狂犬病病毒范文

狂犬病病毒范文（精选9篇）

狂犬病病毒 第1篇

关键词：伪狂犬病病毒,猪伪狂犬病

伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus, PRV) 是引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒 (猪除外) 及脑脊髓炎为主要特征的一种疾病[1]。已表明约有35种动物可被感染, 该病属于典型且极难防疫的自然性疾病之一。猪是该病毒最主要的贮存宿主和传染源。l9世纪在美国 (1813) 、瑞士 (1849) 报道了这种类似于牛狂犬病的“伪狂犬病”。1902年由匈牙利学者Aujeszk’s证明本病不是狂犬病;1910年证明病原为病毒;1934年确定为疱疹病毒。1961年以前, 伪狂犬病对猪还是相当温和的, 病例也比较少见, 在70年代初期, 流行有所增加。现在已有40多个国家报道40多种动物感染该病[2]。中国自1947年首次报道猫病例以来, 目前已扩大到全国二十几个省市, 严重威胁着养猪业的发展。专家们估计, 其造成的经济损失仅次于口蹄疫和猪瘟。

1 病原

伪狂犬病病毒在分类学上, 国际病毒分类委员会 (ICTV) 第六次报告中将其列入疱疹病毒科、疱疹病毒亚科、水疱病毒属成员。病毒粒子为椭圆形或圆形。二十面体立体对称。位于细胞核内无囊膜的病毒粒子直径约l10~150 nm, 位于胞浆内带囊膜的成熟病毒粒子的直径约为150~180 nm, 囊膜外面有呈放射状排列的8~10 nm长的纤突, 其数目和配置情况尚不清楚, 衣壳壳粒的长度约12 nm, 宽9 nm, 其空心部分的直径约4 nm[3]。

PRV能在鸡胚CAM上生长, 并产生白色斑和出血, 鸡胚脑内接种感染。病毒可在鸡胚成纤维细胞, 猪、绵羊、兔、牛、犬、猫、猴和马等肾原代细胞, 猪、牛睾丸原代细胞以及Hela、He P2、PK15、BHK21等传代细胞上增殖。

病毒60℃可存活30 min, 70℃可存活10~15 min, 80℃存3 min, 100℃迅速死亡。在50%甘油中可存活154 d而不损失毒价[4]。

2 PRV基因组结构

PRV基因组为线状双股DNA, 大小约150 kb, DNA基因组中G+C的含量高达73%, 可编码100种蛋白质, 分子质量为9000ku, 基因组由独特的长节段 (UL) 、独特的短节段 (US) 、内部倒转重复序列 (IRs) 、末端倒转重复序列 (TRs所组成。目前已完成了PRV 50多个基因的定位和测序, 这些基因覆盖了PRV基因组的9O%。

3 PRV囊膜糖蛋白的主要种类及功能

PRV是通过病毒粒子表面的糖蛋白才能进入宿主细胞。感染过程包括吸附宿主细胞, 与宿主细胞胞浆膜融合, 核衣壳直接进入胞浆等重要步骤, 囊膜糖蛋白 (glycoprotein) 也参与病毒从感染细胞扩散到未感染细胞过程。囊膜蛋白g B、g D、g E、g H等各种糖蛋白在PRV感染细胞及免疫过程中起着重要作用。

PRV糖蛋白g B是病毒囊膜的主要成份之一, 能够刺激机体产生补体依赖性和补体非依赖性的中和抗体。g B基因在疱疹病毒成员中属最保守的糖蛋白基因, 在不同的疱疹病毒之间, g B蛋白的功能可以相互取代。PRV糖蛋白g E与g I是以非共价键形式结合成g E/g I复合物的, 这种复合物是病毒的功能成分, 并与g L之间相互作用介导病毒的释放。g H糖蛋白分子质量为95ku, 含N一甘露糖, 为病毒复制所必需的结构蛋白, 对于病毒侵入靶细胞或感染细胞与邻近细胞的融合, 以及在小鼠神经系统中的增殖均是必需的。PRV糖蛋白g D是病毒感染必需的结构蛋白, 是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一, 参与病毒的穿透过程, 是一种重要的中和抗原[5]。

4 诊断方法

4.1 血清学检测方法

4.1.1 凝集性试验:

(1) 血凝 (hemagglutination, HA) 和血凝抑制 (hemagglutination inhibition, HI) :此法将抗原或抗体致敏于红细胞表面, 用以检测相应的抗体或抗原, 在与相应抗体或抗原反应时出现肉眼可见的凝集, 从而做出诊断。

(2) 琼脂免疫扩散试验 (agar immunodifusion, AGID) :本方法利用了抗原和抗体可在琼脂中自由扩散, 相遇即可发生肉眼可见的沉淀的原理。

(3) 对流免疫电泳试验 (COllnterc11~~rent immunoeleetrophoresis, CIE) :大部分抗原在碱性溶液中带负电荷, 在电场中向正极移动, 而抗体球蛋白带电荷弱, 在琼脂电泳时, 由于电渗作用向相反的负极泳动。如果将抗体置正极, 抗原置负极, 则电泳时抗原抗体相向泳动, 在两孔间形成沉淀带。

(4) 乳胶凝集实验:乳胶凝集实验利用抗原和抗体特异性结合的特点, 将抗原先用乳胶包被, 然后再与相应血清反应, 如果几分钟内凝集反应呈现阳性, 则判为伪狂犬病感染。

4.1.2 微量血清中和试验 (MSN) 。

4.1.3 标记抗体技术:

(1) 免疫荧光技术 (FA) :免疫荧光技术最早由Coons1941年创建, 是一种用荧光素对抗体或抗原进行标记, 然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。

(2) 颗粒浓缩免疫荧光试验 (particle coticentration fluorescence immunoassay, PCFIA) :

以PRV抗原包被的聚苯乙烯乳胶颗粒和荧光标记的二抗在96孔板中检测待检血清, 再加入荧光标记的抗单克隆抗体检查酶标单抗与抗原的结合是否被阻断, 判定时用荧光检测仪进行全自动读数。

(3) 免疫酶技术 (immunoperoxidase) :Ducatelle R等应用免疫过氧化物酶技术对61头有神经症状猪的脑、扁桃体、口鼻粘膜、唾液腺、肺、肝、肾、胰脏、脾、肾上腺进行检测, 发现以脑和扁桃体的阳性检出率最高。

(4) 放射免疫技术 (radioimmunoassay, RIA) 。

(5) 免疫组化技术。

(6) 放射免疫技术 (RIA) :放射免疫技术是将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术, 由Yalowh和Berson于1959年共同创建, 可精确测定体液中的微量活性物质。

(7) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) :

双抗体夹心:双抗体夹心EUSA是PR临床诊断和进出口检疫的一种简便而可靠的方法, 可用于测定大分子量的抗原。

单抗夹心ELISA:单抗夹心EUSA将单抗的特异性与EUSA方法相结合起来, 使其特异性和敏感性大大提高。

其它ELISA:Prud, homme等将PRVg D基因插入杆状病毒载体中进行表达, 制备重组抗原, 建立了竞争EU-SA即c EUSA, 用该法能检测到PRV感染14 d后猪血清阳转的情况。

4.2 分子生物学技术

4.2.1 核酸探针技术:

核酸探针因其特异性强、敏感性高等特点而被应用于PRV的诊断。

4.2.2 聚合酶链式反应 (PCR) :

该技术是上世纪80年代建立起来的一项体外酶促扩增DNA新技术, 可用于PRVD-NA的扩增, 也适用于检测PRV潜伏感染猪, 并且能快速鉴别PR疫苗毒与野毒。该法灵敏度高, 特异性强, 采取病料方便。

4.3 限制性核酸内切酶分析

用限制性核酸内切酶对病毒DNA进行酶切, 可以呈现不同的带型, 从而做出诊断[6]。

5 防治

5.1 疫苗免疫

用疫苗进行免疫接种是预防PR的重要手段之一, 然而疫苗毒株的生物安全性始终存在问题, 即使是病毒极弱的突变株仍可在猪群中传播, 这些突变株还可与其它野生型毒株重组, 进一步传播本病, 给防治工作增加了困难。

5.1.1 灭活苗:

油佐剂灭活苗的免疫效果较好, 攻毒保护率为100%, 适用于初发病猪场。免疫能减轻临床症状, 但不能控制传染和排毒。每头猪肌肉注射2 m L, 均需免疫2次。仔猪首免 (生后7~10日龄) 后2~3周产生免疫, 二免 (断乳后) 后1周产生高教价抗体, 保护期可达1年。本苗可能会导致个别猪发生过敏反应, 可用肾上腺素等抗过敏药物进行抢救性治疗。

