谷氨酸脱羧酶抗体

谷氨酸脱羧酶抗体（精选5篇）

谷氨酸脱羧酶抗体 第1篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院门诊2014年1月～12月间接诊的30例Ⅰ型糖尿病患者(A组)和30例Ⅱ型糖尿病患者(B组)及30例健康体检者(C组),A组中男16例,女14例。年龄32～65岁,平均(40.1±5.4)岁。B组中男17例,女13例。年龄33～64岁,平均(41.3±5.7)岁。C组中男15例,女15例。年龄31～67岁,平均(42.5±5.2)岁。A、B组诊断、分型均符合WHO(1999)对糖尿病的诊断、分型标准,3组在数量、性别、年龄等基础资料方面比较,P>0.05,具有可比性。

1.2 方法

分别抽取3组受检者3 mL空腹晨静脉血,于37℃下放置30 min,以3000 r/min速度离心10 min,分离血清,放置在-20℃下保存备用。以CLIA法(化学发光免疫分析法)测定、比较3组血清内谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体的存在情况,以RIA法(放射免疫分析法组定、比较3组胰岛素自身抗体的存在情况。所有检测操作均严格按照说明书进行规范操作。

1.3 统计方法

数据结果采用SPSS 17.0统计学软件进行分析处理,计数资料用()表示,采用t检验,以P<0.05为具有明显差异,有统计学意义。

2 结果

共3组,每组30例,A组谷氨酸脱羧酶抗体为70%(21/30),胰岛细胞抗体40%(12/30),胰岛素自身抗体26.67%(8/30),B组谷氨酸脱羧酶抗体为6.67%(2/30),胰岛细胞抗体16.67%(5/30),胰岛素自身抗体10%(3/30),C组谷氨酸脱羧酶抗体为0%(0/30),胰岛细胞抗体3.33%(1/30),胰岛素自身抗体0%(0/30),3组血清内谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的存在率由高至低依次为A组>B组>C组,P<0.05具有显著性差异,有统计学意义。

3 讨论

糖尿病属于临床常见代谢性疾病,主要特征为高血糖,是有胰岛素分泌缺陷或胰岛素生物作用受损或二者同时出现而引起。临床可将糖尿病分为Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖型)和Ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖型),两者的发病机制及治疗原则存在差异。所以,对糖尿病的准确分型是预防、治疗糖尿病的最基本的前提。Ⅰ型糖尿病属于自身免疫性疾病,具有器官特异性,患者血液中存在谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体等自身抗体(胰岛β细胞),检测上述抗体对糖尿病的鉴别分型具有重要意义。谷氨酸脱竣酶为Ⅰ型糖尿病自身抗原,能够将谷氨酸转化成对神经递质GABA (γ氨基丁酸)产生抑制性的限速酶,谷氨酸脱羧酶抗体是Ⅰ型糖尿病最早出现的一种抗体,临床症状出现前的一段较长时间即可出现,Ⅰ型糖尿病初发者血液检测的阳性率为70%～80%,而Ⅱ型糖尿病及正常人血液检测的阳性率较低或无法检出。胰岛细胞抗体属于胰岛自身细胞抗体,其与胰岛细胞表面抗原相结合发生免疫反应,将补体系统激活,导致细胞溶解、死亡而出现糖尿病[2]。Ⅰ型糖尿病初发者血液检测的阳性率为80%,临床症状出现后的6个月～3年内其逐渐减少、消失。而Ⅱ型糖尿病血液检测的阳性率为1.5%～8.3%,且有半数诊断为成人隐匿性自身免疫性糖尿病。所以检测胰岛细胞抗体有利于糖尿病分型的鉴别诊断,但胰岛细胞抗体也可同时出现在其他的自身免疫性疾病当中,所以单独检测胰岛细胞抗体对于预测糖尿病的价值有限。胰岛素自身抗体对于鉴别诊断治疗糖尿病、低血糖具有重要意义。正常人血液检出胰岛素自身抗体则提示患有Ⅰ型糖尿病的可能较大,可能是胰岛β细胞损伤产生,所以可作为自身免疫性胰岛β细胞损伤的标志物,有利于早期发现、预防Ⅰ型糖尿病。糖尿病患者血液检测谷氨酸脱羧酶抗体的存在率高于胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体,提示检测谷氨酸脱羧酶抗体对预测糖尿病具有较大价值。本研究显示,Ⅰ型糖尿病患者血清内谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的存在率明显高于Ⅱ型糖尿病患者及健康人。

综上所述,提示糖尿病检测谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体,对糖尿病分型、选择用药具有重要临床意义。

