可溶性受体范文

可溶性受体范文（精选7篇）

可溶性受体 第1篇

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1重症肺炎组2013年6月~2014年8月在广东省佛山市顺德区桂洲医院(以下简称“我院”)呼吸内科住院的45例重症肺炎患者,男28例,女17例,年龄48~ 76岁,平均(59.63±11.85)岁。 诊断标准符合2007年美国胸科协会/感染协会制订的重症肺炎标准[3]。 (1)主要标准:1需有创的机械通气;2感染性休克。(2)次要标准:1多肺叶浸润;2呼吸频率≥30次/min;3定向力障碍或意识障碍;4尿素氮≥20 mg/d L;5低体温(T< 36℃ );6Pa O2/Fi O2≤250;7白细胞减少(<4×109/L); 8血小板减少(<10×109/L);9低血压需液体复苏。 入选患者符合1项主要标准或3项次要标准。 剔除严重免疫缺陷性疾病患者(如HIV感染)及使用≥1 mg/(kg·d) 强的松等激素超过1个月的患者。 随访治疗后的患者,28 d内生存的患者归为存活组(n=27),28 d内死亡的患者归为死亡组(n=18),剔除观察期少于7 d的患者。

1.1.2普通肺炎组收集同期在我院呼吸内科住院的普通肺炎患者20例,男13例,女7例,年龄51~72岁, 平均(58.84±7.81)岁。诊断标准符合我国2006年社区获得性肺炎的诊断和治疗指南标准[4]。

1.1.3正常对照组收集同期在我院体检中心体检的健康人员20名,其中男12名,女8名,年龄47~66岁, 平均(55.30±8.23)岁。

所有入选者均告知研究目的,签署知情同意书,并经我院医学伦理委员会批准。 三组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P > 0.05),具有可比性。

1.2方法

1.2.1标本的收集分别留取正常对照组、普通肺炎患者入组当天,以及重症肺炎患者(存活组和死亡组)入组后第1、4、7天,出院或死亡当天的诱导痰,所有诱导痰经离心处理后吸取上清液存于EP管,置于-80℃ 冰箱,用于s TREM-1和s CD163的测定。

1.2.2诱导痰的采集所有重症肺炎患者均为有创机械通气,吸净气道内痰液后,用30 g/L高渗盐水5 m L进行雾化诱导,雾化15 min后在下气道吸取痰液。 正常对照组、普通肺炎患者先清洁口鼻腔后,用30 g/L高渗盐水5 m L超声雾化15 min,双氧水漱口,咳痰1 g以上。

1.2.3指标的测定诱导痰中的s TREM-1、s CD163水平的测定均采用ELISA法,试剂盒购置美国R&D公司。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用LSD-t检验,多组间比较采用ANOVA方差分析。计数资料用率表示,组间比较采用 χ2检验。 应用受试者工作特征曲线(ROC)分析重症肺炎的诊断效能。 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1入组第1天三组诱导痰sTREM-1、sCD163水平变化

重症肺炎组的诱导痰s TREM-1、s CD163水平均显著高于普通肺炎组、正常对照组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。 普通肺炎组s TREM-1、s CD163水平均高于正常对照组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。 见表1。

注: 与正常对照组比较,*P < 0.05; 与普通肺炎组比较 ,#P < 0.05;s TREM-1:可溶性髓样细胞触发受体-1;s CD163:可溶性清道夫受体

2.2重症肺炎患者存活组与死亡组诱导痰sTREM-1水平变化

存活组的诱导痰s TREM-1水平经治疗后逐渐下降,出院当天低于入组第1、4、7天的水平(P < 0.05)。 死亡组诱导痰s TREM-1水平在入组第1、4、7天均处于高水平,在死亡当天水平最高,显著高于入组第1、 4、7天水平(P < 0.05)。 死亡组诱导痰s TREM-1水平在同时间点均高于存活组(P < 0.05)。 见表2。

注:与本组第 1 天比较,*P < 0.05;与本组第 4 天比较 ,#P < 0.05;与 7 天比较,▲P < 0.05;与 ,**P < 0.05;s TREM-1:可溶性髓样细胞触发受体-1

2.3重症肺炎患者存活组与死亡组诱导痰sCD163水平变化

存活组的诱导痰s CD163水平呈下降趋势,出院当天水平明显低于入组第1、4、7天的水平,差异均有统计学意义(P < 0.05)。 死亡组诱导痰s CD163水平随着时间的推移呈增高趋势,在死亡当天水平高于入组第1、4、7天水平(P < 0.05),入组第7天的水平高于第1、4天水平,差异均有统计学意义(P < 0.05)。 死亡组诱导痰s CD163水平在同时间点均高于存活组, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。 见表3。

2.4sTREM-1、sCD163诊断重症肺炎的ROC曲线

ROC曲线结果 : s TREM - 1 、 s CD163的曲线下面积 (AUC) 分别为0.828 (95% CI:0.733 ~0.923)、0.765 (95%CI:0.665~0.865), 联合检测s TREM-1、s CD163的AUC为0.846(95%CI:0.761~0.931),诊断效能较高(见图1)。 以最大约登指数(Youden's Index)作为标准,cut off值为42.91时,s TREM-1诊断重症肺炎的敏感性为78.4%, 特异性为69.2%, 阳性预测值为69.5% , 阴性预测值68.7% ;cut off值为193.13时 , s CD163诊断重症肺炎的敏感性为65.7%, 特异性为92.3%,阳性预测值为82.6%,阴性预测值为53.7%。

注:与本组第 1 天比较,*P < 0.05;与 4 天 ,#P < 0.05;与 7 天比较,▲P < 0.05;与 ,**P < 0.05;s CD163:可

3讨论

重症肺炎是一种常见的呼吸系统的危急重症,易导致多种严重的并发症,累及多个器官,病程危重,死亡率较高,早期诊断及治疗是关键。 目前,传统的重症肺炎的监测指标性能不佳,因此,寻找早期敏感的监测指标对于重症肺炎的早期治疗及预防意义重大。 炎性反应 在重症肺 炎的转归 中发挥着 重要作用 ,而s TREM-1是新近发现的感染性疾病一个新的预警指标, 在炎症性疾病的诊断方面有一定的临床价值。 s CD163是巨噬细胞活化的一个标志[5],可引起炎症介质释放,促进炎性反应。 因此,本研究选择测定诱导痰的s TREM-1、s CD163的水平浓度变化,探讨s TREM-1、 s CD163在重症肺炎发生、发展中的临床意义。

TREM-1是一种主要分布于中性粒细胞及单核细胞上的细胞膜表面受体,与感染的发生有密切联系。 s TREM-1是TREM-1的可溶形式 , 在细菌感染时 , TREM-1的表达会明显增加 , 更多的s TREM-1会释放入血清、组织液、灌洗液等,其水平会明显上调。 在感染性疾病方面, 其有望成为一种新的炎症标志物。 Gibot等[6]在社区获得性肺炎患者和呼吸机相关性肺炎患者的肺泡灌洗液检测的s TREM-1水平较非肺炎组明显增高,s TREM-1是有价值的诊断标志物,可以鉴别感染性肺炎和非感染性肺炎,这也得到多数研究者证实[7,8,9,10]。 戴然然等[11]研究显示,细菌性重症肺炎患者血清s TREM-1水平显著高 于非重症 肺炎患者 , s TREM - 1水平的变 化可能与 肺炎病情 严重程度 有关。 唐朝霞等[12]的研究发现,重症肺炎患者血清s TREM-1水平显著高于普通肺炎患者 ,s TREM-1可能参与重症肺炎的炎性反应过程。 也有一些研究者的观点与上述研究结果相左,廖瑾莉等[13]的研究认为s TREM-1诊断老年重症肺炎的敏感性不高 。 阳永珍等[14]研究发现s TREM-1对肺炎的诊断效能低,要更多的参考其他检测指标。 本研究中,重症肺炎组较普通肺炎组的诱导痰s TREM-1水平明显升高, 普通肺炎组较正常对照组也明显升高, 差异均有统计学意义, 这提示s TREM-1可能参与了重症肺炎的发病过程,并与肺炎的病情严重程度有关。 重症肺炎存活组诱导痰s TREM-1的水平经治疗后逐渐下降, 而死亡组则与之相反,始终处于较高的水平,到死亡当天水平升至最高。 s TREM-1水平急剧升高,死亡组患者的炎性反应会明显加强,促炎介质不断释放,从而导致机体内抗炎介质和促炎介质平衡被破坏,病情会进一步加重。 研究提示诱导痰s TREM-1水平能够反应重症肺炎患者的预后, 动态检测s TREM-1水平变化有利于评估预后。