5.1.2 弱毒苗:

哈兽研所生产的弱毒冻干苗对猪安全有效, 现已推广应用。该苗仅限于疫区和受威胁区的猪场。成年猪和孕猪产前1个月注射2 m L, 所生仔猪免疫力可持续3~4周。仔猪初免注射0.5 m L, 断奶后再次注射l m L;3月龄以上仔猪和架子猪注射l m L。注苗后6 d产生免疫力, 保护期为1年[7]。

5.1.3 基因工程苗:

(1) 亚单位疫苗:亚单位疫苗是利用PRV保护性抗原基因, 在原核或真核系统中表达所获得的产物制成的疫苗。

(2) 核酸疫苗:伪狂犬病毒DNA疫苗试验结果表明, 核酸疫苗不仅可以诱发体液免疫, 也可产生细胞免疫, 而且保护时期较长, 有的可达1年以上。

(3) 基因工程缺失苗:

第一代基因缺失疫苗:PRV的TK基因是主要的毒力基因, 对其进行缺失便成为第一代基因缺失疫苗。这种TK缺失的疫苗与以前在有致突变剂存在下在细胞上筛选得到的弱毒疫苗有一个最显著的特点, 就是不存在毒力返强, 因而更加安全。

第二代基因缺失疫苗:第二代基因缺失疫苗除了在TK基因引入了一个缺失外, 在非编码必需糖蛋白的基因内引入了一个新的缺失, 或插入一个报告基因, 这样得到的突变株就不能产生被缺失的糖蛋白, 因而免疫动物就不能产生相应的抗体, 因此可以通过血清学方法将免疫接种猪与自然感染野毒的猪相区别。这也是第二代基因缺失疫苗的最显著特点。还值得注意的是有些糖蛋白的缺失, 可以进一步降低毒力。

(4) 重组疫苗:猪的重组疫苗大多是以疱疹病毒为载体的活载体疫苗, 目前, 以伪狂犬病毒为载体的重组PRV疫苗研究广泛[8]。

5.2 发病后控制措施

发病后对猪舍立即进行封锁, 防止猫、犬等进入猪场, 在垒场进行灭鼠。发现死鼠要及时无害化处理。在疫区, 阳性和受威胁的猪场, 将病猪与未发病母猪和仔猪进行隔离, 紧急注射疫苗, 先注射健康猪, 后注射病猪, 对未出现症状的乳猪和仔猪注射抗伪狂犬病高免血清。对病死猪无害化处理, 淘汰病猪和阳性猪, 产出的死胎和胎衣及时捡出深埋。搞好环境卫生, 对猪舍、用具、垫草、粪水、吃剩的饲料等用3%~5%石炭酸、3%来苏儿或2%苛性钠消毒, 对产仔母猪乳头用0.5%高锰酸钾液清洗消毒, 每天1次, 连续20 d。在疫情控制后 (往往造成潜伏感染) 仍然要加强免疫, 尤其是孕猪, 每厢6个月注射1次疫苗, 产前3个月应加强免疫1次。

5.3 治疗

目前对本病尚无治疗办法。对并发细菌、放线菌或支原体混合感染的猪场可用抗生素等药物进行综合治疗, 配合应用猪伪狂犬病弱毒苗做紧急预防注射, 同时要搞好兽医卫生防疫工作[7]。

参考文献

[1]殷震, 剜景华.动物病毒学[第二版].北京:科学技术出版社, 1997

[2]王勤.猪伪狂犬病病毒gE基因的研究进展.畜牧与兽医, 2002, l0[34]:42～43

[3]朱连德, 姚建聪, 方树河, 张志国.猪伪狂犬病及其控制.当代畜禽养殖业2005, 56～58

[4]张国红.猪伪狂犬病的诊断与控制.中国动物保健, 2001, 27[5]:18～19

[5]陈懿, 聂奎.伪狂犬病病毒囊膜蛋白gD研究进展.动物医学进展, 2006, 27[6]:20～23

[6]陈平, 罗淑琴.伪狂犬病病毒实验室诊断方法研究进展.畜禽业, 2006, 202[7]:10～12

[7]吕爱军, 谢三星.猪伪狂犬病的诊断与防治研究进展.当代畜牧, 2000, [5]:26～27

狂犬病病毒检测方法的研究进展 第2篇

狂犬病病毒(RV)属弹状病毒科、狂犬病病毒属,病毒呈杆状,一端扁平,另一端钝圆,长180～250 nm,宽75 nm,基因组为12 kb的单股负链RNA,从3′端至5′端依次为N、NS、M、G、L 五个结构基因,分别编码五种结构蛋白,即核蛋白(N)、磷酸化蛋白(NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G) 和转录酶蛋白(L).

作 者：蔡翼虎 王玉芳 严雪仙 作者单位：蔡翼虎(桐乡市畜牧兽医局,浙江桐乡,314500)

王玉芳,严雪仙(衢州市衢江区畜牧兽医局)

“健康犬能传播狂犬病毒”被否定等 第3篇

由于“健康犬能携带并传播狂犬病毒”的认识普遍存在，不少被犬所伤者长期处在极度恐惧中。中国CDC(疾病预防控制中心)传染病预防控制所与美国CDC、贵州省CDC、美国佐治亚大学等单位联合研究得出的结论，否定了“健康犬能传播狂犬病毒”之说。该报告发表在最新一期国际人兽共患病权威杂志《媒介源性及人兽共患病》上。

领衔此项研究的张永振研究员介绍，研究现场选在狂犬病高发的贵州省安龙县。该县2004年狂犬病发病率高达10／10万以上，疫点周围犬群中狂犬病毒流行率较高。2005年，研究人员在安龙县狂犬病疫点周围采集从未用兽用狂犬病疫苗免疫过的153只犬的唾液，并对其中的15只可疑犬隔离观察6个月，观察期间每10天采集可疑犬的唾液。研究发现，这些犬在6个月的观察期中没有出现狂犬病临床症状。实验室内采用免疫组化及IkT-PCR方法检测其唾液、脑组织及其他器官组织，也没有发现狂犬病毒抗原或病毒RNA，仅其中的两只犬的血液抗狂犬病毒中和抗体阳性。该结果表明，健康犬不传播狂犬病毒。

张永振告诉记者，2004年世界卫生组织发布的狂犬病专家咨询会技术报告称，“伤人的犬或猫在暴露发生后至少10天保持健康，就可以终止人暴露后的预防处理措施”。国外有研究表明，犬在出现狂犬病临床症状前3天的唾液中可以检测到狂犬病毒；75％的犬患狂犬病后仅存活4天，所有患狂犬病的犬在出现临床症状10天内死亡。

张永振说，过去10年，我国有研究者在外观健康犬的脑组织中检测或分离到狂犬病毒，这些犬可能处在感染后的潜伏期。因此，在被犬类动物所伤后需要及时到犬伤门诊进行暴露后的正确预防处理，但人若暴露10天后，攻击犬只仍健康无异常现象，则可相信人感染狂犬病毒的几率几乎为零。(健康报网)

艾滋病毒部分流行规律被发现

日前，由中国科学院武汉病毒研究所杨荣阁研究员领衔完成的研究表明，我国流行的HIV－1B’毒株较其他主要HIV－1流行毒株传播速度更为迅速。但是，近年来该毒株的进化速度放缓。

HIV-1B’毒株是亚洲流行的HIV-1三大主要毒株之一，在我国中部地区采供血HIV感染者中广泛流行。B’毒株与其他HIV－1亚型毒株结合，催生了多种HIV－1重组型病毒。这些重组病毒影响范围广泛，对亚洲国家艾滋病防控工作造成十分严重的危害。因此，B’毒株的起源、分子进化和分子特征及B’毒株对亚洲HIV－1生物多样性的影响等研究，对艾滋病预防有着十分重要意义。杨荣阁领导的研究小组通过对所有HIV-1B’的系统进行化和分子特征进行研究，阐明了HIV-1B’毒株起源于上世纪80年代中期，B’毒株较其他主要HIV-1流行毒株传播更加迅速。但近年来，该病毒的进化速度减缓。此外，研究人员还发现了B’毒株特征性氨基酸位点，并推断其中一些位点可能与B’毒株的传播特征有一定关系。