摘要：目的 探讨分析尿病检测谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的临床意义。方法 选取该院门诊2014年1月12月间接诊的30例Ⅰ型糖尿病患者(A组)和30例Ⅱ型糖尿病患者(B组)及30例健康体检者(C组),以CLIA法、RIA法测定、比较3组血清内谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的存在情况。结果 3组血清内谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的存在率由高至低依次为A组>B组>C组,P<0.05具有显著性差异,有统计学意义。结论 糖尿病检测谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体,对糖尿病分型、选择用药具有重要临床意义。

关键词：糖尿病,谷氨酸脱羧酶抗体,胰岛细胞抗体,胰岛素自身抗体

参考文献

[1]姜燕,谭立明,王外梅,等.谷氩酸脱羧酶抗体及胰岛细胞抗体对诊断糖尿病的临床意义[J].实验与检验医学,2009,27(6):634.

谷氨酸脱羧酶抗体 第2篇

关键词：2型糖尿病,谷氨酸脱羧酶抗体,成人迟发性自身免疫性糖尿病

成人迟发性自身免疫性糖尿病 (LADA) 是糖尿病的一种特殊类型[1]。病初临床表现同2型糖尿病患者, 可通过饮食及口服降糖药控制血糖, 但在病情发展过程中胰岛功能破坏较快, 几年甚至几个月后逐渐需要胰岛素治疗。患者血清中一般可以检测到针对胰岛成分的自身抗体如谷氨酸脱羧酶抗体 (GADA) 等。对2012年12月-2013年7月笔者所在医院门诊收治的213例初诊为2型糖尿病的患者进行GADA检测, 并将GADA阳性和阴性患者的临床情况进行对比分析, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

初发2型糖尿病患者213例, 其中男121例, 女92例, 平均年龄 (54.12±5.62) 岁。入选标准: (1) 符合2013年中国2型糖尿病防治指南诊断标准; (2) 年龄>20岁: (3) 病程<1年; (4) 无自发酮症 (或酮症酸中毒) 。排除标准: (1) 继发性糖尿病; (2) 妊娠糖尿病。

1.2 检测方法

采用美国BLOMERICA公司试剂盒, 用酶联免疫法测定。批内变异系数4.8%, 批间变异系数9.7%, 结果计算GADA滴度>1.05为阳性。

1.3 观察指标

包括性别、年龄、身高、体重、腰围、高血压史、高血脂史、家族史、用药情况、GADA、空腹血糖 (FPG) 、餐后2 h血糖 (2 h PG) 、空腹C肽 (FC-P) 、餐后2 h C肽 (2 h CP) 、糖化血红蛋白 (Hb A1c) 。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用x2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

男女各指标比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。213例初发2型糖尿病患者各临床指标, 详见表1。

2.2 GADA阳性检出情况

213例初发2型糖尿病患者, GADA阳性15例, 阳性率7%。

2.3 GADA阳性与GADA阴性患者临床特征比较

与GADA阴性患者相比, GADA阳性患者BMI低、C肽水平较低, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 详见表2。

3 讨论

从病因学上糖尿病可分为1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病是一种由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病, 体内可以检测到GADA、胰岛细胞抗体 (ICA) 、胰岛素自身抗体 (IAA) 等自身抗体, 临床上需早期应用胰岛素。2型糖尿病是由胰岛细胞功能缺陷和/或胰岛素抵抗引起, 多数不存在自身抗体, 临床上多采用口服药物治疗。LADA是一种特殊类型的1型糖尿病, 占糖尿病的10%~20%, 临床上以2型糖尿病起病[2,3], 血液中可以检测到自身抗体, 因其病初不需要胰岛素治疗, 常被误诊。早期识别LADA, 及早应用胰岛素, 对改善预后十分重要。

自身抗体是区分1型和2型糖尿病的重要指标。谷氨酸脱羧酶 (GAD) 是1型糖尿病的自身抗原, 在新发生的1型糖尿病及其前期患者血清中83%可检出GADA, 筛查GADA可以提高LADA患者的诊断率, 是诊断LADA的首选指标。

Zhou等[4]研究显示我国北方初发糖尿病GADA的检出率为6.5%, 与本研究基本一致, 提示在初诊为2型糖尿病的患者中, 还是有相当一部分LADA患者被误诊。Roh等[5]研究韩国成人中GADA阳性率为8.7%, 可能与种族、民族不同有关。本研究显示, GADA阳性的糖尿病患者具有体重指数偏低、胰岛功能差的临床特点, 与谢晓娜等[6]研究结果一致。Roh等[5]也发现, GADA与BMI、C肽成负相关。所以, 对于初发的糖尿病患者, 特别是体重指数偏低、血清C肽水平较低且无糖尿病家族史的患者进行GADA筛查, 有助于早期发现并诊断LADA。