血红蛋白清道夫受体(CD163)是一种仅表达在单核巨噬细胞的跨膜糖蛋白,s CD163是CD163一种以可溶性形式存在于血液或组织液中,亦称可溶性血红蛋白清道夫受体。在炎症刺激等作用下,单核-巨噬细胞膜上的CD163分子会脱落形成s CD163。 肿瘤、 感染等疾病的作用下, 巨噬细胞过度表达,CD163脱落到血液或组织液中,s CD163水平会明显升高,是巨噬细胞活化的一个标志物。 目前的研究发现s CD163在调节炎性反应起着重要平衡作用[15], 研究发现 , 类风湿性关节炎患者血清中s CD163明显增高, 因而s CD163被认为是新的具有诊断意义的炎性疾病血清学标志物[2]。 Schaer等[16]分别检测了严重细菌感染患者血清s CD163水平,研究结果发现严重细菌感染患者血清s CD163水平均高于正常对照组(P < 0.05)。 国内一些学者研究发现[17,18],脓毒症患者血浆s CD163的表达水 平均明显 高于非脓 毒症者和 健康对照 者 , s CD163可能是脓毒症患者的早期诊断评估指标 。 国外的同行研究也认为s CD163与脓毒症关系密切[19,20], 他们研究结果显示s CD163在严重脓毒症组中高于非感染组,s CD163可能是脓毒症早期敏感指标。 王祥德等[21]研究表明s CD163可能在糖尿病动脉粥样硬化方面有一定的促进作用。 而s CD163与重症肺炎的关系却很少有相关报道, 本研究对s CD163在重症肺炎中的作用进行了初步研究。 结果显示,重症肺炎组诱导痰入组第1天的s CD163水平均值为(314.22±61.41) ng/m L,较普通肺炎组[(187.77±59.36)ng/m L]明显升高 (P < 0.05), 而普通肺 炎组s CD163较正常对 照组 [(23.91±9.18)ng/m L]明显升高(P < 0.05)。 随着感染的加重,巨噬细胞膜表面的CD163分子脱落增多,s CD163浓度水平会急剧上升,s CD163水平可能与炎性反应剧烈程度相关。 由此可见, 早期检测患者诱导痰的s CD163水平,有助于重症肺炎的早期诊断 ,其水平的高低也可以反映肺炎患者的病情严重程度。 随着治疗时间的推移, 重症肺炎存活组的诱导痰s CD163水平呈下降趋势,出院当天较第1、4、7天均明显下降(P < 0.05)。 死亡组的s CD163水平则呈上升趋势 ,死亡当天的诱导痰s CD163水平均显著高于第1、4、7天的水平。 研究结果提示,诱导痰s CD163水平升高,预示着预后不佳;反之,病情好转,s CD163水平的变化直接影响到感染后机体病情变化及预后。 动态监测诱导痰s CD163水平 ,可以及时调整治疗方案 ,降低死亡率 , 改善患者预后。

比较s TREM-1和s CD163诊断重症肺炎的ROC曲线下面积,分别为0.828(95%CI:0.733~0.923)和0.765 (95%CI:0.665~0.865),s TREM-1的AUC高于s CD163的AUC,诊断价值稍高。 s TREM-1的cut off值为42.91 pg/m L时,其诊断重症肺炎的敏感性为78.4%, 特异性为69.2%,其敏感性略高,而特异性稍低;s CD163的cut off值为193.13 ng/m L时,其诊断重症肺炎的敏感性为65.7%,特异性为92.3%,其敏感性不高而特异性较好,很可能与样本量较小有关,在以后的研究中应该加大样本量。 s TREM-1和s CD163联合检测后的AUC为0.846(95%CI:0.761~0.931),较s TREM-1、 s CD163的诊断效能都高 , 联合检测诊断重症肺炎比单一指标更有意义,两者相互补充,可以提高重症肺炎的诊 断准确率 。 重症肺炎 患者早期 联合测定sTREM-1和sCD163的水平有助于提高诊断效能 ,有利于早期进行综合治疗,提高治疗效果。

可溶性受体 第2篇

众所周知, 由于肾小球特殊的毛细血管丛结构, 血管内皮细胞的结构、功能及其调节在肾脏疾病中具有重要意义。如糖尿病肾病患者, 其肾小管周围的毛细血管减少, 并伴有血管内皮细胞损伤。血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 是一种促进内皮细胞的增殖、迁移、增强血管通透性的细胞因子。VEGF通过促进肾周血管的新生不仅能减轻对肾脏的损害, 甚至还能恢复肾脏功能[1]。因此VEGF及其受体的表达在肾脏疾病中发挥着重要的作用。现就综述如下。

1 VEGF的结构、来源、种类及生物学作用

1.1 VEGF膜受体的结构及来源

VEGF是分子量为46 k Da的二聚体糖蛋白化合物, 是一种促进血管生成的内源性调节因子, 能够维持内皮细胞的完整性并增强内皮细胞的通透性。肾脏VEGF主要在肾小球脏层上皮细胞表达与合成。病理条件下, 也可由系膜细胞、内皮细胞及肾小管细胞合成[2]。迄今为止, 已发现的VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及PIGF (胎盘生长因子) , 其中VEGF-A是这些因子中最为关键的调节因子。足细胞VEGF-A的缺失能导致小鼠足细胞的凋亡, 最终导致肾小球硬化。

1.2 VEGF膜受体的种类及生物学作用

根据VEGF受体存在的形式不同, 可分为膜受体以及可溶性受体。下面分别就膜受体以及可溶性受体的结构、来源、种类与生物学作用做简要介绍:

1.2.1 VEGF膜受体的结构、来源、种类及生物学作用

VEGF的膜受体包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Neuropilin-1及Neuropilin-2。其中, 前三种属于细胞表面的酪氨酸激酶家族;而后两种则为非酪氨酸激酶受体, 主要是作为VEGFR的共受体存在于细胞表面。

1.2.1. 1 酪氨酸激酶受体

尽管VEGFR-1 (又称Flt-1) 、VEGFR-2 (又称Flk-1) 和VEGFR-3的结构相似, 但其分布及来源却有明显的差异。VEGFR-1主要由单核细胞和巨噬细胞表达, VEGFR-2则主要由肿瘤细胞和血管内皮细胞表达。作为VEGF的正调控受体, VEGFR-1和VEGFR-2通过与VEGF结合能够激活信号通路, 起到促进血管内皮细胞迁移、增生及血管生成的作用。值得注意的是, 尽管VEGFR-1对于VEGF的亲和力比VEGFR-2高, 但由于它的酪氨酸激酶活性很弱, 只有VEGFR-2的1/10[3], 所以VEGF的生物学活性更多是由VEGFR-2介导。

1.2.1. 2 Nrp-1受体以及Nrp-2受体

作为非酪氨酸激酶受体, 目前对于Nrp-1的了解显著多于Nrp-2。神经菌毛素 (neuropilin, NRP) 是一种分子量为130 k Da的跨膜糖蛋白, 但缺乏酪氨酸激酶结构域。NRP-1的结构高度保守, 由胞内区、跨膜区以及胞外区构成, 其中胞外区包括a1/a2 (又称CUB结构域) 、b1/b2及c区 (MAN结构域) (图1) 。Nrp-1能够在多种细胞中表达, 包括内皮细胞、干细胞、成骨细胞以及肿瘤组织。Nrp-1的主要生物学作用是作为共受体通过b1/b2区与VEGF-A结合, 可增强VEGFR-2结合VEGF-A的能力, 从而更好的促进VEGF发挥生物学作用, 介导血管生成与肿瘤的发展。

1.2.2 VEGF可溶性受体的结构、来源、种类及生物学作用

VEGF的可溶性受体主要包括s Flt-1与s NRP-1, 而s Flt-1与s NRP-1在一定的程度上所表现的生物学效应相同, 如VEGF-B186诱导的血管生成效应被s NRP-1降低69%, 被s Flt-1降低47%[4]。

1.2.2. 1 s Flt-1受体

s Flt-1 (又称s VEGFR-1) 是VEGF的可溶性受体, 其分子量为110 k Da, 相比于VEGFR-1, 该受体缺乏跨膜和细胞内激酶结构域, 因而不具有酪氨酸激酶活性。主要由内皮细胞、单核细胞及胎盘产生。作为VEGF的可溶性受体, s Flt-1能够负性调节VEGF的生物活性, 调节机制主要为: (1) s Flt-1能够结合并抑制循环中的VEGF (2) s Flt-1能够与VEGFR-1或VEGFR-2的细胞外区域形成二聚体, 因此抑制下游信号的活化[5]。研究表明, s Flt-1能够引起内皮细胞损伤, 降低血管生成活性, 损伤血管的修复机制, 增加蛋白尿的排出[6]。此外, s Flt-1还是子痫早期的危险因子, 是怀孕时导致肾病发生的主要危险因素。