该研究对B’毒株这一亚洲流行毒株进行了全面分析，为HIV在亚洲的分子流行病学研究及相关毒株的疫苗研究等提供了参考。该相关研究成果发表在《艾滋病》杂志上。(健康报网)

熏衣草是治牙“好帮手”

英国伦敦大学国王学院的最新研究成果表明，熏衣草可起到帮助口腔疾病患者安神的作用。

据英国广播公司目前报道，以前人们都知道晒干的熏衣草不但可以让衣柜香气扑鼻，还具有缓解头痛、失眠等功效。而现在伦敦大学国王学院的研究人员经过340例临床实验后发现，熏衣草的香气还具有为口腔疾病患者治疗前安神的效果。

报道说，患者被分为两组，分别在两个诊室接受治疗，其中一个诊室点着含有熏衣草香精的蜡烛，另一个则没有点这种蜡烛。结果发现，闻到熏衣草香气的一组患者中感觉紧张的人数比另外一组少得多。

报道说，不少患者惧怕治牙，少数患者甚至一坐上牙医诊室的椅子就会昏倒。

领导这项实验的科学家梅塔莎·克里希迪马说：“很多牙病患者由于害怕牙医使用的器械而选择有病也不治疗，这就是为什么找到一个能缓解患者紧张心理的方法非常重要的原因。”(新华网)

鱼、肉、奶均有助于预防脑萎缩

一项最新研究显示，鱼、肉和奶含有一种重要的维生素，有助保护老年人记忆力，预防脑萎缩。

英国《每日电讯报》最近一期《神经病学》杂志刊发的研究结果报道，这些食物中含有维生素B12，是合成红血球的重要因素，有助于保持神经系统健康。

英国牛津大学研究人员调查107位年龄介于61岁至87岁之间的老年人，发现不少老年人血液中维生素B12含量较低；且维生素B12含量低的人与含量高的人相比，患脑萎缩的几率高6倍。

英国慈善机构阿耳茨海默氏症研究信托基金负责人丽贝卡·伍德告诉媒体记者：“这项研究表明，多食用含维生素B12的肉类、鱼类或牛奶并均衡饮食有助于保护大脑。动物肝脏和壳类动物尤其富含维生素B12”

狂犬病病毒 第4篇

关键词：多重PCR方法,猪伪狂犬病病毒,猪圆环病毒2型

猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型常呈混合感染, 在临床上以受感染母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪为主要特征, 同时能导致疫苗免疫失败, 诱发继发感染[1]。目前, 对于病毒性疫病的诊断一般采用病原分离鉴定和血清学方法[2], 但这些方法存在操作繁琐、耗时长、敏感性差等不足, 当猪群感染多种病原时, 难以应用常规方法进行早期快速检测和鉴别诊断。而多重PCR方法可以在一份样品中同时检测出多种病原, 对多种疾病进行同步诊断, 具有快速、敏感、特异、经济等优点。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞

猪伪狂犬病病毒 (PRV) 、猪圆环病毒2型 (PCV2) 由福建省农业科学院畜牧兽医研究所畜病室惠赠。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、琼脂糖购于宝生物工程 (大连) 有限公司, Dneasy Blood&tissue kit购于德国Qiagen, Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒购于美国Axygen, Endo-free Plasmid Mini KitⅠ质粒提取试剂盒购于美国Omega, TOPO TA Cloning Kit购自厦门英韦创津生物科技有限公司。

1.3 引物设计

根据Genbank上发表的序列, 引物选择PRV g B基因、PCV2 ORF2基因为其扩增靶序列, 借助Primer Premier 5.0及DNAstar软件筛选设计出符合多重PCR要求的2对引物[3,4]。引物由厦门英韦创津生物科技有限公司合成, 合成引物于-20℃保存。引物序列如下:

Su HV-1:5’CGATGGGGTAGTAGTGCT3’, 3’GAACCTCTGCGTGAACGG5’;

PCV2:5’GAGTAGTTTACATAGGGGTCA3’, 3’ATTGCGGAGGAACCTATGC5’。

1.4 病毒DNA的提取

根据Dneasy Blood&tissue kit提取试剂盒说明书操作步骤进行病毒核酸的提取。

1.5 m PCR方法的建立

m PCR反应在50μL体系中进行, 包括10PCR bufer (Mg2+Free) 5μL, 2.5 m M d NTP 4μL, Mg Cl225 m M 3μL、单个病毒的各自上下游引物10μM各1μL, Taq TM DNA聚合酶5 U/μL0.25μL, 用去离子水补足50μL, 于PCR仪上扩增。反应条件:95℃预变性5 min, 95℃30 s, 57.9℃45 s, 72℃1 min, 35个循环;72℃延伸10 min。取5μL扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2 试验结果

2.1 PCR产物的克隆、鉴定结果

对PRV、PCV2的重组质粒进行PCR鉴定, PRV、PCV2分别为373 bp与430 bp, 与预期目的片段一致。将测序结果与Genbank上收录的序列进行BLAST比较, 结果表明扩增片段分别为各自病毒的特异性条带。

2.2 m PCR反应最佳退火温度的确定

将混合好的反应体系在不同的退火温度条件下进行m PCR反应 (见图1) , 退火温度分别为60.0℃、59.3℃、57.9℃、56.2℃、54.9℃、54.0℃、53.5℃。从图1可以看出, m PCR的最佳退火温度为57.9℃。

2.3 单重PCR及多重PCR的特异性试验

扩增产物的大小, 由琼脂糖凝胶电泳试验确定, 结果表明PRV为373 bp, PCV2为430 bp, 见图2-图3。以双蒸水、PRV、PCV2、PPV、PRRSV、CSFV病毒为模板分别进行m PCR反应, 结果表明双蒸水、PPV、PRRSV、CSFV病毒均未扩增出条带, 见图4。

注:M为DL 1000 DNA Marker, 1为60.0℃, 2为59.3℃, 3为57.9℃, 4为56.2℃, 5为54.9℃, 6为54.0℃, 7为53.5℃。

注:M为DL 2000 DNA Marker, 1为10-2倍稀释, 2为l0-3倍稀释, 3为10-4倍稀释, 4为10-5倍稀释, 5为l0-6倍稀释, 6为10-7倍稀释, 7为10-8倍稀释。

注:M为DL 2000 DNA Marker, 1为10-2倍稀释, 2为l0-3倍稀释, 3为10-4倍稀释, 4为10-5倍稀释, 5为l0-6倍稀释, 6为10-7倍稀释, 7为10-8倍稀释。

注:M为DL 1000 DNA Marker, 1为灭菌水, 2为PRV, 3为PCV2, 4为PRV+PCV2, 5为PPV, 6为PRRSV, 7为CSFV。

2.4 PCR扩增的敏感性试验

将提取的PRV、PCV2质粒用岛津的紫外风光光度计UV-1800中的DNA定量功能测定核酸浓度, 经过十次重复试验得出PRV质粒核酸浓度为161.75 ng/μL, PCV2质粒核酸浓度146.94 ng/μL。用灭菌双蒸水进行l0倍倍比稀释, 取10倍倍比稀释的病毒质粒做模板分别进行单个病毒PCR反应和进行病毒m PCR反应, 检测其敏感性。结果表明, 在单个病毒的PCR反应中, 单个病毒PCR反应检测限量为1.4710-8~1.6210-6 ng;在病毒m PCR反应中, 病毒m PCR反应的检测限量为1.4710-6~1.6210-4ng, 见图5。

注:M为DL 1 000 DNA Marker, 1为l0-1倍稀释, 2为10-2倍稀释, 3为10-3倍稀释, 4为l0-4倍稀释, 5为10-5倍稀释, 6为10-6倍稀释, 7为10-7倍稀释。

3 讨论

在m PCR反应中, 引物的设计至关重要, 决定m PCR反应成功与否[5]。本研究从Genbank上分别下载了21株PCV2基因和2株PRV基因, 通过DNAstar进行比对, 引物的设计是针对以上2种病毒各自保守的区域, 分别为PCV2 ORF2基因及PRV g B基因, 在最保守的区域设计引物。多重PCR扩增时, 反应体系中各组分的浓度及反应条件直接影响试验效果。因此, 在多重PCR扩增前需对PCR扩增的各种反应条件进行优化, 使每个病毒的引物长度为18~21 bp, G+C含量在40%~55%, Tm值尽量一致, 避免引物二聚体及发卡结构。在敏感性试验中, 通过将单个病毒PCR的敏感性与m PCR的敏感性进行比较, 结果表明, 4种病毒的m PCR敏感性相对减少了2个稀释倍数, 但其核酸检测可至1.47l0-6~1.6210-6ng, 仍然具有很强的敏感性。而多重PCR特异性试验结果显示, 对双蒸水、猪细小病毒 (PPV) 、猪繁殖与障碍综合征病毒 (PRRSV) 、猪瘟病毒 (CSFV) 多重PCR的扩增结果均为阴性, 作为临床上猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。

参考文献

[1]曲光刚, 沈志强, 管宇, 等.PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用[J].中国动物检疫, 2009, 26 (1) :23-25.