本研究中, 部分GADA阳性患者存在腰围、BMI超标、胰岛素水平升高、合并高血压、血脂紊乱, 表明LADA患者虽然主要表现为胰岛素分泌不足, 但部分也存在胰岛素抵抗, 与孙胜花等[7]报道结果一致。所以LADA患者在诊断后需要尽早使用胰岛素治疗, 对肥胖患者要同时配合胰岛素增敏剂治疗。

本研究中, 213例初发糖尿病患者中, 52例年龄小于40岁, 提示糖尿病的发病逐步年轻化, 应引起重视。2009年的调查显示, 我国31.5%初发糖尿病患者使用胰岛素治疗[8], 本研究中这一比例仅为20.3%, 胰岛素的使用水平与人群的文化水平和健康素养呈正相关, 提示要加强健康教育工作, 提高人群对糖尿病及相关知识的了解。

参考文献

[1]杨秋平.妊娠高血压综合征10例围手术期护理体会[J].山西医药杂志, 2010, 39 (10) :1042-1043.

[2]王丽萍.妊娠高血压综合征患者的麻醉体会[J].中国医药指南, 2012, 10 (29) :123-124.

[3]彭伟.腰-硬联合麻醉和硬膜外麻醉在妊娠高血压综合征患者手术中的应用[J].医学信息, 2013, 12 (24) :789-790.

[4]张洪兴.100例妊娠高血压综合征剖宫产麻醉处理[J].海南医学院学报, 2010, 16 (5) :628-629.

[5]蓝英年.妊娠高血压综合征并发心力衰竭剖宫产的麻醉处理[J].中国现代药物应用, 2010, 19 (20) :365-366.

[6]朱世明, 魏勇剑, 顾静凡.98例妊娠高血压综合征剖宫产手术的麻醉处理体会[J].中国医药导报, 2010, 8 (3) :96-99.

[7]李清桃, 刘亚琼.妊娠合并HELLP综合征的临床特点与结局分析[J].中外医学研究, 2014, 12 (34) :126-127.

谷氨酸脱羧酶抗体 第3篇

L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,PanD)能催化L-天冬氨酸(L-aspartic acid,L-Asp)脱去α-羧基产生等摩尔的β-丙氨酸(β-Alanine,β-Ala)和CO2[1](图1)。

β-丙氨酸是自然界唯一存在的β型氨基酸,随着β-丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟,β-丙氨酸在医药、化工、食品、环境等领域的应用日渐广泛[2],如:合成泛酸钙、肌肽、甜味剂,作为水的净化絮凝剂、电镀缓蚀剂等[1]。目前,β-丙氨酸的工业生产主要通过化学合成法[1]。但化学合成法工艺要求严苛,大多需要强酸强碱和高温高压的条件,产生大量腈类副产物和无机盐等“工业三废”,不利于产品的分离纯化,严重污染环境[3,4]。微生物酶法生产β-丙氨酸污染少,符合绿色生产要求。但酶法生产β-丙氨酸尚未产业化,其限制是生物体内的PanD酶活较低[5]。因此,提高PanD酶的活性和产量,是实现β-丙氨酸清洁生产的关键。

本研究以L-天冬氨酸为底物,通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法快速检测转化液中L-天冬氨酸和β-丙氨酸的含量,通过分析和比较,建立PanD高产菌株的初筛方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本实验室构建并保存的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD(亲本株)、高产突变株及15株随机突变株。

1.1.2 仪器

恒温培养摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)、隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)、高效液相色谱仪(日本岛津)、高速冷冻离心机(日立工机株式会社)、pH计(上海精密仪器仪表公司)、立式压力蒸汽灭菌器(上海医用核子仪器厂)等。

1.1.3 培养基

(1)种子和发酵培养基:蛋白胨10g·L-1,酵母粉5g·L-1,氯化钠5g·L-1,pH 7.0,121℃灭菌20min。灭菌后,在温度低于60℃时加入卡那霉素(Kan)至终浓度为50μg·mL-1。

(2)固体培养基:蛋白胨10g·L-1,酵母粉5g·L-1,氯化钠5g·L-1,琼脂20g·L-1,pH 7.0,121℃灭菌20min。灭菌后,温度低于60℃时加入卡那霉素(Kan)至终浓度50μg·mL-1。