1.2.2. 2 s NRP-1受体

可溶性NRP-1 (s NRP-1) 相比于NRP-1主要缺失胞内区、跨膜区以及c区, 其分子量大小为90k Da。s NRP-1可以与NRP-1的配体结合以抑制膜受体NRP-1的生物学作用, 即抑制VEGF与内皮细胞和肿瘤细胞的结合;抑制VEGF诱导的内皮细胞中VEGFR-2酪氨酸的磷酸化。研究显示, NRP-1与s NRP-1在基因表达上并不重叠, s NRP-1的m RNA表达在肝细胞、近端肾小管以及远端肾小管, 而NRP-1主要表达在皮肤的上皮细胞和血管中[7]。有报道表明, s NRP-1与NRP-1一样, 都具有血管生成效应, 但s NRP-1的血管生成效应要弱得多[8], 因此, s NRP-1可以拮抗膜受体NRP-1的生物学活性。

2 VEGF可溶性受体在肾脏疾病中的意义

VEGF可溶性受体的表达参与了肾脏诸多疾病, 其中包括慢性肾脏疾病 (CKD) 如Ig A肾病、糖尿病肾病, 急进性肾炎综合征及其他与肾脏相关的疾病如肾血管性高血压、子痫前期等[9,10,11,12]。

2.1 s Flt-1在肾脏疾病中的意义

研究证明, CKD患者的单核细胞能够促使s Flt-1的含量升高[9]。Hagmann H等研究发现在Ig A肾病中, 患者血浆中s Flt-1的含量明显升高[10], 并且在糖尿病肾病、原发性高血压及子痫前期, s Flt-1的含量亦明显升高[9,11]。但在家猪单侧肾动脉狭窄导致的肾血管性高血压 (RVH) 模型中[12], s Flt-1的含量先降低, 在第3周后重新升高并在第12周恢复到初始水平, 这可能是由于AngⅡ诱导肾脏保护因子血红素加氧酶1 (HO-1) 表达增加的结果[13], 因为HO-1能够负性调节s Flt-1的活性。

在肾脏疾病患者中, s Flt-1与多种因素相关。首先, s Flt-1的含量与蛋白尿具有明显的相关性[9], 在绝大多数肾脏疾病中, 有轻度蛋白尿的患者, s Flt-1的含量显著低于中度与重度的蛋白尿患者[14]。研究显示, 在正常的小鼠中, s Flt-1的过多表达会导致小鼠蛋白尿情况恶化。这表明s Flt-1含量越高, 蛋白尿的情况越严重。但是, 在糖尿病小鼠中, s Flt-1的治疗却能够有效缓解糖尿病小鼠蛋白尿的症状[15]。

在新月体肾小球肾炎小鼠中, 使用s Flt-1来抑制VEGF不仅会导致大量的蛋白尿, 同时伴随着能够防止足细胞凋亡的肾病蛋白 (nephrin) 的表达下调[16], 并加速肾小球硬化和肾间质纤维化的进程[17]。大量研究证实, VEGF信号转导能够维持肾小球滤过膜的完整性[18], 而下调足细胞VEGF的表达会导致肾小球内皮损伤以及肾小球功能严重损伤。而在肾炎小鼠中使用s Flt-1进行治疗, 上皮细胞足突会发生严重的融合, 难以辨认[15]。另外, 在Ig A肾病中, v WF作为内皮细胞损伤的标志物, 其含量也与s Flt-1含量呈正相关[14]。以上研究表明, VEGF在维持足细胞的功能中起重要作用, 作为VEGF拮抗剂的s Flt-1, 其含量越高, 表明患者的肾小球内皮损伤越严重。此外, 有研究发现, 内皮损伤还能够增加CKD患者患心血管疾病的风险。CKD患者更容易患动脉粥样硬化、缺血性心脏病以及血管硬化等, 许多研究表明内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化的关键因素[19]。据Framingham风险评分显示患者s Flt-1含量越高, 表明患者患心血管疾病的风险越高[9]。

2.2 s NRP-1在肾脏疾病中的意义

相比于s Flt-1, 关于s NRP-1在肾脏疾病中研究较少。VEGF是内皮细胞存活的一个关键因素, s NRP-1作为一个新型的VEGF拮抗剂, 能够与膜受体竞争性结合VEGF, 进而抑制内皮细胞的增殖。研究表明, 注射了s NRP-1的患肿瘤的小鼠与对照组比较, 显示出更少和体积更小的毛细血管[20]。目前已知, NRP1能促进足细胞黏附力的分化, 抑制NRP-1能降低足细胞迁移[21]。应用糖基化终产物 (AGE) 或s NRP-1能够降低小鼠肾脏足细胞对于胶原蛋白IV、层黏蛋白以及纤维蛋白连接素的黏附力, 但不影响对胶原蛋白I的黏附[21]。足细胞凋亡引起的损伤, 是糖尿病肾病以及肾小球硬化的早期特征。有研究显示, s NRP-1以及AGE能够抑制NRP1, 导致足细胞迁移减少, 从而促使肾小球硬化的发生。同时, 糖尿病小鼠较非糖尿病小鼠的足细胞显示出明显的NRP1蛋白染色降低, 足以证明糖尿病小鼠的NRP1表达降低[21,22]。总的来说, s NRP-1能够抑制NRP-1的表达, 从而抑制足细胞的迁移、分化, 引起肾脏损伤。

可溶性受体 第3篇

关键词：类风湿关节炎,血清,细胞因子,可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

类风湿关节炎 (rheumatiod arthritis, RA) 是一种炎症性和免疫介导性疾病, 以累及周围关节为主的多系统炎症的自身免疫病, 其主要表现为全身多关节的慢性、进行性、侵蚀性的滑膜炎, 随着病情进展可侵袭并损坏关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱, 最终导致关节畸形和功能丧失, 严重者可出现全身多系统的损害。其病理学特征为滑膜衬里层过度增生, 衬里下层大量炎性细胞浸润和微血管新生, 血管翳形成以及软骨和骨组织破坏。RA的全球发病率为0.5%~1.0%, 我国RA的患病率为0.34%~0.36%。RA的发病机制尚未阐明, 目前认为感染因素、遗传因素、内分泌因素、环境因素及精神刺激等均与RA的发生有关。

RA免疫活动的主要位点在滑膜组织, 单核细胞, 特别是T细胞和巨噬细胞对滑膜的浸润, 以及滑膜衬里层增生, T细胞识别未知的自身抗体被认为是炎症的开始。假设, 滑膜募集巨噬细胞和淋巴细胞的过程, 将进一步激活所在部位的炎症反应。活化的巨噬细胞通过产生各种促炎的细胞因子, 如前列腺素 (PGs) 、基质金属蛋白酶 (MMPs) 和一氧化氮 (NO) 等来促进疾病的发展。尽管所产生的这些炎症分子是被配体激发、活化而调节的, 细胞表面受体包括细胞因子受体、补体受体、Toll样受体 (TLRs) 和免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM) 相联系的受体, 这些受体在RA发病机制中的作用还未完全明确。

髓样细胞表达的触发因子受体-1 (triggering receptor ex pressed on myloid cells, TREM-1) 是由Bouchon等[1]于2000年首先发现的免疫球蛋白超家族成员中的一个受体家族。TREM-1属跨膜糖蛋白, 具有胞外区、跨膜区和较短的胞浆内尾段的保守结构。TREM-1胞外区能特异性的与其配体或单克隆抗体结合, 跨膜区的赖氨酸残基, 能与接头蛋白DAP12跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸相耦联, 并通过DAP12胞浆区中的免疫受体酪氨酸活化基序 (ITAM) 来传递活化信号。TREM-1是在单核/巨噬细胞和中性粒细胞上表达, 各种刺激如细菌引起的TLR配体和各种促炎因子均可引起TREM-1的上调。用一种单克隆抗体作用于TREM-1, 刺激其结合各种未知的配体和中性粒细胞及单核细胞产生各种促炎的细胞因子和表达免疫刺激引起的细胞表面分子。另外, 在这种抗体和脂多糖 (LPS) 的诱导作用下, 单核细胞产生大量的促炎细胞因子, 并证实TREM-1扮演了放大先天性免疫的角色。