[2]李维华, 任慧英, 刘文, 等.PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PeR的应用研究[J].西北农业学报, 2008, 17 (3) :12-15.

[3]Fengxiong Yue, Shangjin Cui, Chaofan Zhang, et al.A multiplex PCR for rapid and simμLtaneous detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, porcine pseudorabies virus, and porcine reproductive and Genes, 2009, 38:392-397.

[4]Hirohito Ogawa, Osamu Taira, Takuya Hirai, et al.Multiplex PCR and mμLtiplex RT-PCR for inclusive detection of majorswine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections[J].Journal of Virological Methods, 2009, 160 (1/2) :210-214.

狂犬病病毒糖蛋白功能的研究进展 第5篇

1 糖蛋白的结构与变异

G基因编码的糖蛋白是由524个氨基酸残基组成的, 相对分子质量为67 000, 占病毒总蛋白的42%, 不同毒株间的氨基酸序列平均同源性在90%左右, 此蛋白最不稳定, 其N末端有长19个氨基酸残基的信号肽, 成熟后的糖蛋白具有505个氨基酸残基, 分为 3 个区域:膜外区即抗原区 (1～439位) , 位于病毒颗粒包膜的表面;穿膜区即跨膜区 (440～461位) , 为连续性疏水区, 该区与糖蛋白固定在病毒双脂膜上有关;膜内区 (462～505位) 为羧基末端, 位于病毒包膜内表面, 提供M和N相互作用的位点。

狂犬病病毒G基因相差较大, 同源性在82%～90%之间。对我国的一些狂犬病野毒株和实验室固定毒的G基因序列研究表明[3], 野毒株之间和野毒株与固定毒或生产疫苗用毒株之间均存在一定差异。对核苷酸和氨基酸的同源性分析结果表明, 上海分离株 (SBD07) 及广西分离株 (CGX89-1) 核苷酸与氨基酸的同源性分别为93.1%和87.7%。SBD07株及CGX89-1株与疫苗株3aG相比, 同源性分别为88.5%、84.5%, 将G基因分段比较差异更明显, 跨膜区的同源性分别为72.7%、74.2%;膜内区的同源性分别为53.3%、72.7%。上述2株野毒与固定毒CVS株的G基因核苷酸序列同源性分别为87.2%、83.1%。2株宁夏分离株之间的核苷酸同源性较高为99.9%, 氨基酸同源性为99.6%, 但与3aG株的同源性则只有81.9%和90.5%, 而与分离时间较短的CTN株的同源性则较高, 分别为85.9%和92.4%。可见, 国内几株流行野毒与目前使用的3aG疫苗株间G基因具有明显差异。钱爱东等[4]对我国不同动物来源的3株狂犬病病毒野毒株糖蛋白的主要功能区进行了研究, 发现同地不同动物分离的BRV与MRV的G基因的同源性只有81.1%;对CTN株糖蛋白的序列研究表明, CTN株和不属于同一基因型的Mokola病毒同源性最低, 只有55.1%, 而且膜外区与我国分离的野毒的同源性最高, 可达97%, 明显高于与其他毒株的同源性。推测氨基酸序列同源性, CTN株与我国野毒株相距最近, 而我国疫苗株和CVS株与我国野毒株都相距最远。唐青等[5]的研究表明, 广西的2株野毒株和CTN的同源性高于3aG株, 将固定毒和野毒分为2支, 而且在抗原性方面, 疫苗株之间的同源性很高, 减毒株都在333位发生了氨基酸残基的替换, 而野毒及其他保留了原有毒力的固定毒株在此位点仍为R残基, 推断333位Arg是决定狂犬病病毒毒力的主要位点。

2 糖蛋白与免疫的关系

糖蛋白能诱导机体产生中和性抗体, 具有保护作用。糖蛋白上存在3个中和抗体结合位点:GⅠ、GⅡ和GⅢ, 糖蛋白抗原性变化常由GⅡ位点上34～42位、147位、184位和198～200位氨基酸及GⅢ位点上330～334位氨基酸的改变造成, 其中Ⅲ和Ⅱ抗原部位是病毒与中和抗体结合的主要部位。抗原位点GⅡ比较保守, 由第34～42位和第198～200位氨基酸残基通过二硫键连接形成;抗原位点GⅢ是连续的, 由330～338位氨基酸残基组成, 存在3个紧密相接的表位, 其中1个表位可能是不连续的。在GⅢ部位的333位精氨酸和GⅡ部位的198位赖氨酸被其他氨基酸取代, 结合抗体的能力和毒力均会发生改变。例如, 糖蛋白330位的赖氨酸和333位的精氨酸被取代则会明显降低糖蛋白和神经瘤细胞之间的相互作用[6]。狂犬病病毒固定毒致病性的丢失, 也常伴随着第333位精氨酸的改变。通过对抗特异性糖蛋白单克隆抗体突变株中和作用的研究表明, 只要1个氨基酸被替代, 病毒便可逃避特异性单克隆抗体的中和。表位Ⅰ由231位氨基酸残基产生;表位Ⅵ由264位氨基酸残基形成;表位V由254～275位氨基酸残基组成, 是个线性表位, 在目前所测序的毒株中均保守, LHKFRSDE是其核心, L被P、Q或V及D被更小的氨基酸A、G取代后, 可明显增强与单抗的结合效果, 说明D有空间位阻效应。中性非极性氨基酸L被带负电的氨基酸D、E取代后, 丧失与单抗的结合活性。同时研究还发现, 具有极性且不带电荷的S被疏水或带负电荷氨基酸取代后, 也丧失了与单克隆抗体的结合活性[7]。

糖基化影响糖蛋白的生物学活性。抗原位点Ⅲ和抗原位点Ⅱ是狂犬病病毒受体糖蛋白 (RGP) 正确折叠和运输的必需部分。每个糖蛋白分子上有3～4个糖基化位点, 不同毒株的数量和位置不完全相同。目前, 测序的所有狂犬病病毒株都存在319位糖基化位点, 表明此位点与受体糖蛋白正确折叠和加工运输有关。基因Ⅰ型的多数毒株37位被糖基化, 另外一些毒株的158, 202, 204, 247位也是糖基化位点。糖基化可阻止新合成受体糖蛋白链不可逆聚集, 并且变得易溶, 在分子伴侣和折叠酶共同作用下, 形成正确的结构并装配到病毒粒子表面[8]。糖基化的蛋白基本序列为Asn-X-Ser/Thr, 受体糖蛋白糖基化位点第3位氨基酸为Thr时, 其糖基化效率较丝氨酸高2～3倍[9]。糖链类型也影响受体糖蛋白与受体的结合或识别活性, 当N-糖链变为O-糖链后, 受体糖蛋白中的α-螺旋结构会发生明显改变, 失去与受体的结合能力。此外, 糖蛋白的结构受pH值的影响, 在一定的pH值范围内, 受体糖蛋白的结构会发生可逆性改变。在碱性环境下, 受体糖蛋白呈天然态 (N态) , 可与某些单抗及膜受体结合。糖蛋白的糖基化对免疫至关重要, 利用原核表达系统表达的糖蛋白未糖基化, 表达产物仅有反应原性而无免疫原性, 不能诱导产生中和抗体, 而在具有糖基化功能的真核细胞中表达, 可得到具有良好免疫效果的产物[10]。

3 糖蛋白与细胞凋亡有关

Prehaud C等[11]研究发现, 减毒的狂犬病病毒ERA株可使人细胞发生半胱天冬酶 (caspase) 依赖的细胞凋亡。进一步研究还发现, 细胞凋亡的诱生与病毒抗原的特殊分布有关。为了确定细胞调亡机制, 对建立转基因的T淋巴细胞系进行了研究, 结果表明是ERA株的糖蛋白而不是核蛋白的表达导致了细胞凋亡。用重组的狂犬病病毒感染人细胞, 只有包含非致病性狂犬病病毒糖蛋白的重组狂犬病病毒能够触发人细胞的凋亡。显然, 狂犬病病毒株诱导调亡的能力主要取决于糖蛋白, 狂犬病病毒致病力与细胞凋亡及狂犬病病毒糖蛋白表达水平呈负相关。但深入研究表明, 在狂犬病病毒感染细胞或动物中, 细胞凋亡与狂犬病毒糖蛋白表达水平呈正相关, 狂犬病病毒感染导致凋亡细胞的死亡, 还可以增强抗病毒免疫反应。

