳性样本的检测结果仍有较大影响。对于此结果,研究者认为可能由以下原因造成:一方面,在血站每个批次的样本检测中,从试剂平衡至室温到实验结束放回4℃冰箱,每次实验试剂槽内的试剂在室温中的暴露时间为4~5 h,而且实验后只在试剂槽上加盖一个自制的塑料盖便放入4℃冰箱贮存。酶结合物经反复使用,使贮存温度不恒定,极易使酶的催化活性和抗体的免疫活性降低。另一方面,底物A易挥发,试剂槽内的贮存试剂长时间暴露于空气中,可引起底物A的浓度变化及底物B的分解。底物A的浓度过低或过高都会抑制酶促反应[11],造成试剂盒的底物敏感度和稳定性降低,一定条件下可引起弱阳性和阳性样本A值降低,从而导致接近临界值样本出现假阴性,以致阳性样本的漏检,由此可能造成HCV通过输血途径传播的严重后果。

酶检测法 第11篇

【关键词】 天冬氨酸氨基转移酶；颅内转移瘤；辅助诊断价值

颅内转移瘤（intracranial metastases）是指身体其他部位的恶性肿瘤经血液或其他途径转移到颅内者。虽然在发生率上，肿瘤的颅内转移不如肝脏和肺脏转移多见，但是颅内转移瘤的临床表现却明显和严重，不治者多迅速致死。据统计，死于全身癌肿者中，1/4有颅内转移，这一数字比死于原发性中枢神经系统的恶性肿瘤者高9倍以上。中枢神经系统的转移性肿瘤约占全部临床肿瘤的1/5，恶性肿瘤死亡病例中有10%-50%可有脑转移。最易發生脑转移的恶性肿瘤是肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌等。[1]通过脑脊液生化检测发现颅脑转移瘤有重要的临床意义。

1 资料与方法

对我院自2009年至今的566例颅内转移瘤患者的脑脊液生化检测值中的AST进行回顾性分析。脑脊液中AST正常参考值为<20U/L[2]，高于正常参考值一倍以上即有临床意义。

2 结 果

566例颅内转移瘤中有369例患者的脑脊液AST检测超过正常参考值1倍以上。

3 讨 论

正常情况下，谷草转氨酶存在于组织细胞中，其中心肌细胞中含量最高，其次为肝脏，血清中含量极少，脑脊液中更少。大部分脑转移瘤是多发的，单个转移灶较少见，约70%-80%脑转移瘤病例被发现为多发的[3]，引起脑组织较广范围的损伤，从而引起对组织损伤敏感的酶AST的增高，其增高幅度与转移瘤对脑组织的损伤呈正相关。脑脊液AST的检测对于颅内转移瘤虽无确诊价值，但AST的升高对其却有很好的辅助诊断意义。近年来由于诊断技术的提高，对恶性肿瘤采用综合治疗，使颅腔外其他脏器原发性肿瘤的治愈率和缓解率显著提高[4]，可是颅内转移瘤发生率和致死率仍较高。因此，提高对本病的认识，及时而准确地诊断颅内转移瘤，给予及时而有效的诊治，对提高病人生命质量具有重要意义[5]。

参考文献

[1] 赵敏敏，莫书荣.KINECTIN与神经系统肿瘤的相关性研究.《亚太传统医药》，2010，6（10）：5-6.

[2] 熊力凡.临床检验基础，2004：226-232.

[3] 徐万鹏.《中国肿瘤医师临床实践指南丛书》.北京大学医学出版社，2012：252-266.

[4] 赵钢，粟秀初.进一步提升神经系统感染性疾病的诊断与治疗水平.中国现代神经疾病杂志，2011，11：483-485.

酶检测法 第12篇

1 黄曲霉毒素的检测方法

1.1 薄层色谱法(TLC)

薄层色谱法(TLC)法是最为传统的检测黄曲霉毒素的常用方法。其原理在于样品提取后进行浓缩,然后通过薄层分离后在一定波长下的紫外光照射,此时不同的黄曲霉毒素会产生不同现象,B1和B2会产生紫色荧光,而G1和G2会产生绿色荧光[2]。接着根据TLC板上的荧光的最低检出量进行定量。张鹏等用此方法测定了黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。该法对设备和试剂需求不大,费用低,适用大量样品的分离和筛选。

1.2 酶联免疫法(ELISA)

酶联免疫法(ELISA)法是利用抗体抗原反应中的特异性和显色反映的高效催化作用进行结合而成的一种免疫分析技术[3]。它首先将抗原或抗体固定在在载体表面,仍然保持其免疫学的活性,再进行酶标记,被固定的抗原或者抗体依靠共价键和酶连接形成结合物,此时既要有免疫学活性又要有酶学活性。最后进行显色反映,酶标记物与相应的抗原或抗体反映,然后再加入底物显色液,通过颜色的深浅可以得知免疫反映的程度。廖妍彦等[4]利用此法在对黄曲霉毒素M1的测定上取得成效,该法灵敏度高、特异性强、干扰小且检测成本低。

1.3 高效液相色谱(HPLC)

王恒玲等[5]利用缩合反应将含羧基的氧化石墨烯材料和含有氨基的二氧化硅球偶联,合成新型符合材料称为二氧化硅-氧化石墨烯复合物(GO-Si O2)用以作为固相萃取剂,依靠线柱后衍生-高效液相色谱法定量检测黄曲霉毒素B1、B2。该法只需要简单的离心操作就能达到分离净化的目的,而且可以快速的富集提取液中的黄曲霉毒素,具有简单、萃取效率高的优点,实际样品的加标回收率在81.4%~105.3%,相对标准偏差为1.3%~8.6%,说明此方法具有良好的可靠性和稳定性。