TREM-1在急性炎症反应的作用已被进一步证实为, 当给予TREM-1外功能区-Fc融合蛋白 (TREM-1-Fc) 或人工合成的TREM-1多肽治疗, 可保护小鼠免于LPS或其它细菌诱导的脓毒血症导致的过度炎症反应甚至死亡[2,3]。当TREM-1的这些作用在急性炎症中被证实的时候, 研究发现TREM-1-Fc能保护性的对抗酵母多糖-A-诱导的肉芽肿形成, 表明TREM-1还可能促进慢性炎症反应[4]。此外, 可溶性形式的TREM-1释放到脓毒血症患者的血液中, 像其它炎性疾病如肺炎、急性胰腺炎和消化性溃疡时[5,6,7], 血清中可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1 (s TREM-1) 的水平可以充当这些疾病的生物标记。此项研究中主要探讨TREM-1在慢性炎症性疾病RA中所涉及的作用。检测应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测RA患者和健康志愿者血清中s TREM-1的水平, 并与患者肿胀关节数、疼痛关节数、血沉 (ESR) 、类风湿因子 (RF) 、超敏C反应蛋白 (hs-CRP) 、DAS28评分以及骨破坏相关的X线分期和关节功能分期进行相关性分析;以探讨TREM-1在RA疾病发展中的意义, 为进一步研究RA的发病机制提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选自2010年10月~2012年10月就诊于邯郸市第一医院 (以下简称“我院”) 风湿免疫科的RA患者共80例 (RA组) , 其诊断符合1987年美国风湿病学会 (ACR) 制订的RA分类标准, 均为河北邯郸地区汉族, 其中男20例, 女60例;年龄27~83岁, 平均 (53.85±11.82) 岁;平均病程 (6.8±2.7) 年。排除条件:RA组均排除血液系统疾病、心脑血管疾病、血栓性疾病、恶性肿瘤、严重感染、糖尿病、甲状腺疾病、慢性肝脏疾病、肾脏疾病、系统性红斑狼疮、多发性肌炎/皮肌炎、系统性硬化症等结缔组织病和脊柱关节病, 以及孕妇和哺乳期患者。

选择我院健康体检人员, 共74例为健康对照组, 其中男20例, 女54例, 年龄27~70岁, 平均 (51.89±8.81) 岁, 均排除自身免疫性疾病、传染病、感染、肿瘤等疾病。两组均自愿参加观察, 且性别、年龄一般资料比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 制定统一的调查表

内容包括临床观察指标和实验室观察指标, 并确定统一的研究方法。

1.2.2 临床观察指标

所有患者均记录性别、年龄、病程、晨僵时间、压痛关节数、肿胀关节数、关节功能分级[4], 并摄双手X线片观察有无放射学损害。

1.3 血清s TREM-1水平的测定

采用ELISA法对血清s TREM-1水平进行检测, 所有标本均在同一实验室内完成, 一次解冻, 同步测试, 采用相应试剂盒, 检测试剂盒均为人血清STREM-1, 试剂由美国Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司提供, 批号为S151-00, 操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两独立样本的计量资料采用t检验;多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。相互关系采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象血清s TREM-1的表达

(1) RA组血清s TREM-1水平与健康对照组比较, 差异有统计学意义 (t=2.94, P<0.05) , 表明RA患者血清s TREM-1水平明显高于正常人。见表1。 (2) RA组内男女血清s TREM-1水平差异无统计学意义 (t=0.44, P=0.65) ;健康对照组内男女血清s TREM-1水平差异无统计学意义 (t=2.09, P=0.18) 。见表2。 (3) RA组不同病程血清s TREM-1水平比较, RA病程≤2年及>5年者血清s TREM-1水平较病程>2~5年者低, 但各组间差异无统计学意义 (F=1.602, P=0.05) 。见表3。 (4) 按照DAS28评分将RA患者分成2组, 稳定期组 (15例) 患者和活动期组 (65例) 患者血清s TREM-1水平差异有统计学意义 (P<0.05) , 表明血清s TREM-1水平在判断疾病的活动程度上有一定意义。见表4。

注:与健康对照组比较, t=2.94, ▲P<0.05;RA:类风湿关节炎;s TREM-1:可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

注:RA:类风湿关节炎;s TREM-1:可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

注:s TREM-1:可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

注:与活动期组比较, t=4.50, ▲P<0.05;s TREM-1:可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

2.2 血清s TREM-1与各项指标之间的相关性分析

采用Spearman相关分析方法, 对RA组患者各项临床和实验室指标之间的相关性进行分析比较发现, 血清s TREM-1和RA患者的关节肿胀数、X线分期、ESR、RF和抗环瓜氨酸肽 (CCP) 抗体呈正相关, 而与病程、年龄、晨僵时间、关节压痛数、hs-CRP和关节功能状态不相关。见表5。

注:ESR:血沉;RF:类风湿因子;hs-CRP:超敏C反应蛋白;CCP:环瓜氨酸肽

2.3 RA组血清s TREM-1表达与DAS28评分的相关分析

采用Spearman相关分析方法发现, RA组血清s TREM-1表达水平与DAS28评分具有明显的相关性 (r=0.85, P<0.01) 。见图1。

2.4 RA组血清s TREM-1表达与关节损害程度的比较

出现双手关节X线损害的RA患者 (放射学评分达2期或2期以上, n=46) 血清s TREM-1表达水平显著高于无双手关节X线损害的RA患者 (放射学检查正常, n=34) , 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表6。

注:与无X线损害比较, t=4.52, ▲P<0.05;s TREM-1:可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

2.5 RA组血清s TREM-1表达与关节功能状态的相关研究

不同关节功能状态时血清s TREM-1表达水平比较, 差异无统计学意义 (F=1.36, P=0.26) 。不同关节功能状态时两两比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) , 故尚不能认为不同关节功能状态时的RA患者血清s TREM-1表达水平有显著差异。见表7。

注:s TREM-1:可溶性髓样细胞表达的触发因子受体-1

3 讨论

RA是一种以慢性破坏性关节病变为主要特征的全身性自身免疫性疾病, TREM-1是感染性疾病中炎症的激发和级联放大的重要介质, 其可以放大炎症反应, 进而增强炎症反应对机体的影响。最近研究发现, 其在自身免疫性疾病RA的发病中也起非常关键的作用。本研究通过检测RA患者外周血中s TREM-1的水平, 探讨TREM-1在RA发病中的意义, 为进一步研究RA的发生、发展及治疗提供依据。

3.1 RA患者血清中s TREM-1表达水平与RA疾病活动性的关系

目前, 国内外尚未有见关于RA患者血清中s TREM-1表达水平与RA疾病活动度的相关报道。为了探讨血清中s TREM-1的表达水平与RA疾病活动度之间的关系, 对RA患者血清中s TREM-1表达水平及其反应疾病活动度的各项指标:DAS28、hs-CRP、ESR进行相关性分析。

DAS28评分是一种有效的评价RA疾病活动程度的指标。目前, 其被广泛应用于各种临床实验中RA的疾病活动及其药物疗效的评价。由于DAS28评分所需的各项信息在临床工作实践中易于获取, 且目前国际上设有DAS28评分的官方网站, 提供在线DAS28评分计算及研究表格, 是许多研究者认为DAS28评分是一种可靠的、客观的、经得起时间推敲的评价RA疾病活动水平的指标[9]。有研究表明较低的DAS28评分是保持长期临床缓解的重要预示因子[18]。

本研究依据DAS28评分将RA患者分为病情稳定组和活动组, 比较两组间血清s TREM-1表达水平, 结果均发现血清s TREM-1在判断疾病的活动程度上有一定意义。此外, 血清s TREM-1表达水平与DAS28评分及ESR水平呈明显正相关, 提示可能血清s TREM-1水平的表达越高, 患者病情越严重。同时RA患者血清s TREM-1的表达水平能够比较客观地反映患者疾病的活动程度, 有可能成为临床监测疾病转归的重要指标。

同时, 对RA患者血清中s TREM-1的表达水平与患者hs-CRP水平研究显示, 二者无明显相关性。hs-CRP是一种急性时相反映蛋白, 当机体存在组织损伤或炎症时, hsCRP浓度变化幅度大, 在短时间内 (数小时) 即可升高, 而当机体病变痊愈时, hs-CRP有迅速降至正常。hs-CRP和ESR均为反映疾病活动度的指标, 在多种细菌感染性疾病、非细菌感染性疾病和自身免疫性疾病中均可升高, 因此反映RA疾病活动度的特异性均较差。本研究结果显示, RA患者血清中s TREM-1的表达水平与ESR呈明显正相关, 而与hs-CRP水平无明显相关性。ESR反映血液中蛋白质的变化, 特别是受纤维蛋白原浓度的影响, 而纤维蛋白原中的某些物质可能与RA的发病有关, 因此, 这也可能时影响本研究结果的原因之一。