4 糖蛋白与狂犬病病毒细胞受体的关系

羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定 第6篇

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

无菌采集病死羊的脑、肝脏和脾脏等组织病料与5倍体积灭菌生理盐水充分混合、捣碎、碾磨均匀后反复冻融3次,10 000 r/min离心10 min,取上清液经0.45μm滤膜过滤,-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

柱式病毒基因组DNA提取试剂盒、柱式胶回收试剂盒、柱式质粒小量提取试剂盒,购自北京百泰克生物科技有限公司;LA Taq酶、p MD18-T载体、DL-2 000 Marker,购自宝生物工程(大连)有限公司;猪源伪狂犬病病毒阳性血清,购自广州测迪生物科技有限公司;荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记羊抗猪Ig G抗体,购自上海樊克生物科技有限公司。

1.3 病毒的分离

取生长状态良好的BHK-12细胞,弃去培养基,用灭菌PBS液洗涤3次,然后加入处理好的病料样品1.0 m L,混合均匀后置于培养箱(37℃,CO2体积分数为5%)中孵育90 min,加入细胞维持液,至细胞出现典型的细胞病变(CPE)后收获病毒,连续传代3代。

1.4 分离毒株的病毒含量(TCID50)测定

将分离毒株第3代病毒液依次倍比稀释成1×10-1~1×10-8,将8个梯度病毒液分别接种于96孔细胞培养板中的单层BHK-12细胞中,每个稀释度接种8孔,置于培养箱(37℃,CO2体积分数为5%)中孵育,72 h后观察细胞病变,按Reed-Muench法计算分离毒株的TCID50。

1.5 分离毒株的鉴定

1.5.1 中和试验(VN)

将分离毒株第3代病毒液用灭菌PBS液100倍稀释,然后与等量伪狂犬病病毒阳性血清室温下中和1 h,接种于单层BHK-12细胞中,同时分别接种100倍稀释的病毒液和灭菌的PBS液作为阳性对照和阴性对照,通过观察细胞病变确定伪狂犬病病毒阳性血清对分离毒株是否具有中和作用。

1.5.2 间接免疫荧光试验(IFA)

将分离毒株第3代病毒液接种于单层BHK-12细胞中,培养24 h后弃去培养液,PBS液洗涤3次,冰甲醇4℃固定30 min,PBS液洗涤3次,伪狂犬病病毒阳性血清37℃孵育1 h,PBS液洗涤3次,FITC标记羊抗猪Ig G抗体37℃孵育1 h,PBS液洗涤3次,于荧光显微镜下观察结果。

1.5.3 PCR扩增与序列比对

按照病毒基因组DNA提取试剂盒说明书提取分离毒株第3代病毒液的基因组DNA。以提取的DNA为模板,参照王香玲等[5]的方法进行PCR扩增。上游引物序列:5'-CG-GCTTCCACTCGCAGCTCTTCTC-3';下游引物序列:5'-TGTGGGTCATCACGAGCACGTACAGC-3'。扩增长度为388 bp。反应体系:2×GC Buffer 12.5μL,d NTP 4μL,上、下游引物各0.5μL,LA Taq酶0.5μL,DNA 2μL,水5μL。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,62℃退火45 s,72℃延伸45 s,35个循环;72℃延伸10 min;4℃终止反应。

PCR扩增结束后取扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行片段大小的鉴定。将大小正确的特异性扩增条带利用胶回收试剂盒进行回收纯化,纯化产物连接至p MD18-T载体,转化至DH5α感受态细胞,质粒提取试剂盒提取克隆质粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定,将测序结果与GenBank中登录的伪狂犬病病毒基因组序列进行比对。

1.6 动物攻毒试验

1.6.1 感染小鼠

将分离毒株第3代病毒液用灭菌生理盐水做10倍稀释后,背部皮下注射昆明系小白鼠5只,0.1 m L/只,同时取5只小白鼠接种灭菌生理盐水作为对照,观察10 d。

1.6.2 感染家兔

将分离毒株第3代病毒液用灭菌生理盐水做10倍稀释后,背部皮下注射新西兰白兔5只,0.2 m L/只,同时取5只家兔接种灭菌生理盐水作为对照,观察10 d。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

病料样品经病毒分离,结果见280页彩图1。

接种组织病料的BHK-12细胞24 h后即开始出现细胞聚集、变圆、拉网等明显细胞病变,至72 h细胞已大面积脱落。收获病毒,将其命名为QH株,连续传3代后-20℃保存。

2.2 病毒含量测定结果

用Reed-Muench法测定分离株病毒的TCID50,结果为1×1010.12/L。

2.3 VN试验结果

100倍稀释的分离毒株与伪狂犬病病毒阳性血清作用后,接种的BHK-12细胞未出现细胞病变,说明伪狂犬病毒阳性血清对分离毒株具有中和作用。

2.4 IFA试验结果

将分离毒株接种于BHK-12细胞后,分别利用伪狂犬病病毒阳性血清和FITC标记羊抗猪Ig G作为一抗和二抗,进行IFA试验,结果见280页彩图2。在280页彩图2中可以观察到明显的绿色特异性荧光,说明分离毒株与伪狂犬病毒阳性血清具有特异性免疫学反应。

2.5 PCR扩增与序列比对结果

分离毒株的PCR扩增产物在388 bp处具有特异性扩增条带(见图3),大小与王香玲等[5]的报道完全相符。将此片段利用胶回收试剂盒回收纯化,利用p MD18-T载体构建克隆质粒后测序。序列比对结果表明其为伪狂犬病病毒特异性核苷酸序列。

M.DL-2 000 Marker;1.分离毒株PCR扩增产物;2.水对照。

2.6 动物攻毒试验结果

2.6.1 小鼠感染试验

接种分离毒株的5只小白鼠24 h后开始出现食欲下降、精神沉郁、被毛稀疏粗乱等症状,至48 h开始出现奇痒,撕咬注射部位,至72小时时5只小白鼠已全部死亡。接种生理盐水的对照组无明显变化。

2.6.2 家兔感染试验

接种分离毒株的5只家兔24 h后陆续出现厌食、高热、奇痒等临床症状,至72小时时5只家兔全部死亡。剖检死亡兔,可见脑部、心脏、肝脏、肾脏等实质器官均具有病变。接种生理盐水的对照组无明显变化。

3 讨论

经病毒分离、中和试验、间接免疫荧光试验、PCR扩增、测序比对以及动物攻毒试验确定该羊场此次爆发的疫病是由伪狂犬病毒感染引起。致病原确定后,及时使用猪伪狂犬病弱毒冻干疫苗对羊群进行紧急免疫接种,疫苗免疫后除3只感染较严重的绵羊死亡外,其余绵羊未出现发病和死亡现象,疫情得到了有效控制,同时也表明猪伪狂犬病弱毒疫苗对羊伪狂犬病同样具有良好的预防免疫效果,临床中可广泛使用。

本研究成功分离鉴定了一株具有高度致病性的羊源伪狂犬病病毒。该分离毒株的获得为进一步深入研究羊源伪狂犬病病毒的分子生物学特性以及开发新型疫苗奠定了基础,同时丰富了青海省伪狂犬病病毒感染的流行病学资料,为研究羊群伪狂犬病病毒感染的分子流行病学奠定了基础,为青海省羊伪狂犬病防治措施的制订提供了参考依据。

一般山羊对伪狂犬病病毒的抵抗力较绵羊强,故山羊常表现慢性反应,而绵羊则常常表现急性反应,本研究亦证实绵羊对伪狂犬病病毒的抵抗力较差,发病急,感染率高。近年来,随着我国规模化、集约化养羊业的快速发展,羊感染伪狂犬病的病例逐渐增多[6,7,8],究其原因,可能是因为我国规模化养殖的快速发展与动物疫病防控技术相对滞后之间存在一定的矛盾。故笔者建议应提高对羊伪狂犬病的重视,加强羊伪狂犬病的日常监测,制订切实可行的免疫程序并确保免疫效果,逐步调和规模化快速养殖与疫病防控滞后之间的矛盾,保障我国养羊业健康与稳定发展。

参考文献

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[2]MORENO A,SOZZI E,GRILLI G,et al.Detection and molecular analysis of Pseudorabies virus strains isolated from dogs and a wild boar in Italy[J].Vet Microbiol,2015,177(3/4):359-365.