(3)平板点种筛选培养基:将琼脂1g加入50mL蒸馏水中,煮沸后,加入300μL溴酚蓝溶液和0.25g L-天冬氨酸,混匀后倒平板。

(4)平板打孔筛选培养基:将琼脂1g加入50mL蒸馏水中,煮沸后,加入300μL溴酚蓝溶液,混匀后倒平板,待平板凝固后,打孔器打孔。

1.1.4 试剂和药品

转化液:0.2 mol·L-1L-天冬氨酸溶液,用NaOH调pH至7.0,121℃灭菌20min。

0.04mol·L-1的溴酚蓝溶液(pH 3.0~4.6):称0.1g溴酚蓝固体溶于7.45mL 0.02mol·L-1NaOH溶液中,用超纯水定容至250mL。

纸层析展开剂:正丁醇、醋酸和水按8∶1∶2混合。

纸层析显色剂:茚三酮粉末0.5g加丙酮100mL配成0.5%茚三酮-丙酮溶液。

L-天冬氨酸购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;β-丙氨酸购自国药集团化学试剂有限公司;色谱纯乙腈购自天津四友精细化学品有限公司;2,4-二硝基氟苯购自上海医药集团;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 发酵方法

将菌株于斜面活化后接入装有3mL种子培养基的试管中,37℃,200r·min-1摇床培养12h,以2%接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中,37℃,200r·min-1摇床培养约2.5h,OD600nm为0.6~0.8时加入诱导物,继续发酵24h。

1.2.2 转化方法

取适量发酵液于离心管中,5 000r·min-1、4℃离心5min,去上清。将菌体用5mL生理盐水洗涤两次,加入转化液,37℃转化24h。

1.2.3 检测方法

(1)试管法:分别取1、3、5、10、20 mL发酵液按1.2.2所述方法处理,加1mL生理盐水悬浮菌体。取汉德氏管倒置于装有5 mL转化液的试管,将菌悬液沿壁加入试管中,塞上橡皮塞,置于37℃恒温培养箱转化48h。观察倒置管中的气泡大小,用pH计测定转化液的pH,并用高效液相色谱法(HPLC)检测转化液中L-天冬氨酸和β-丙氨酸的含量。

(2)平板法:点种法:将亲本株和高产株按1.2.1所述进行发酵,分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL发酵液于离心管中,5 000r·min-1、4℃离心5min,弃上清。将菌体点样在溴酚蓝筛选平板上,放置于37℃恒温培养箱。反应1、5h后,观察平板上菌苔的显色情况。打孔法:将亲本株和高产株按1.2.1所述发酵后,分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL发酵液,5 000r·min-1、4℃离心5 min,弃上清。加入5g·L-1的L-天冬氨酸溶液100μL,重悬菌体,置于37℃恒温培养箱转化1h。取70μL L-天冬氨酸溶液加入溴酚蓝打孔平板的孔中,室温放置0.5、2h后,观察溴酚蓝平板上的显色情况。

(3)Berthelot法:分别取1mL一定浓度的β-丙氨酸、L-天冬氨酸溶液及其混合溶液于试管中,加入硼酸缓冲液200μL,立即放置冰上。加入6%苯酚溶液1mL、5.2%次氯酸钠溶液1mL,震荡混合后,沸水浴10 min,取出冰上放置10 min。取200μL加入96孔板中,测定630nm下的吸光值。

(4)纸层析法:将层析滤纸裁成15cm宽的长方形,在距下端1.5cm处划线,用2.5μL移液器上样两次,每次1μL,样品间距1cm。将滤纸卷成筒状,固定后放入含展开剂的层析缸中,采用单向上行法展层约3.5h,停止层析。待展开剂自然挥发后,均匀地喷上茚三酮-丙酮溶液,吹风机吹至出现蓝紫色斑点。

(5)高效液相色谱法:L-天冬氨酸和β-丙氨酸的精确测定采用高效液相色谱法[6]。

2 结果与分析

2.1 试管法筛选PanD高产株

PanD催化L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸的过程中会产生CO2气体,可以通过Warburg检压法测定微量气体变化进行筛选[7]。L-天冬氨酸为酸性氨基酸,有两个羧基,等电点为3.0,β-丙氨酸为中性氨基酸,有一个羧基,等电点为6.9,当L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸后,转化液pH值升高。

图2为亲本株和高产株转化液的液相检测结果,表1为倒置管中的气体产生情况。由图2可知,随着菌体量增加,转化液L-天冬氨酸的残留量下降,β-丙氨酸的含量上升。相同菌体量下,高产株的β-丙氨酸产量明显高于亲本株。由表1可知,随着亲本株菌体量增加,倒置管中均无气泡,高产株10mL和20mL菌体的转化液中均有气泡产生,且20mL菌体的气泡比10mL的大,可见本方法可以通过气泡大小反映PanD的酶活高低或酶量多少,但需要的菌体量较多,结果误差较大,难以进行大规模筛选。因此不建议用该方法进行PanD高产株的筛选。