3.2 类风湿关节炎血清中s TREM-1表达水平与各种临床指标的关系

本研究首次对RA患者血清中s TREM-1表达水平与RA患者的各种临床指标 (包括患者病史、抗CCP抗体、RF水平) 的相关性进行分析, 结果显示, RA患者血清中s TREM-1表达水平与抗-CCP抗体和RF水平呈正相关。

近年来陆续发现的抗核周因子 (APF) 、抗角蛋白抗体 (AKA) 、抗聚角蛋白微丝蛋白抗体 (AFA) 及抗Sa抗体对RA有较高的特异性, 并可在疾病的早期出现[19]。进一步研究发现, 上述抗体具有相同的抗原决定簇-瓜氨酸, 故称为瓜氨酸相关自身免疫系统, 此系统可能在RA的发病及病情进展中起重要作用。2000年Schellekens等[20]首次合成由21个氨基酸残基组成含CCP的环肽, 并用ELISA方法进行检测, 发现其对RA具有很好的敏感性和特异性分别为68%和98%, 其可作为RA新的血清标志物。国内报道抗CCP抗体对RA的诊断敏感性及特异性分别为46.6%和96.6%[21]。大量文献报道抗CCP抗体与RA骨侵蚀具有相关性[22,23], 长期的随访发现抗CCP抗体阳性的患者更容易出现严重的关节破坏[24]。结合本研究结果, 可以认为RA时TREM-1的增高, 使得血清中s TREM-1表达水平升高, 本研究同时发现RA患者的X线破坏程度与血清中s TREM-1表达水平呈正相关。因此, 提示s TREM-1的表达水平升高越明显, 患者的关节损伤可能会越严重。由此提示, 血清中s TREM-1表达水平可能预示疾病的进展情况。

可溶性受体 第4篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2010年1月-2012年12月收治的类风湿关节炎患者50例, 其中男17例, 女33例, 年龄32~76岁, 平均54.2岁, 所有患者均符合1987年美国风湿病学会制定的RA诊断标准, 患者病程1~14年, 平均7.2年。对所有患者均应用DSA28的评分标准对疾病的活动性进行判定。将50例患者选取观察组, 并根据DSA28的评分分为活动组 (DSA28≥2.6, 29例) 和非活动组 (DSA28<2.6, 21例) , 另选取同一时间在本院进行体检的健康者50例为对照组, 两组患者性别、年龄等一般情况比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

仪器和试剂分别采用某公司生产的OLYMPUS2700全自动生化分析仪和某公司提供的各项血清生化指标的检测试剂盒。对所有受检者均于清晨空腹抽取静脉血3 ml, 放于干燥试管中, 离心分离血清待检。应用酶联免疫吸附试验法 (ELISA) 对TREM-1和IL-17进行检验, 并同时检测观察组患者的类风湿因子 (RHF) 、C反应蛋白 (CRP) 、瓜氨酸肽抗体 (CCP) 以及补体3 (C3) 水平, 且操作步骤均严格按照说明书进行[4]。

1.3 统计学处理

应用SPSS 16.0系统软件进行统计分析, 计量资料采用 (±s) 表示, 应用t检验, P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TREM-1和IL-17浓度变化

观察组的TREM-1和IL-17水平明显大于对照组, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) ;活动组的TREM-1水平明显大于非活动组, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) ;活动组和非活动组IL-17水平比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

2.2 对RA患者在活动期和非活动期各项血清指标的比较

活动组和非活动组CCP和RHF水平比较差异均无统计学意义 (P>0.05) ;而活动组的CRP、C3水平明显大于非活动组, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

*与对照组比较, P<0.05;△与非活动组比较, P<0.05

2.3 观察组患者中TREM-1与其他几项血清指标的相关性分析

从本组的结果1和2中可看出, 观察组患者中TREM-1水平与CRP和C3之间呈明显相关性 (P<0.05) , 与CCP和RHF的相关性不明显 (P>0.05) 。

3 讨论

RA目前的发病原因尚不明确, 但是其是由多种因素和多种机制参与的累及全身多系统性自身免疫性疾病, 包括先天性免疫系统、抗原驱动的T细胞和B细胞免疫应答以及细胞因子等均有可能导致RA的发生和发展[5,6,7]。

TREM-1是近年来发现的免疫球蛋白超家族受体成员之一, 其可选择性表达于中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞的细胞表面, 在各种急性炎症时, 在TOLL样受体的作用下可呈现高表达[8,9]。TREM-1是表达于成熟单核细胞表面的TREM-1蛋白裂解变异体, 在感染的过程中向机体体液或血液中特异性释放的一种细胞因子[10]。在RA患者的病变中, 滑膜炎是最基本的病变, 滑膜间质内有大量的巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒子细胞, 而TREM-1可以表达于上述细胞[11,12]。在本组的资料中, 对观察组、活动组、非活动组以及对照组的TREM-1的变化进行比较, 观察组的TREM-1水平明显大于对照组, 活动组的TREM-1水平也明显大于非活动组, 且差异均具有统计学意义 (P<0.05) 。

IL-17是一种前炎症细胞因子, 对炎症反应具有很强的促进作用[13]。在机体受到损伤或感染时, 迁移过来的淋巴细胞可分泌IL-17, 其一方面可诱导炎性因子和趋化因子的表达, 从而招募更多的免疫细胞到达炎症部位加剧机体的炎症反应[14]。另一方面, IL-17还会诱导一些组织修复相关因子的表达从而加速机体的恢复。临床有资料表明, 系统性红斑狼疮 (SLE) 患者体内IL-17蛋白分泌及基因表达水平存在明显异常, 两者呈正相关, 由此可以提示, IL-17在类风湿关节炎中发挥着重要的作用[15]。在本组的资料中, 对四组患者IL-17浓度变化的比较, 观察组的IL-17水平明显大于对照组 (P<0.05) , 而活动组和非活动组IL-17水平无明显差异 (P>0.05) , 这可能与样本量不足有关, 有待于加大样本量做更为详细的研究。

可溶性受体 第5篇

1资料与方法

1.1一般资料

对照组82例,为健康成人,男45例,女37例;年龄25～65岁,平均(38±8.11)岁。恶性肿瘤患者93例,男57例,女36例;其中肺癌36例,肝癌25例,乳腺癌32例;年龄24～70岁,平均(42±9.17)岁。恶性肿瘤患者均经过病理学、临床资料确诊,以上均为2009年12月2010年12月我院收治的住院患者。

1.2方法

su PAR检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法;Cystatin C检测采用颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)检测,使用德灵BNII特定蛋白分析仪。每份待测标本平行测2次,取平均值。数据采用(x珋±s)表示,应用PEMS 3.1软件做2样本均数比的t检验及相关分析。

2结果

恶性肿瘤患者尿液中su PAR和Cystatin C水平测定值见表1。从表1中可见,2项指标均高于对照组,差异有统计学意义。

注:Su-PAR可溶性尿激酶受体;Cystatin胱抑素C。

将3种恶性肿瘤患者尿液中su PAR和Cystatin C水平测定值进行组内两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

恶性肿瘤患者未手术21例,手术72例。手术后半月测定患者尿液中su PAR和Cystatin C水平的变化,见表2。患者手术后,2项指标均明显降低(P<0.05),但未手术的患者尿液中suPAR和Cystatin C水平未见明显变化。

注:Su-PAR可溶性尿液酶受体;Cystatin胱抑素C。

3讨论

Cystatin C是一种低相对分子质量蛋白质,是半胱氨酸抑制物家族成员之一,无组织学特异性,故机体Cystatin C产生率相对恒定[1]。其血中浓度不受疾病因素、胆红素、溶血及甘油三酯等的影响,并与性别、年龄、肌肉量无关[2]。近年来,随着对肿瘤侵袭和转移机制不断的深入研究,发现作为半胱氨酸内源性抑制剂的Cystatin家族成员与肿瘤的侵袭和转移关系密切,Cystatin C抗肿瘤转移作用的研究正日益受到人们关注[3]。已有的研究可以证实Cystatin C与肿瘤向外浸润和转移有关[4]。国内对恶性肿瘤患者尿液中su PAR和Cystatin C研究较少。向礼贤[5]曾检测过Cystatin C在正常人体液中的水平[血清中Cystatin C水平为(0.96±0.20)mg/L,尿液0.003～0.30mg/L];与本文研究结果相似。本文检测发现恶性肿瘤患者尿液中su PAR和Cystatin C水平均高表达,尿液中的测定值与对照组尿液比较,差异有统计学意义(P<0.01)。是对照组的数倍甚至数十倍。但各种肿瘤患者尿液之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。研究中还发现,经历手术的恶性肿瘤患者尿液su PAR和Cystatin C水平与未手术患者相比下降,差异有统计学意义(P<0.01);检测恶性肿瘤患者尿液中su PAR和Cystatin C水平,有可能成为恶性肿瘤患者新的诊断和预后判断指标,对病情监测和疗效判断具有较高的临床价值。恶性肿瘤患者血清中su PAR和Cystatin C水平与肿瘤相关性已得到研究证实[6],但检测恶性肿瘤患者尿液中su PAR和Cystatin C水平的临床意义还有待进一步探讨,是否可能成为生物治疗的一个靶点,有待于进一步研究。