[3]覃绍敏,刘金凤,陈凤莲,等.广西野生动物伪狂犬病毒感染情况调查及gE基因序列分析[J].中国预防兽医学报,2015,37(5):344-347.

[4]吕建军,张兰清,英措,等.山羊感染伪狂犬病毒的诊断[J].畜牧与兽医,2014,46(8):92-94.

[5]王香玲,沈诗源,焦连国,等.猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽药杂志,2014,48(11):5-9.

[6]李峰,张文通,王玉茂,等.波尔山羊羔羊伪狂犬病的诊治[J].黑龙江畜牧兽医,2013(04下):96-97.

[7]张克山,刘永杰,孔汉金,等.绵羊伪狂犬病病毒的鉴定及序列分析[J].中国兽医科学,2013,43(03):221-224.

一株猪伪狂犬病病毒的分离鉴定 第7篇

1 材料与方法

1.1主要试剂

BHK - 21 细胞、PRV阳性毒株,由预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存; DNA提取试剂盒,由山东省滨州畜牧兽医研究院自制; 荧光抗体,购自中国兽医药品监察所; DNA提取试剂盒,购自天根生化科技( 北京) 有限公司。

1. 2 病料的处理

无菌采集病猪的脑组织,将PBS与脑组织按照5∶1比例混合,用匀浆器研磨混合液制成乳剂,反复冻融3 次,5 000 r/min离心10 min; 取上清液,用0. 22 μm滤膜过滤除菌,冻存,备用。

1. 3 病毒分离培养

待BHK - 21 细胞长满单层后,弃掉细胞培养液,按照10% 比例将处理好的无菌病料接种至BHK - 21细胞,37 ℃吸附1 h; 更换为2% DMEM细胞维持液,置37 ℃恒温培养箱中继续培养,每天观察细胞病变( CPE) ,并记录; 待85% 细胞出现细胞病变时,将病毒感染细胞冻存,备用。连续传代5 代,同时设正常细胞对照。

1. 4 直接免疫荧光试验

取第5 代的病毒培养液接种长满单层的BHK -21 细胞,待细胞出现病变时,通过直接免疫荧光试验对分离的病毒进行鉴定。

1. 5 PCR扩增

根据Gen Bank上的伪狂犬病病毒基因设计合成1 对特异性引物,引物序列: P1 5' - CACGGAG-GACGAGCTGGGGCT - 3',P2 5' - GTCCACGC-CCCGCTTGAAGCT - 3'。预期扩增长度为217 bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

取分离病毒的第5 代培养物,冻融3 次后用DNA提取试剂盒提取DNA。经PCR扩增、1% 琼脂糖凝胶电泳后观察结果。同时设阴性对照和阳性对照。将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序并比对。

1. 6 动物试验

取分离病毒的第5 代细胞培养物,过滤,颈部皮下注射成年健康家兔( 购自青岛康大兔业发展有限公司) ,1 m L/只,另取1 只家兔接种细胞维持液作为空白对照。每天观察家兔的精神状态。

1. 7 分离病毒的TCID50测定

待BHK - 21 细胞长满单层时,将分离病毒的第5 代细胞培养物作连续10 倍稀释,每个稀释度接种8孔,100 μL/孔,并用PBS作阴性对照,置37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变情况并记录,按照Reed - Muench法计算TCID50。

2 结果与分析

2. 1 病毒分离培养的结果

无菌处理的病料接种BHK - 21 细胞24 h后就能出现细胞病变灶,见293 页彩图1A; 接种48 h后可出现明显的细胞病变。病变特征主要表现为: 细胞膨大变圆、聚堆拉网,最后脱落,见293 页彩见图1B。

2. 2 直接免疫荧光试验鉴定结果

荧光显微镜观察可见,在病变细胞的细胞核中可见到特异性黄绿色荧光,见293 页彩图2A,而正常对照细胞的细胞核中无荧光,见293 页彩图2B。

2. 3 PCR扩增鉴定结果

经PCR扩增,得到大小为220 bp的目的条带,结果见图3。将PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果见图4。

1.DNA分子质量标准;2.阳性对照;3.待检样品;4.阴性对照。

经BLAST比对,该序列与NCBI中的伪狂犬病病毒基因组的同源性为96% ~ 98% 。因此,判定该分离毒株为伪狂犬病病毒。

2. 4 动物试验鉴定结果

家兔接种第5 代病毒培养物24 ~ 48 h后出现伪狂犬病的典型症状,主要表现为注射部位奇痒,家兔啃咬注射局部,导致皮肤溃烂,家兔尖叫、口吐白沫,最终死亡,见293 页彩图5。对照组家兔健康。

2. 5 分离病毒的TCID50测定结果

通过倒置显微镜观察,接毒后第6 天待细胞出现明显病变后统计病变细胞数并按照Reed - Muench法计算TCID50,结果为1 × 107． 25TCID50/0. 1 m L。

3 讨论

猪伪狂犬病病毒具有泛嗜性,能在BHK - 21、Vero、PK - 15 等多种组织细胞内增殖［3］。将伪狂犬病病毒接种单层细胞后,病变出现的时间与病毒量多少有关,最早可在18 小时出现细胞病变,细胞病变最明显的时期为接种后48 ~ 96 h［4］。本试验将无菌处理后的病料接种于BHK - 21 细胞进行病毒分离,接种后24 小时即可出现病变灶,接种后48 小时可出现明显的细胞病变,主要表现为细胞膨大、变圆、聚堆,最后拉网脱落。感染细胞经直接免疫荧光试验、PCR检测及动物试验鉴定均呈阳性,由此确定本试验分离出的病毒为猪伪狂犬病病毒,该病毒能在BHK - 21细胞上很好地生长并引起明显的细胞病变,第5 代病毒培养物的病毒毒价能达到1 × 107． 25TCID50/0. 1 m L。本次试验结果表明,山东省利津县某猪场的疫情的确由猪伪狂犬病病毒所致。

病毒分离是诊断该病最为确切的方法,病毒分离时,首先要无菌采集病死动物的脑及内脏组织,研磨匀浆离心,取上清液过滤后可以接种动物或细胞培养物,根据细胞病变特征再进行详细鉴定。

猪伪狂犬病病毒JL株的分离、鉴定 第8篇

1 材料与方法

1.1 病料的采集及处理

对养殖户送检的10头死亡仔猪进行病理剖检, 取脑组织用 pH值为7.2的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液 (PBS) 研磨后, 制成 1∶10 的乳悬液, 5 000 r/ min 离心30 min;取上清液, 经0.22 μm微孔滤膜过滤后, 置 -20 ℃保存, 备用。

1.2 病毒的分离

取幼仓鼠肾细胞BHK-21细胞用生长液 (含有10%新生牛血清的MEM培养基) 培养, 置于37 ℃、5%CO2 培养箱中, 待细胞长成单层时, 弃培养液, 接种处理好的病料上清液, 37 ℃吸附1 h;加入维持液 (含有2%新生牛血清的MEM培养基) , 37 ℃静置培养, 每日观察是否有细胞病变。 同时设正常对照细胞。接种病料的细胞若72 h 内未出现细胞病变 (CPE) 连续盲传5代以上, 若10代仍无病变视为病毒分离阴性;若出现细胞病变, 置- 20 ℃冻存, 备用。

1.3 电镜负染观察

将病毒液 (用出现明显病变的细胞培养) 冻融3次, 以5 000 r/min离心15 min;取上清液滴于铜网上, 吸附5 min后, 用1%磷钨酸 (pH值为6.5) 负染, 置透射电镜下观察并拍照。

1.4 病毒毒力的测定

将出现明显病变的细胞培养毒冻融3次后离心, 取上清液接种BHK-21细胞大量繁殖病毒。将该病毒接种96孔细胞培养板中的 BHK-21细胞, 48 h后观察细胞病变并计数, 用Reed-Muench 法计算其组织细胞半数感染量 (TCID50) 。

1.5 动物回归试验

取4只家兔 (1.5～2 kg, 由吉林大学实验动物中心提供) 分为2组:试验组3 只, 对照组1只。将分离获得的BHK-21细胞培养毒经皮下注射给试验组家兔, 接种剂量为100TCID50/只;对照组用同样的方法接种相同剂量的无菌生理盐水。观察病毒的致病性, 同时进行病原分离。