注:“-”表示倒置管内无气泡,“+”表示倒置管内有气泡,“++”表示气泡较大Note:“-”represents no bubble,“+”represents bubble in tube,“++”represents bigger bubble in tube

图3为亲本株和高产株不同菌体量转化液的pH值检测结果。由图3可知,同一菌株随着菌体量增加,转化液的pH逐渐上升,5 mL时pH达到最大值,10mL菌体时pH值下降,说明随着β-丙氨酸的产生,转化液pH的上升不呈规律。相同菌体量下,高产株转化液的pH并没有比亲本株高,说明转化液pH的变化与β-丙氨酸产量不呈正相关关系,难以用该方法对PanD高产菌进行筛选。

2.2 溴酚蓝平板法筛选PanD高产株

酸碱指示剂可以检测转化过程中的pH变化,左斌等以溴甲酚绿(pH 3.8~5.4)为指示剂,筛选谷氨酸脱羧酶(GAD)高产突变株[8],张凯等[9]通过含溴甲酚紫(pH 5.2~6.8)的LBXL平板筛选出了高酶活的赖氨酸脱羧酶。

图4为两菌株平板点种法显色结果,从图中A、B可以看出,37℃孵育1h后,菌苔边缘均出现蓝色,由图C、D可以看出,随着转化时间延长至5h,菌苔边缘蓝色均变深,说明随着转化时间延长,转化的底物增多,pH上升。同一菌株随着菌体量增加,菌苔颜色没有明显区别,如图A、B中的菌苔3、4、5,这是由于PanD是胞内酶,无法渗透到培养基中,只能转化细胞周围的L-天冬氨酸,菌体量增加,转化反应的强度相似。由图4可以看到,相同菌体量下,亲本株菌苔颜色较高产株浅,呈蓝绿色,如图B的菌苔4和5,而高产菌的菌苔颜色较深,呈蓝色,如图B的菌苔9与10,说明相同菌体量和转化时间下,高产株转化的L-天冬氨酸更多,pH上升幅度更大,与预期相符。由于本方法对与PanD活性相近的菌株显色差别不明显,误差较大,不建议用于PanD高产株的筛选。

注:A:37℃孵育1h平板正面;B:37℃孵育1h平板反面;C:37℃孵育5h平板正面;D:37℃孵育5h平板反面;1~5菌苔:0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL亲本株发酵液的菌体;6~10菌苔:0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL高产株发酵液的菌体Note:A:The front of plate nurtured at 37℃for 1h;B:The back of plate nurtured at 37℃for 1h;C:The front of plate nurtured at 37℃for 5h;D:The back of plate nurtured at 37℃for 5h;1~5lawn:0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL parenty strain;6~10lawn:0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL highly produc-tive mutant

图5为两菌株平板打孔法的显色结果,由图A和图B可以看出,转化0.5、2h后,溴酚蓝平板上均出现黄色变色圈,反应2h比0.5h的变色圈更大,说明转化液中残留的L-天冬氨酸能在琼脂中扩散,使小孔周围pH降低,溴酚蓝指示剂由蓝紫色变为黄色。

由图B中两菌株不同菌体量的转化液显色结果可知,菌体量越多,变色圈越小,如孔1和5,说明PanD酶量越多,转化率越高,pH值越高,变色圈越小。

相同菌体量下,亲本株的变色圈明显大于高产突变株,如孔2的变色圈明显大于孔7,说明PanD酶活越低,转化液中L-天冬氨酸残留量越多,变色圈越大。因此,可以用变色圈的大小来筛选PanD高产株。笔者发现,不同菌株的转化率不同,在转化过程中,转化率低的菌株会消耗更多L-天冬氨酸,但产生的β-丙氨酸却很少,用该法筛选PanD高产菌会有较大误差。

注:A:溴酚蓝平板显色0.5h;B:溴酚蓝平板显色2h;0:5g·L-1 L-天冬氨酸溶液;1~5孔:亲本株0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL菌体量的转化液;6~10孔:高产株0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL菌体量的转化液Note:A:Bromophenol blue plate colorate for 0.5h;B:Bromophenol blue plate colorate for 2h;0:5g·L-1 L-Asp;1~5:Parent strain transformation liquid of 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL;6~10:highly productive mutant transformation liquid of 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL

2.3 Berthelot法筛选PanD高产株

Berthelot反应是利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应生成蓝色的吲哚酚类,具有极高的灵敏度,常用来测定不同体系中微量氨及其盐类[10]。Berthelot法测定谷氨酸脱羧酶酶活已有报道[10~12]。氨基酸中氨基的位置不同,对Berthelot反应的响应程度也不同[10]。L-天冬氨酸是α-氨基酸,在Berthelot反应中,L-天冬氨酸响应低,而β-丙氨酸的β氨基反应相对灵敏,利用两者在反应体系中吸光值的差别可以达到测定混合氨基酸中β-丙氨酸的目的。