摘要：目的 探讨恶性肿瘤患者尿液中可溶性尿激酶受体(suPAR)和胱抑素C(Cystatin C)水平及与治疗的关系。方法 suPAR采用ELISA法检测。Cystatin C应用颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)检测,使用德灵BNII特定蛋白分析仪;对照组为82例健康成人,病例组为93例恶性肿瘤患者,比较2组尿液中suPAR和Cystatin C的检测水平。结果 恶性肿瘤患者尿液中suPAR和Cystatin C水平较对照组增高,差异有统学意义(P<0.01)。结论 与健康对照成人比较恶性肿瘤患者尿液中suPAR和Cystatin C水平增高,且与恶性肿瘤患者手术有关。检测恶性肿瘤患者尿液中suPAR和Cystatin C水平有可能成为新的诊断和预后判断指标,对恶性肿瘤患者病情监测和疗效判断具有较高的临床价值。

关键词：恶性肿瘤,可溶性尿激酶受体,胱抑素C

参考文献

[1]苏彩芳,高岩.血清胱抑素C测定临床意义探讨[J].中国病案,2006,7(6):47-48.

[2]Abrahamson M,Olafsson I,Palsdottir A,et al.Structure and expressionof the human cystatin C gene[J].Biochem J,1990,268:287-294.

[3]万榕,郑海音,宋军,等.蛇毒cystatin基因转染抗人胃腺癌细胞体外侵袭作用的研究[J].中国肿瘤临床,2005,32(17):961-965.

[4]王蕾,陈凌燕,高锋.半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在肿瘤研究中的进展[J].检验医学,2008,23(2):199-201.

[5]向礼贤.血清胱抑素C检测与疾病[J].四川医学,2004,25(11):1258-1259.

可溶性受体 第6篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013 年12 月~2015 年6 月在我院临床诊断感染EV71 的90 例手足口病患儿作为感染组研究对象, 均符合原卫生部制订的 《手足口病诊疗指南(2010 年版)》[4]中的诊断标准,且经病原学检查确诊为EV71 感染,其中男53 例,女37 例,年龄3 个月~4岁,平均(1.8±0.7)岁。 根据临床分型分为普通组(32例)和重症组(58 例),其中普通组男20 例,女12 例,年龄2 个月~4 岁,平均(1.5±0.9)岁;重症组中重型30例,危重型28 例,男33 例,女25 例,年龄2 个月~3 岁,平均(1.2±0.8)岁。 另选取50 例我院同期体检健康儿童作为对照组,男29 例,女21 例,年龄5 个月~4 岁,平均(1.9±0.6)岁。 三组在性别、年龄等一般资料方面比较差异无统计学意义(P > 0.05),具有可比性。 本研究经医院医学伦理委员会同意,所有研究对象知情并签署同意书。

1.2 HFMD临床分型

参照《手足口病预防控制指南》(2010 年版)分为普通型和重症型,具体内容如下:手、足、口、臀部皮疹,部分出现发热为普通型;重症型分为重型和危重型,出现神经系统受累表现为重型,如无力或急性弛缓性麻痹;肢体抖动,肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍;头痛、呕吐;精神差、嗜睡、易惊、谵妄。 体征可见脑膜刺激征,腱反射消失或减弱。 出现以下情况之一者为危重型:①休克等循环功能不全表现;②肺部啰音、呼吸困难、血性泡沫痰、紫绀等;③脑疝、昏迷、频繁抽搐。

1.3 HFMD临床分期

根据患儿病情进展情况分为急性期和恢复期,急性期为病程的第1~4 d,可见口腔溃疡、皮疹,伴或不伴发热,重症者伴循环系统、呼吸系统及神经系统损伤症状;恢复期为病程的7~14 d,皮疹及口腔溃疡等症状基本消失,无发热症状,重症者神经系统受累症状大部分改善,逐渐恢复心肺功能。

1.4 观察指标及检测方法

抽取所有研究对象外周肘静脉血3 m L,置于肝素抗凝管中,3000 r/min离心15 min, 分装后置于-80℃ 冰箱中保存待测。 观察指标包括血浆s TREM-1、促炎因子及抗炎因子,其中促炎因子包括TNF-α、 白细胞介素-1β (IL-1β)、IL-8, 抗炎因子包括白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)。均采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法进行测定,试剂盒由美国R&D公司提供,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间比较采用 χ2检验,以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 感染组不同分期与对照组血浆s TREM-1 及相关炎症因子水平比较

与对照组比较, 感染组急性期及恢复期血浆s TREM-1 及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 水平明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05);感染组急性期血浆s TREM-1 及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平明显高于恢复期, 差异均有统计学意义(P <0.05)。 见表1。

2.2 感染组急性期与对照组血浆s TREM-1 及相关炎症因子水平比较

与对照组比较, 普通组和重症组急性期血浆s TREM-1 及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 水平明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05);重症组急性期血浆s TREM-1 及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平明显高于普通组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表2。

2.3 感染组恢复期与对照组血浆s TREM-1 及相关炎症因子水平比较

与对照组比较, 普通组和重症组恢复期血浆s TREM-1 及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 水平明显升高,差异有统计学意义(P < 0.05);重症组恢复期血浆s TREM-1 及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平明显高于普通组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表3。

注:与对照组比较,*P < 0.05;与恢复期比较,#P < 0.05;s TREM-1:可溶性髓系细胞触发受体-1;TNF-α:肿瘤坏死因子-α;IL:白细胞介素

注:与对照组比较,*P < 0.05;与普通组比较,#P < 0.05;s TREM-1:可溶性髓系细胞触发受体-1;TNF-α:肿瘤坏死因子-α;IL:白细胞介素

注:与对照组比较,*P < 0.05;与普通组比较,#P < 0.05;s TREM-1:可溶性髓系细胞触发受体-1;TNF-α:肿瘤坏死因子-α;IL:白细胞介素

3 讨论

手足口病属于一种近年来流行的急性发热出疹性传染疾病,主要症状为手、足、口腔等部位疱疹或皮疹和发热,少数患儿可合并心肌炎、肺水肿、急性迟缓性麻痹、脑炎及无菌性脑膜炎等[5]。 目前,其发病机制尚未阐明,可能与病毒直接侵犯组织细胞有关,大量病毒在体内复制可破坏细胞[6,7]。

临床研究表明, 手足口病的主要病原体为EV71和Cox A16,其中以EV71 型重症手足口病最为常见[8]。EV71 型重症手足口病病情进展迅速,病死率高,临床上可见神经源性肺水肿、脑脊髓炎及脑炎等。 有研究表明,年龄<3 岁的EV71 型重症手足口病患儿进展为重症病例的可能性很大,其原因为婴幼儿免疫功能尚未发育成熟[9],提示该病的发生与免疫功能密切相关。

正常情况下,机体内的细胞因子处于互相制约状态,共同维护免疫平衡。 当病毒侵入机体时,免疫细胞被激活而不断分泌细胞因子,细胞因子在参与机体免疫病理损伤的同时保护机体免疫。 细胞因子中抗炎介质与促炎介质间保持平衡有助于维持机体内环境稳态,该平衡一旦被打破,则会出现诸多不良后果。 促炎介质占主导地位会使炎性反应进一步加重,抗炎介质占主导地位则会使抗炎/促炎趋于平衡, 机体炎性反应随之减轻。 TNF-α 主要由活化单核巨噬细胞、激活的中性粒细胞产生,是机体感染后最早产生的多功能细胞因子之一,可直接损伤血管内皮细胞,同时通过自分泌方式作用于单核巨噬细胞而加重炎性反应[10]。IL-1β 是一种能激活多种免疫和炎症细胞的促炎症细胞因子,具有广泛的免疫调节作用,同时具有介导炎症和致热作用[11]。 IL-8 是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子。 目前认为,TNF-α、IL-1β 导致的炎性反应在很大程度上是通过诱导以IL-8 为代表的趋化因子产生的,且与炎性反应严重程度呈正相关[12]。IL-10 由巨噬细胞核T淋巴细胞产生,可发挥抑制机体免疫功能和拮抗促炎介质的双重作用[13]。 其主要生物活性是免疫抑制作用,可抑制单核细胞、中性粒细胞等产生促炎症因子和趋化因子,减少TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等的释放。 IL-4 是重要的抑炎症因子之一,可增加正常休止期T细胞活性、调节造血功能,抑制炎性反应进一步加重[14]。