1.6 PCR 检测

参考GenBank 公布的 PRV 病毒 gE 基因核酸序列保守区设计了1对引物, 扩增片段长度为 399 bp, 引物序列为上游引物P1 5′-TCGACTGATGCCGCGCGTGG-3′, 下游引物P2 5′- TCGGCCGCGGTGGCGACGAG-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取病毒液提取基因组制备模板, 经PCR扩增目的片段, 并用琼脂糖凝胶电泳观察。

1.7 PRV-gE 基因的序列分析

将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T 载体, 经酶切鉴定后送 Invitrogen 公司进行序列测定。用DNAStar软件分析核苷酸序列, 与GenBank 中登录的PRV毒株gE基因相应序列 (登录号为EF552427.1、AY249861.1、AY173124.1、AF171937.1、FJ605135.1) 进行比较分析。

2 结果

2.1 病毒的分离结果

取猪脑组织匀浆物接种BHK-21细胞连续盲传到第 6 代仍没有明显的细胞病变, 盲传到第 7 代时出现典型的CPE, 表现为细胞变圆、 融合、脱落等 (见封三彩图1A) , 对照培养的BHK-21细胞生长正常 (见封三彩图1B) 。

2.2 电镜观察结果

细胞培养液经负染后电镜观察, 可见2种形态的病毒粒子, 均呈球形或椭圆形, 一种多呈中空状, 部分呈致密核芯状, 病毒粒子的直径为90～150 nm, 另一种病毒粒子有衣壳和囊膜, 直径为140～210 nm (见封三彩图2) 。

2.3 毒力测定结果

纯化培养的病毒接种BHK-21细胞, 测定的TCID50为1106.35/0.1 mL。

2.4 动物回归试验结果

试验组家兔在接毒48 h后开始发病, 食欲减退, 狂躁不安, 体温升高, 注射部位脱毛、溃烂, 家兔不断撕咬接种部位。接毒后60小时家兔四肢麻痹, 卧地不起, 最后衰竭死亡。剖检病死家兔无明显的肉眼变化。对照组家兔则健康。用PCR和病毒分离方法检测死亡家兔的脑组织, 结果为病毒阳性。

2.5 PCR 检测结果

纯化的病毒PCR 扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果扩增出大小约为399 bp 的特异性目的片段, 与预期目的基因片段大小一致 (见图3) 。

1.DL-2 000 Marker;2.PRV。

2.6 PRV-gE基因的扩增与序列分析结果

回收纯化PCR扩增得到的特异性片段, 经克隆测序后, 与GenBank 中登录的其他PRV相应序列相比 (EF552427.1、AY249861.1、AY173124.1、AF171937.1、FJ605135.1) , 其核苷酸同源性均达99%。

3 讨论

从吉林省公主岭市某猪场分离的病毒株能引起接种家兔奇痒、四肢麻痹、死亡, 有典型的伪狂犬病临床症状;病毒在BHK-21细胞上导致细胞变圆、 融合, 有疱疹病毒特征;病毒培养物在电镜下可见2种形态的病毒粒子, 一种病毒粒子的直径为90～150 nm, 另一种病毒粒子有衣壳和囊膜, 直径为140～210 nm;PCR 反应扩增出预期的DNA 片段, 符合伪狂犬病病毒特征。这些结果证明试验分离的病毒株为伪狂犬病病毒, 将该病毒命名为JL株, 经PCR鉴定该毒株为携带gE基因的野毒株。

伪狂犬病病毒具有泛嗜性, 能在许多细胞中增殖[5], 形成合胞体, 继而出现细胞溶解及脱落。本试验用幼仓鼠肾细胞BHK-21增殖PRV, 病毒感染48 h后就出现明显的细胞病变, 此时收毒测定病毒毒力, 病毒效价可达1106.35 TCID50/0.1 mL, 说明BHK-21可作为PRV的敏感细胞, 用于细胞的增殖和超微结构的观察。

2004年, 陆慧君等[6]分离到PRV CC株, 电镜观察发现病毒粒子呈圆形, 有囊膜, 直径为120～180 nm。2005年, 边传周等[7]分离到PRV河南株, 电镜观察发现病毒粒子的核心直径约为75 nm, 核衣壳直径为105～110 nm。本研究观察到未成熟伪狂犬病病毒粒子多呈中空状, 有的核芯致密, 病毒粒子的直径为90～150 nm, 成熟的病毒粒子直径为140～210 nm, 病毒粒子的外层具有囊膜, 与资料报道基本一致, 表明国内不同分离株PRV形态特征无显著差异。细胞超微结构观察结果表明, 未成熟的病毒粒子多数分布在细胞核中, 也有少数的病毒分布在细胞浆中, 呈结晶排列或分散存在, 还能与电子密度均匀的物质构成包涵体[8]。

由于仔猪患伪狂犬病后的神经临床症状及病理变化与猪瘟、猪血凝性脑脊髓炎、乙脑有相似之处, 很容易误诊, 有时可能是混合感染的, 只有通过实验室的病原鉴定才能确诊。因此, 在遇到2月龄以内仔猪发生神经症状的疾病时, 为了避免误诊, 应对伪狂犬病、猪瘟、猪血凝性脑脊髓炎、乙脑多种病原进行实验室鉴定。

参考文献

[1]BOELAERT F, DELUYKER H, MAES D, et al.Prevalence ofherds with young sows seropositive to pse (Aujeszky’s disease) innorthern Belgium[J].Prev Vet Med, 1999, 41 (4) :239-255.

[2]王生祥, 吴雅玲.猪伪狂犬病血清学调查[J].中国兽医杂志, 2003, 39 (7) :25.

[3]刘道新, 谈志祥, 邱立新, 等.规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染的血清学调查[J].中国兽医杂志, 2004, 40 (7) :18-19.

[4]张维谊, 鞠厚斌, 周锦萍, 等.上海及周边地区散养猪主要病毒病的流行状况调查[J].动物医学进展, 2008, 29 (7) :36-38.

[5]BASKERVILLE A, MCFERRAN J B, DOW C.Aujeszky’s diseasein pigs[J].Vet Bull (London) , 1973 (43) :465-480.

[6]陆慧君, 贺文琦, 高丰, 等.猪伪狂犬病毒CC株的分离与鉴定[J].吉林畜牧兽医, 2004 (7) :25-27.

[7]边传周, 王惠杰, 陈创.猪伪狂犬病毒河南株的分离与鉴定[J].河南农业科学, 2005 (3) :69-70.

狂犬病病毒 第9篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细菌和病料

猪伪狂犬病病毒 (Bartha k61) 、猪细小病毒, 由原中国人民解放军军需大学病毒室惠赠;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎巴氏杆菌、沙门杆菌, 由佛山科学技术学院预防兽医研究室提供。病料采自佛山、惠州、东莞、高要、阳江、肇庆、四会、深圳、三水、新兴、鹤山等地。

1.1.2 其他试剂

TE (pH值为8.0) :10 mmol/L Tris-Cl (pH值为8.0) , 1 mmol/L EDTA (pH值为8.0) , 50TAE 242 g, 冰醋酸57.1 mL, 0.5 mol/L EDTA (pH值为8.0) 100 mL, 加三蒸水至1 000 mL。病料DNA抽提裂解缓冲液:0.01 mol/L Tris- HCl (pH值为 8.0) , 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 0.5%SDS。Blend Taq酶, TOYOBO公司产品;dNTPs (2.5 mmol/L) 、DL-2 000 Marker、琼脂糖, 宝生物工程 (大连) 有限公司产品;PCR产物胶回收试剂盒, Omega公司产品;无水乙醇、氯仿等, 均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

用DNASIS 分析伪狂犬病病毒gD基因保守区序列的同源性, 用引物设计软件Primer Premier 3.0设计引物, 引物长度为18～25 bp, 扩增片段长度为200～700 bp。引物序列为PR1 5′-cacggaggacgagctggggct -3′ , PR2 5′-gtccacgccccgccgcttgaagct -3′, 扩增片段长度理论值为217 bp。引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