1.4 微柱筛选法(MS)

微柱筛选法即MS法是利用甲醇-水-石油醚或者三氯甲烷提取处理样液,微柱管内的硅镁型吸附剂层可以吸附样液中的黄曲霉毒素,在一定的紫外光照下,将层析后的样品柱与已有的黄曲霉毒素标准液体柱进行比较[6,7]。如果黄曲霉毒素在测量范围内(约5~10μg/kg)则会有蓝紫色光环,其荧光强度与黄曲霉毒素的存在,在一定范围内为正比关系。如果没有蓝紫色光环则说明未检测到黄曲霉毒素即无法确定黄曲霉毒素达标还是超标。此方法仅能检测黄曲霉毒素的总数,无法测定其黄曲霉毒素究竟是B1、B2、G1或者G2,所以对此方法进行研究并不多。

1.5 免疫传感器

免疫生物传感器以免疫生物分子作为识别元件,将抗体或者抗原固定到感受器表面,发生免疫识别反应后的免疫复合物与产生的物理或化学信号相关联,由换能器将其转化为待测物质活度有关的物理化学信号(电信号,光信号等)再通过二次放大输出信号,进行换算实现物质的检测[8]。

方银军等[9]将氧化石墨烯、2,5-二(2-噻吩)-1-对苯甲酸吡咯和氯金酸一次电沉积于金电极表面,再用1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二压胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺作为活化剂,将黄曲霉毒素B1抗体与到点高分子模的羧基共价键合,最后用1,3-二正丁基咪唑六氟磷酸盐离子液体作为修饰电极表面的溶液。此方法的灵敏度、稳定性和重现性都优于现有文献的报道,可以用于实际样品的痕量测定。实际测试中的加标回收率在97.2%~106.8%具有较高的准确度。

1.6 加压毛细管电色谱-激光诱导荧光法(p CEC-LIF)

加压毛细管电色谱(p CEC)是一种新兴的微分离技术,有着卓越的高柱效、高选择性、高分辨度、快速分离及样品和试剂用量少的特点[10]。但是由于重现性不足,这在一定程度上制约了其发展,万青云等[11]使用激光诱导荧光检测器(LIF)与p CEC仪器联用建立了黄曲霉毒素检测方法。在实际样品测量中,加标回收率在90%~112%有较高的准确性。该方法提高了分析速度、分离能力、检测的灵敏度,而且样品用量只需要10-9L,适用于痕量检测,既减少了浪费又节约了检测成本,具有较高的推广价值。

1.7 黄曲霉毒素快速检测卡

快速检测卡基于免疫胶体金技术,利用氯金酸在还原剂的作用下,会聚合成一定大小的金颗粒,形成带有负电的疏水胶体溶液[12]。

拜发公司提供的Aflacard B1和Afllacard Total速测卡可以用于黄曲霉毒素B1和B2的定性或半定量检测,Aflacard B1检测限度为2、5、10、15 ng/g,而Afllaccard Total则可以检测黄曲霉毒素的总量,限度为4~30 ng/g[13]。其中每条快速检测卡可以同时对2份样品进行检测,通过目测对面质控线和检测线的颜色变化,从而直接得知样品中的黄曲霉毒素的存在情况。在不配备仪器等条件下,在30 min内可以获得结果,使用后的检测卡应该置于黑暗处,可以进行长期保存。其中卡盒在2~8℃可稳定保存6个月左右,其制造成本不高,一个样品的检测费用仅在几十元左右。

1.8 高光谱最优波长及费希尔(Fisher)判别分析法

褚璇等[14]发现高光谱技术具有快速、非破坏、像素级信息获取等优点,通过一台高灵敏度相机,一台高光谱仪,一个蔡司透镜和2个500 W的卤钨灯组成可以采集400~1000 nm范围的反射光谱仪器。图像用ENVI遥感图像处理平台进行处理,将玉米颗粒上滴有黄曲霉毒素溶液的地方选择为感兴趣区,得出像素点在各波长下的平均反射率,再通过Matkab2012软件进行分析处理,然后通过费希尔判别法(Fisher)以最小误判率为标准,建立以所选最优波长为输入变量的判别模型。该方法验证五种不同浓度黄曲霉毒素的玉米颗粒判别正确率可以达到80.9%具有价高的准确性。可作为识别田间霉变农作物黄曲霉代谢产生毒素的技术基础。

2 展望

黄曲霉毒素种类繁多,有B1、B2、G1和G2还有衍生的M1、M2等等,毒性强。所以为了避免黄曲霉毒素的污染造成的人员和经济损失,应该阻断其进入人类的食物链,其次把控好检测这道管卡,活用以上的检测方法杜绝黄曲霉毒素污染的食品进入社会。

(1)快速检测卡法其操作步骤简便易懂,而且具有快速,灵敏度高,有极强的特异性,且比较稳定,对仪器的依赖性低,制作成本低廉等各种优点。此方法的普及性远超其它检测黄曲霉毒素的方法,但其准确度和精确度并不能令人感到满意,需要改进研究。

(2)电化学免疫传感器将化学和物理,生物等知识进行多方面的结合,具有多方面的优点,而且可以进行现场检测对大型分析仪器的依赖性低,在线检测是今后黄曲霉毒素分析检测方法实践的主要思路。

(3)加压毛细管电色谱等现代仪器的检测方法应该更多的去探究,争取找出更容易普及,而且测定准确,测定环保的检测方法。