不同浓度的β-丙氨酸和L-天冬氨酸标准溶液Berthelot显色结果见图6。在Berthelot反应中,L-天冬氨酸和β-丙氨酸在630nm处的吸收值均随其浓度的增加而增加,当两种氨基酸浓度都在7mmol·L-1以下时,β-丙氨酸的吸收值大于L-天冬氨酸,但两者差别不显著。

表2为L-天冬氨酸和β-丙氨酸的混合溶液的Berthelot法检测结果。混合溶液中β-丙氨酸和L-天冬氨酸总浓度不变,随着β-丙氨酸浓度的增加,630nm处的吸光值均在0.3左右,未呈线性增加。这可能是由于β-丙氨酸的氨基在β位,距离α位太近,不如γ-氨基丁酸等氨基酸的响应值大,因此,用Berthelot法筛选PanD高产株并不可行。

mmol·L-1

2.4 纸层析法筛选PanD高产株

纸层析是在滤纸上进行的一种层析分离方法,根据溶液各组分在固定相和流动相中溶解度不同,即分配系数不同,达到分离的目的[13]。纸层析法已得到广泛应用,是进行氨基酸混合物分离分析及筛选氨基酸高产菌株的常用方法[12~14]。

图7为β-丙氨酸和L-天冬氨酸混合溶液的纸层析结果,L-天冬氨酸的Rf值小于β-丙氨酸的Rf值,两者可以达到较好的分离效果,且斑点清晰。随着L-天冬氨酸浓度减小,下方紫色斑点逐渐变小,颜色变浅,β-丙氨酸浓度增加,上方的蓝色斑点变大,颜色变深。

注:1:0.4mol·L-1β-丙氨酸溶液;2:0.1mol·L-1L-天冬氨酸溶液;3~6:0.1mol·L-1β-丙氨酸:0.1mol·L-1L-天冬氨酸=1:4、2:3、3:2、4:1Note:1:0.4mol·L-1β-Ala;2:0.1mol·L-1L-Asp;3~6:0.1mol·L-1β-Ala:0.1mol·L-1L-Asp=1:4、2:3、3:2、4:1

表3为PanD的15株突变株转化液的液相检测结果,由表3可以看出,不同的PanD突变株的β-丙氨酸产量和L-天冬氨酸的残留量差别较大;图8为这15株突变株转化液的纸层析显色结果。可以看出,转化液L-天冬氨酸含量越高,紫色斑点越大,颜色越深,β-丙氨酸含量越高,蓝色斑点越大,颜色越深。当β-丙氨酸的产量提高幅度较大时,显色差别明显,如高产株3、10、11、12和低产株2、4、8、9等。因此,可以通过纸层析法快速筛选PanD高产菌。

g·L-1

1~15:15株突变株转化液;0:5g·L-1L-天冬氨酸溶液;16:1g·L-1β-丙氨酸溶液1~15:transformation liquid from 15 mutants;0:5g·L-1L-Asp sample standard;16:1g·L-1β-Ala sample standard

3 讨论

PanD酶活的精确测定主要包括同位素标记法和高效液相色谱法[1]。同位素标记法具有一定辐射,且操作复杂,成本高,对实验条件要求较高,难以在普通实验室中进行大规模测定。高效液相色谱法检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸时,由于这两种氨基酸没有紫外吸收,需要毒性较大的衍生试剂2,4-二硝基氟苯、苯基异硫酸酯等进行衍生,1个样品需要30min左右的检测时间,难以对PanD高产菌进行快速筛选。

本研究通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对PanD酶活进行测定,实验中发现:由于试管法中产生的CO2会被转化液吸收,难以通过收集的气体量表征β-丙氨酸的产量,也难以通过转化液pH的变化来筛选,该法需要的菌体量较多,操作较繁琐,难以大规模筛选。平板法点种时,由于PanD是胞内酶,无法扩散到培养基中作用产生显色圈,也无法通过显色圈的大小检测β-丙氨酸的产量。不同PanD活性的菌株在平板上的菌苔颜色有所差别,但酶活差距不大时,颜色区别不明显。在平板打孔法实验中,PanD酶量越少、酶活越低,变色圈越大,可以通过筛选变色圈小的菌株来筛选PanD的高产菌,但该法只能筛选底物L-天冬氨酸的减少,不能直接筛选β-丙氨酸增加的高产菌株。Berthelot检测法基于氨基在不同位置的检测灵敏度不一[10],本文研究时相同浓度的β-丙氨酸与L-天冬氨酸响应值相似,说明β-丙氨酸的吸收值与L-天冬氨酸一样偏低,与文献报道的吸收值有差距。纸层析法分析转化液中L-天冬氨酸和β-丙氨酸含量与高效液相色谱法的结果一致,具有较高的准确度。相对于前三种方法,纸层析法操作简单,所需样品少,成本低廉,可以进行大批量操作,通过比较β-丙氨酸斑点的大小和深浅,可以直观、较为快速地筛选出β-丙氨酸的高产株。