1.2.2 病毒

DNA的抽提 取伪狂犬病病毒细胞培养液100 μL或疑似伪狂犬病病毒感染病料 (肺脏) 20 mg于匀浆器中, 加入500 μL病料DNA抽提裂解缓冲液后充分研磨, 倒入EP管, 加1 μL蛋白酶K (20 mg/mL) , 56 ℃水浴4 h;98 ℃水浴5 min灭活蛋白酶K, 冰浴5 min;加入等体积酚-氯仿, 旋涡振荡1 min使之充分混匀, 静置10 min后12 000 g离心10 min ;取上清液, 重复加酚-氯仿抽提;离心, 取上清液加入等体积异丙醇, 旋涡混匀, 静置10 min 后12 000 g离心10 min ;弃上清液, 加入75%乙醇1 mL, 7 500 g离心10 min;弃酒精, 真空干燥5 min, 加入20 μL双蒸水溶解所抽提DNA。

1.2.3 PCR检测方法的初步建立

反应体系:10Blend Taq酶缓冲液2.5 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 2 μL, DNA模板2 μL, 引物 (P1、P2等体积混合物, 终浓度为0.5 μmol/L) 1 μL, Ex Taq酶 (5 U/μL) 0.25 μL, ddH2O 17.25 μL, 总体积25 μL。

PCR反应过程:94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。

1.2.4 PCR反应合适条件的确定

退火温度分别为53.2, 55.5, 58.1, 60.8, 6.02, 63.2 ℃, 引物终浓度分别为0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 μmol/L, Mg2+浓度分别为1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 mmol/L, 按1.2.3体系进行PCR扩增。

1.2.5 敏感性试验

选择1.2.4得到的PCR合适反应条件, 取100 μL 猪伪狂犬病病毒细胞毒制备DNA模板, 将DNA模板进行110-1～110-5稀释, 按1.2.3测定的PCR合适条件进行敏感性检测。

1.2.6 特异性试验

将PCR产物克隆测序或直接测序 (由上海博亚生物技术公司和上海基康公司完成) , 测序结果与NCBI GenBank收录序列进行同源性比较。同时, 按上述优化的PCR条件检测伪狂犬病病毒参考毒株模板, 并设立猪细小病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎巴氏杆菌和沙门杆菌等对照。

1.2.7 重复性试验

按优化后的PCR合适反应条件对采自感染猪伪狂犬病病毒猪场的5个病料样品进行重复检测, 并设伪狂犬病病毒参考毒株阳性和阴性对照。

1.2.8 临床病料检测

按上述试验优化PCR反应体系对从25个猪场采集的210份病料进行检测。

2 结果

2.1 PCR反应合适条件的测定结果 (见图1, 2)

1～5.温度分别为 53.2, 55.5, 58.1, 60.8, 62.0 ℃; C.空白对照; M. DL-2 000 Marker。

1～6.引物浓度分别为 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 μmol/L;M. DL-2 000 Marker。

2.2 敏感性试验结果 (见图3)

1～5.模板稀释度分别为110-1, 110-2, 110-3, 110-4, 110-5; C. 空白对照; M. DL-2 000 Marker。

2.3 特异性试验结果 (见图4、表1)

M.DL-2 000 Marker;1. 猪伪狂犬病病毒; 2. 猪细小病毒; 3. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;4. 副猪嗜血杆菌;5. 猪肺炎巴氏杆菌; 6. 沙门杆菌;C.空白对照。

2.4 重复性试验结果 (见表2)

2.5 临床病料检测结果 (见表3)

3 讨论

3.1 关于猪伪狂犬病病毒的PCR检测条件的优化

对于常规的PCR, Mg2+浓度一般在0.5～5 mmol/L之间, dNTPs浓度一般要求为0.15～0.3 μmol/L, Taq酶用量一般为0.5～1.25 U/μL。试验选用对其影响较大的退火温度、引物浓度进行优化。

退火温度:退火温度一般以-5 ℃为起点, 以2 ℃梯度递增。在理想状态下, 退火温度足够低, 以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高, 以减少引物与模板的非特异性结合。从图1可知, 温度在53.2～62.0 ℃之间均能有效扩增, 但在55.5 ℃以下有非特异扩增条带, 表明猪伪狂犬病病毒的PCR检测最适退火温度为58～62 ℃。

引物浓度:引物浓度一般为0.2～1.2 μmol/L, 在一定范围内, 引物浓度越高, PCR产量越高, 但引物浓度过高也容易造成非特异性扩增。从图2可知:当引物浓度为0.2 μmol/L时不能有效扩增条带;当引物浓度为 0.4～1.2 μmol/L时均能有效扩增。表明猪伪狂犬病病毒的PCR检测最适引物浓度为 0.4～1.2 μmol/L。

3.2 关于猪伪狂犬病病毒的PCR检测敏感性、特异性和重复性

用于诊断的PCR要求针对目的病毒基因保守区设计引物。猪伪狂犬病病毒只有1个血清型, 基因序列较保守。目前, 用于PCR诊断的猪伪狂犬病病毒基因片段主要有gB、gD、gG以及gE等, 其中gD基因是病毒的主要中和抗原基因, 并且参与病毒感染的吸附和穿入过程。因此, 试验选取gD基因作为伪狂犬病PCR诊断的主要候选基因, 并根据其基因序列保守区同源性片段特点设计猪伪狂犬病病毒的PCR上、下游引物, 长度为18～25 bp, 扩增200～700 bp, 扩增片段长度理论值为217 bp, 提高了PCR扩增敏感性和特异性。

衡量PCR敏感性的主要指标是已知含毒量的标准病毒液的检测最低稀释度。试验优化建立的PCR反应体系中, 取100 μL猪伪狂犬病病毒细胞毒制备DNA模板, 将DNA模板进行110-1～110-5稀释, 按1.2.3的PCR反应过程进行试验。从图3可知, 猪伪狂犬病病毒的 PCR检测敏感度为110-5稀释DNA模板 (100.2TCID50) , 表明试验所建立的PCR检测方法敏感性良好。

PCR特异性的主要指标是是否扩增非预期大小DNA片段。试验选择已确定的PCR最适反应条件, 用猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎巴氏杆菌、沙门杆菌和阳性、阴性对照进行特异性检测。从图4可知, 只有猪伪狂犬病病毒单项PCR能扩增出预期大小的DNA片段, 引物对猪伪狂犬病病毒毒株得到了阳性结果, 而对照病毒、细菌均为阴性, 未能扩增出任何非特异性DNA片段。同时, 将PCR产物克隆测序结果与NCBI公布序列进行同源性分析, 结果表明同源性为98%～100% (见表1) , 表明优化建立的PCR检测方法具有良好的特异性。

对采自感染猪伪狂犬病病毒猪场的5个病料样品进行PCR重复检测, 结果表明, 第1次、第2次检测结果完全符合, 5个样品猪伪狂犬病病毒都为阳性。表明试验所建立的PCR检测方法具有良好的重复性。

3.3 关于猪伪狂犬病病毒的PCR临床检测初步应用

运用优化建立的PCR诊断猪伪狂犬病病毒感染敏感性高、特异性强且快速, 极大地提高了对猪伪狂犬病病毒的检出率, 适用于临床诊断、进出口检疫。有人用PCR方法分别对猪伪狂犬病病毒野毒株、鼻拭子样品进行检测, 通过扩增gD基因序列检测出猪伪狂犬病病毒。尽管PCR具有敏感性高、可进行活体检测等优点, 但其特异性受引物设计合理性的影响, 引物设计不合理则会增加非特异性反应, 甚至不能扩增出特异性片段。值得探讨的是Wheeler等从阳性康复猪血清检出了病毒DNA, 但却分离不到病毒。提示在临床上运用PCR检测时, 还应注意区分疫苗免疫猪还是野毒感染猪。

运用优化建立的猪伪狂犬病病毒的 PCR检测方法检测了25个猪场共计210份伪狂犬病疑似病料, 结果从24个猪场检出猪伪狂犬病病毒阳性, 猪场检出率为96%;猪伪狂犬病病毒阳性率达60.5% (127/210) , 猪伪狂犬病病毒感染阳性率最高为100%, 最低为0, 提示广东省部分地区猪伪狂犬病病毒感染较严重, 不同地区存在明显差异。

摘要：为了建立敏感性高、特异性高、重复性好的猪伪狂犬病病原的PCR检测方法, 试验根据初步建立的猪伪狂犬病病毒 (PRV) 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 检测方法, 对其PCR反应条件进行了优化, 并对25个猪场210份可疑猪伪狂犬病病毒感染的病料进行了检测。结果表明:25个猪场有24个检出PR阳性, 猪场检出率为96%;猪伪狂犬病病毒总体感染阳性率达60.5% (127/210) , 感染阳性率最高为100%, 最低为0。