本研究结果发现,恢复期各炎症因子水平高于对照组,可能与体液免疫有关,刘亚敏等[15]研究指出,EV71 手足口病型患儿患病7 d后血清特异性抗体Ig M明显增加,与本研究结果相一致。 重症组急性期及恢复期血浆TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 水平均明显高于普通组,提示EV71 型重症手足口病患儿机体处于更为复杂的兔疫紊乱和动态失衡状态。 可能原因为EV71 型重症手足口病早期EV71 诱导TNF-α前炎症细胞因子大量产生,导致全身炎性反应综合征,炎性反应的进一步加重可造成IL-10 等抗炎细胞因子持续大量产生以拮抗过度产生的前炎症细胞因子[16]。 急性期TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 水平均明显高于恢复期和对照组,提示感染EV71 后早期会出现免疫保护作用,急性期上述细胞因子水平升高则有助于机体早期启动非特异性和特异性免疫,进而最大限度调动抗炎因子与促炎因子参与对EV71 的免疫,加速手足口病自限恢复。

髓系细胞触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells ,TREM ) 是新近发现的一个受体家族,TREM-1 是其中一个与炎症相关的成员[17]。 TREM-1属于免疫球蛋白家族,专一表达于中性粒细胞、CD14+单核/巨噬细胞表面的跨膜糖蛋白, 在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎性反应中具有重要作用。 s TREM-1 是TREM-1 的一种分泌亚型,感染初期即可大量释放进入血液[18,19]。 近年来,s TREM-1 与感染性疾病的关系成为研究的热点。 研究指出,脓毒症患儿血浆s TREM-1 水平较正常者明显升高,s TREM-1 水平变化可在一定程度上反映感染严重情况[20]。s TREM-1 水平变化趋势与促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-8 一致, 提示s TREM-1 可能属于一种促炎介质,其变化趋势可反映病情转归情况,水平升高提示炎性反应加重,降低则说明病情好转。

研究表明,EV71 引起的炎性反应极易损伤中枢神经系统小血管内皮,造成血管炎性变及细胞融合等改变,进而导致神经系统疾病发生[21]。 有效改善机体免疫状态,积极进行抗炎治疗有助于EV71 型重症手足口病的预防[22]。 综上所述,密切监测EV71 型重症手足口病患儿血浆s TREM-1 及炎症因子水平变化具有重要的临床意义,可在临床上推广应用。

摘要：目的 探讨EV71型重症手足口病血浆可溶性髓系细胞触发受体-1及炎症介质水平的变化情况。方法 选取2013年12月~2015年6月在深圳市龙岗中心医院临床诊断感染EV71的90例手足口病患儿(感染组)和50例同期体检健康儿童(对照组)作为研究对象,根据临床分型将感染组分为普通组(32例)和重症组(58例)。比较各组及感染组急性期和恢复期血浆sTREM-1及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平。结果 与对照组比较,感染组血浆sTREM-1及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);感染组急性期血浆sTREM-1及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平明显高于恢复期,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,普通组、重症组急性期及恢复期血浆sTREM-1及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);重症组急性期及恢复期血浆sTREM-1及TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平均明显高于普通组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 s TREM-1在EV71型重症手足口病发病过程中可能起促炎作用,该病与抗炎与促炎介质失衡有关。

可溶性受体 第7篇

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是以肺内中性粒细胞(neutrophil,NEU)聚集、血管通透性增高、肺水增多为特点的弥漫性肺实质损伤。核因子-kappaB(NF-κB)作为调控炎症介质基因表达的转录因子在ALI的发生发展中具有关键作用[1]。最近研究表明,晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)与其配体共同参与了内毒素性ALI的发病过程[2,3];可溶性RAGE(soluble RAGE,s RAGE)在小鼠迟发性高敏反应及IL-10缺陷致慢性结肠炎模型中,通过RAGE阻滞缓解炎症并抑制NF-κB和细胞因子上调[4],其是否对小鼠脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)肺损伤发挥同样作用值得深入探讨。本实验建立小鼠LPS吸入致肺损伤模型,观察腹腔注射重组s RAGE对肺内NF-κB活化、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平、NEU浸润、肺毛细血管通透性及病理改变的影响,以明确s RAGE的肺保护作用及机制。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 主要试剂

E.coli脂多糖(血清型B:55,Sigma公司),重组小鼠s RAGE(Toray公司),Diff-Quik染液(Sysmex公司),BCATM蛋白分析试剂(Pierce公司),小鼠TNF-α酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒(R&D公司),BDTM TransFactor化学发光试剂盒(Clontech公司)。

1.2 动物分组及模型制备

48只健康雄性C57BL/6J小鼠(日本CLEA公司),8～11周龄,体重18～22 g,随机分为3组,每组16只:PBS组、LPS组和s RAGE组。所有动物经腹腔注射盐酸氯胺酮(100 mg/kg体重)和赛拉嗪(10mg/kg体重)麻醉,参照UENO等[3]的方法,行颈正中切口游离气管,以24G套管针气管穿刺,将套管插入左主支气管。将LPS用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS)溶解成1.2 mg/m L的溶液,向LPS组和s RAGE组小鼠左肺内注入3mg/kg体重的LPS,PBS组小鼠以相同体积的PBS代替LPS注入左主支气管内。各组动物随即呼吸室内空气,于LPS气管内注入后1 h,s RAGE组接受100μg s RAGE(溶于100μL PBS中)腹腔注射,LPS组接受100μL PBS腹腔注射,PBS组于气管内滴注PBS后1 h腹腔注射100μL PBS。

1.3 标本采集和处理

各组随机选取4只动物,于气管内滴注后4 h经腹腔注射戊巴比妥(250 mg/kg体重)处死,采集左肺组织,分离核蛋白,分析核蛋白中NF-κB P65DNA结合活性作为评价NF-κB活化的指标。各组另外随机选取6只动物,于气管内滴注后24 h处死,经颈正中切口暴露气管,行气管切开,插入20G套管,2次注入0.7 m L预冷的PBS分别反复灌洗3次,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)回收量1.1～1.3 m L,保证动物组间无回收量的差异。各组其余6只动物于相同时点处死,完整取出心肺组织,以20 cm水柱的跨肺压向气管内灌注10%中性福尔马林,并将左肺组织浸泡固定,用于病理学评估。

1.4 肺组织NF-κB p65 DNA结合活性测定

先按照文献报道的方法[5]从肺组织中提取核蛋白。向3mL预冷的Buffer A(10 m M HEPES,1.5m M Mg Cl2,10 m M KCl,0.5 m M DTT,0.5 m M PMSF)中,加入0.1%Nonidet P-40和蛋白酶抑制剂混合液(1 mg/m L leupeptin,1 mg/m L aprotinin,10 mg/m L soy bean trypsin inhibitor,1 mg/m L pepstain),将冻存的肺组织置于其中匀浆,冰上放置10 min后4℃离心850 g 10 min。将沉淀混悬于3 m L Buffer A,4℃离心1 400 g 10 min。粗提的核沉淀再次混悬于含有蛋白酶抑制剂混合液(成分同前)的40μL Buffer B(20 m M HEPES,1.5 m M Mg Cl2,0.42 M Na Cl,0.2m M EDTA,25%(vol/vol)glycero l,0.5 m M DTT,0.5m MPMSF)中,冰上孵育30 min。4℃离心20,000g15 min,所得上清即为核蛋白。用BCATM蛋白分析方法检测核蛋白浓度,取1μg核蛋白用BDTM TransFactor化学发光试剂盒检测核蛋白中NF-κB p65 DNA结合活性,操作严格按照说明书进行。DNA结合活性以相对光单位(relative light unit,RLU)表示。

1.5 BALF中TNF-α水平

将BALF 4℃离心1 000 g 5 min,分离上清,-80℃保存。采用ELISA法检测上清中TNF-α水平,操作严格按照试剂盒说明进行,显色后经全自动酶标仪读数。对样本进行双份检测取平均值以减小误差。

1.6 BALF中白细胞计数和蛋白含量测定

BALF中白细胞(WBC)总数用细胞计数仪计数,NEU数由离心涂片经Diff-Quik染色获得。按照说明用BCATM蛋白分析试剂测BALF上清中蛋白(TP)含量,作为评价肺毛细血管通透性的指标。