摘要：通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。

谷氨酸脱羧酶抗体 第4篇

Asd基因重组于DsbA的下游,可在LB培养基中获得高效可溶性表达,但是不具生物学活性。在此基础上对其进行复性的研究,旨在获得高活性的天冬氨酸脱羧酶的条件。

1材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒

E.coliDH5α菌株,E.coli BL21(DE3)菌株均由本实验室保存;pDsbA-Asd质粒由实验室构建保存,该质粒含表达融合蛋白DsbA-GSGSG-6HisTag-DDDDK-Asd的重组DNA序列,氨苄青霉素抗性。

1.1.2 试剂和器材

Yeats Extract,上海生工生物工程有限公司;Tryptone,上海生工生物工程有限公司;NaCl 分析纯AR,太参美达试剂有限公司;琼脂,福建泉州泉港化工厂;各种溶液用蒸馏水配制。

1.2 实验方法

1.2.1 Asd融合蛋白的制备

挑取基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pDsbA-6His-Eksite-Asd单菌落,接入含有50 mgL-1 Amp的LB培养基中,33 ℃,200 rmin-1振荡过夜,按照1%的接种量转接于含有50 mgL-1 Amp的LB培养基中,33 ℃,200 rmin-1振荡培养至OD600 nm为0.5时,添加终浓度为0.1 mmolL-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG ),30 ℃诱导4 h。5 000 rmin-1离心15 min收集菌体,用pH 8.0,50 mmolL-1 Tris-HCl缓冲液重悬后进行超声破碎(超声3 s,间隔4 s,重复300次)。细胞破碎液在12 000 rmin-1下离心10 min,收集上清,弃沉淀。

将收集上清溶液缓慢的加入硫酸铵,边加边搅拌,防止局部浓度过高是蛋白的结构破坏,最终使硫酸铵达到22%的饱和度,静置4 h后悬浮沉淀,然后分别取1 mL悬浊液分装于EP管中,12 000 rmin-1下离心10 min,收集沉淀,弃上清,-20 ℃下保存。

1.2.2 Asd融合蛋白的复性研究

用普通的培养基培养获得Asd融合蛋白是不具有酶活性的,这种酶对温度和pH比较敏感[2]。因此以下主要针对这两个因素进行分析。复性缓冲液的pH值必须在7.0以上,这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成,过高或过低会降低复性效率。

1.2.3 L-丙氨酸含量的测定

滤纸层析法[3]:吸取10 μL反应液点样到新华中速层析滤纸上,在V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶1∶1的层析系统中展层,然后用0.5%的茚三酮乙醇溶液显色,再以V(0.1%CuSO45H2O)∶V(75%乙醇)=2∶38的洗脱液洗脱,测定洗脱液在520 nm处的光吸收值。根据标准曲线计算L-丙氨酸的含量。

1.2.4 Asd酶活力的测定

参照徐虹[4]等的方法,取L-Asp0.1 g加到适量的蒸馏水中,用0.1 molL-1的HCl调pH到5.0,最后定容到100 mL。以1∶10的体积之比,分别取复性混合液100 μL加入到1 mlL pH 5.0的L-Asp中,在37 ℃条件下反应1 h终止反应,然后用滤纸纸层析法分析反应液中L-丙氨酸的含量,计算酶活力。

酶活力单位定义为:37 ℃,1 h内,转化1 μmol L-天冬氨酸生成L-丙氨酸定义为一个酶活力单位(μmol/h)。

1.2.5 Tris-HCl缓冲液各因素对复性影响

① 温度对Asd复性的影响

取4支冷冻保存在-20℃下的Asd融合蛋白,用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液下溶解,分别保温在30℃,40℃,50℃,60℃水浴中4 h。然后,每隔30 min取一样进行活性测定。

② pH对Asd复性的影响

运用①实验的最佳温度进行本步实验。我们设置了10个梯度,pH值分别为8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0的Tris-HCl缓冲液,用这些不同pH值的Tris-HCl缓冲液分别取1 mL来溶解Asd融合蛋白,水浴2 h,然后做活性测定。