1.7 肺组织病理

左肺组织以10%中性福尔马林浸泡24 h以上,常规脱水、包埋制成蜡块,切成5μm切片,用苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察。

1.8 统计学处理

所有计量数据以均数±标准差(±s)表示,应用SPSS14.0统计学软件进行单因素方差分析,各组间差异用LSD法进行两两比较,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 肺组织NF-κB p65 DNA结合活性

气管内滴注后4 h,LPS组小鼠肺内NF-κB p65 DNA结合活性较PBS组明显增强(P<0.01),LPS后1h s RAGE腹腔注射显著抑制了LPS引起的NF-κB活化,表现为s RAGE组NF-κB p65 DNA结合活性显著下降(P<0.05),但仍高于PBS组(P<0.05)。竞争分析显示,向LPS组的核提取物中加入500 ng竞争性寡核苷酸使样本中NF-κB p65与包被在板孔中的特异性DNA序列的结合活性降低,证实了NF-κB与DNA结合的特异性。见附图。

2.2 BALF中TNF-α水平

气管内滴注后24 h,LPS组小鼠BALF中TNF-浓度为(688.10±457.41)mg/L,明显高于PBS组(1.20±2.24)mg/L(P<0.01);与LPS组相比,s RAGE组BALF中TNF-α浓度显著降低(P<0.05),为(346.82±118.77)mg/L,但仍高于PBS组(P<0.05)。

2.3 BALF中WBC总数、NEU数及TP含量

与PBS组相比,LPS组小鼠BALF中WBC总数及NEU数、蛋白含量均明显增多(P均<0.01);s RAGE组小鼠BALF中WBC总数及NEU数显著低于LPS组(P均<0.05),但仍高于PBS组(P<0.05);LPS组小鼠BALF中TP含量显著高于PBS组(P<0.01),s RAGE组BALF中TP含量较LPS组明显降低(P<0.05),与PBS组相比差异无显著性。见附表。

(±s)

注:1)与PBS组比较,P<0.01;2)与PBS组比较,P<0.05;3)与LPS组比较,P<0.05

2.4 肺组织病理改变

400倍光镜下观察发现,气管内滴注后24 h,PBS组肺组织结构基本正常,肺泡结构完整,未见明显NEU浸润和间质水肿。LPS组肺泡结构紊乱,肺泡腔内大量NEU聚集,伴有明显肺泡壁增厚、肺泡毛细血管充血渗出,部分肺泡萎陷。s RAGE组肺泡结构尚清晰,肺内NEU浸润较LPS组明显减轻,肺泡壁充血水肿也明显缓解。

3 讨论

向动物气管内注入LPS革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,能引起严重肺内炎症和组织损伤,是ALI的经典模型。由于时程研究表明此模型肺损伤在LPS滴注后8～32h最为突出[3],笔者选择24 h作为肺损伤指标的观测点。本研究中小鼠气管内滴注LPS 24 h后,BALF中TNF-α释放增多,WBC总数和NEU数量显著增加,TP含量升高,肺组织出现典型的ALI病理损害,说明小鼠LPS肺损伤模型构建成功。研究结果表明,健康小鼠气管内滴注LPS后4 h,肺组织中NF-κB活性显著增强,应用重组小鼠s RAGE明显抑制LPS引起的肺损伤早期NF-κB活化,减轻了LPS致伤后24 h肺内TNF-α释放、炎症细胞浸润、肺毛细血管渗出和病理改变,缓解了LPS介导的肺损伤。

目前认为ALI/ARDS的实质是失控的炎症反应,多种炎症介质和细胞因子参与发病。已经证实,多种炎症介质基因的启动子和增强子中存在一个或多个κB序列,活化的NF-κB可单独或与其他转录因子协同调控这些介质基因的诱导表达[6],从而参与机体炎症反应的调节。NF-κB主要由p50和p65两个亚单位组成,通常与抑制蛋白IκB-α结合成无活性的形式存在于胞质中,当细胞受细菌、毒素等刺激时,IκB-α经历磷酸化被非特异性蛋白酶水解,导致NF-κB快速活化并移至胞核,与特定基因启动子序列上的κB位点结合而调节基因转录[7]。本实验通过检测p65亚单位与相应DNA序列结合的能力评价NF-κB的活化程度,观察到LPS刺激引起ALI早期NF-κB活化增强,证实了ALI的发病与NF-κB的活化密切相关。近期研究表明,LPS介导的NF-κB活化参与了肺内NEU增多、上皮通透性增强和脂质过氧化反应[8,9],在ALI/ARDS炎症失控中具有重要作用。因此,如何抑制NF-κB活化减轻肺内失控的炎症反应成为防治肺损伤的关键。

RAGE是一个多配体受体,属于免疫球蛋白超家族。在多种疾病模型中,RAGE与其配体相互作用常导致快速持续的细胞活化和下游基因转录,多种细胞信号ERK1/2(p44/p42)、p38、SAPK/JNK MAPK、rho-GTP酶、PI-3K、JAK/STAT在不同类型细胞中被激活,并通过NF-κB持久活化维持和扩大炎症反应[10],推测RAGE信号在NF-κB起核心作用的ALI发病机制中起重要作用。

s RAGE作为RAGE的一种分泌型变异体,由配体结合的细胞外区域构成。由于缺乏跨膜区域,因此能与RAGE竞争同RAGE配体的结合,从而阻断RAGE信号向细胞内转导[11]。本研究首次应用s RAGE针对LPS致小鼠ALI进行干预治疗,发现应用s RAGE阻止RAGE信号能抑制脂多糖引起的NF-κB活化,说明RAGE通路参与了这一过程。由于NF-κB参与多种致炎细胞因子和趋化因子基因如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、细胞间黏附分子(ICAM-1)的转录调控。因此,s RAGE抑制NF-κB活化同时也降低了这些致炎因子的表达。这就解释了实验中s RAGE干预后TNF-α产生减少的现象。TNF-α是公认的肺损伤过程中起始动作用的前炎症因子,其与IL-1β、IL-6等致炎因子在ALI早期大量释放,诱导NEU迁移、聚集,活化的NEU作为炎症反应的效应者和执行者不仅产生毒性物质直接损伤血管内皮细胞和肺泡上皮细胞,导致肺毛细血管通透性增强,而且产生大量致炎细胞因子,使炎症反应升级和扩大。实验中s RAGE干预阻止NF-κB活化,不仅伴随着TNF-α的产生受抑制,而且BALF中炎症细胞数量明显减少,BALF中TP浓度作为反映肺毛细血管通透性的指标也在s RAGE干预后明显降低。组织病理结果进一步证实应用s RAGE显著减轻了LPS引起的肺泡内NEU聚集和间质水肿,有效地保护了肺组织。说明s RAGE通过抑制NF-κB活化,减少TNF-α生成,使肺内NEU浸润降低,从而减轻了肺内失控的炎症反应和毒性物质对肺血管内皮细胞的损伤,阻断了引起炎症扩大化的正反馈通路,这构成了s RAGE防治ALI的机制之一。

本研究中,100μg s RAGE并未能完全阻止NF-κB活化和肺损伤的发生,这是否因为s RAGE剂量不足或者有RAGE通路以外的其他介质参与故不能完全被s RAGE阻滞尚有待进一步研究。目前s RAGE抑制NF-κB活化的分子机制尚不清楚,深入研究RAGE信号与ALI信号通路的关系,将为应用s RAGE治疗感染相关性ALI提供理论依据。

摘要：目的探讨可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)对脂多糖(LPS)致急性肺损伤(ALI)小鼠肺内核因子-kappaB(NF-κB)活化的影响及潜在意义。方法向小鼠左肺内滴注LPS建立ALI模型,于造模后1h腹腔注射100ugsRAGE,观察其对造模后4h左肺组织NF-κBP65DNA结合活性的影响,并检测造模后24h支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(WBC)及中性粒细胞(neutrophil,NEU)数量、蛋白(TP)浓度和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,同时对肺组织进行病理学评估。结果LPS滴注后4h,肺组织中NF-κBP65DNA结合活性显著增强(P<0.01),应用重组小鼠sRAGE减轻了LPS肺损伤早期肺内NF-κB活化(P<0.05),显著降低了LPS滴注后24hBALF中WBC及NEU数量、TP含量和TNF-κB水平(P均<0.05),减轻了LPS引起的肺组织病理改变。结论应用sRAGE阻止RAGE信号通过抑制LPS肺损伤早期肺内NF-κB活化减轻肺内失控的炎症反应,从而对ALI发挥保护作用。

关键词：晚期糖基化终末产物受体,脂多糖,急性肺损伤,核因子-κB,肿瘤坏死因子α

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