③ 复性时间对Asd复性的影响

运用②最佳的pH值进行本步实验,在此,我们将应用这个最适的pH值的Tris-HCl缓冲溶液进行复性。在40 ℃的条件下水浴,每隔30 min取一次样,共水浴4 h,然后做活性测定。

1.2.6 其他缓冲溶液对Asd复性的影响

在此我们选取了3种pH值能够达到8.0～9.0之间缓冲溶液,分别是:氨水缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。把它们的pH值都调到最佳值,在最适温度下水浴4 h,然后做活性测定。

2结果与分析

2.1 Tris-HCl缓冲液各因素对复性影响分析

2.1.1 温度对Asd复性的影响分析

将反应液离心,取上清10 μL作为上样量,做酶活力测定。通过研究发现,浓度为10 mmolL-1,pH8.0的Tris-HCL缓冲溶液在40 ℃能够快速的复性Asd融合蛋白,低于40 ℃也有复性的效果,只是所需时间较长,高于40 ℃,复性的效率又会降低,甚至是蛋白酶失活(图1)。

(A:30 ℃ B:40 ℃ C:50 ℃ D:60 ℃)

2.1.2 pH对Asd复性的影响分析

将反应液离心,取上清10 μL作为上样量,做纸层析。通过研究发现,浓度为10 mmolL-1的pH8.7的Tris-HCL缓冲溶液在40 ℃条件下能够使Asd融合蛋白快速复性(如图2)。

2.1.3 复性时间对Asd复性的影响分析

将反应液离心,取上清10 μL作为上样量,做纸层析。通过研究发现,浓度为10 mmolL-1,pH8.7的Tris-HCL缓冲溶液在40 ℃条件下2 h就能够快速的复性Asd融合蛋白(如图3)。

2.2 其他缓冲溶液对Asd复性的影响分析

将反应液离心,取上清10 μL作为上样量,做纸层析。通过研究发现 Asd在浓度为10 mmolL-1、pH8.7的Tris-HCL缓冲溶液中,40 ℃条件下水浴2 h够快速的复性Asd融合蛋白,其他的缓冲溶液基本上没有什么活性(如图4)。这说明:复性缓冲溶液本身对蛋白酶的复性是有影响的。不同的缓冲溶液对蛋白质氧化作用是不一样的,Tris-HCl缓冲溶液对蛋白质的氧化作用比较小,而其他的缓冲溶液的氧化作用比较大。

3讨论

在天冬氨酸脱羧酶的复性研究中,复性液pH,复性温度,复性时间,复性液种类等都对天冬氨酸脱羧酶体外复性有很大影响。

蛋白质的复性对环境中的理化条件有很高的要求,复性时必须对温度、pH、离子强度等进行严格的限制,同时蛋白质本身的性状也对复性效率产生影响。本实验本是研究各蛋白质的复性温度、复性液pH、复性液的时间、复性液的种类等因素对复性的影响,使用常规复性液的复性效果后发现,使用变性剂和复性液不能够使其复性,但是仅用Tris-HCl缓冲液就有复性效果,而且效果很好,所以直接改为研究Tris-HCl缓冲液的各种因素在复性中的影响了。

Tris-HCl做为一种蛋白质复性的一个重要缓冲液,方法简单,而且复性液比较容易配制,比常规的混合复性液操作更简单,但是它可能只是对于天冬氨酸脱羧酶有一定的复性效果,如果换成其它的蛋白质,就不一定适用,所以对蛋白质复性,还需要更多的研究,寻找比较简单,且对多种蛋白质有复性效果的复性液。

参考文献

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[3]吴薇.固定化德阿昆哈假单胞菌生产L-丙氨酸的研究[D].杭州,浙江大学,2002.

谷氨酸脱羧酶抗体 第5篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

肝癌细胞株Hep G2、淋巴瘤细胞株Jurkat由作者实验室保存。

1.1.2 试剂

MTT细胞增殖分析试剂购于Promega公司,兔抗人ODC抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司,羊抗兔Ig G-HRP购自北京中杉金桥公司,TRIzol总RNA纯化试剂和转染试剂Lipofectamine 2000TM由Invitrogen公司提供;限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、RT-PCR及PCR试剂盒由Fermentas公司提供,ECL化学发光检测试剂为GE Healthcare公司产品,米托蒽醌(Mitoxantrone,NT)为浙江海正药业公司产品。其它化学试剂由Sigma等公司提供。

1.1.3 仪器

EPLCS XL流式细胞分析仪为Becman-Coulter公司产品,全波长酶标仪为Thermo公司产品,Sirius荧光仪为Berthold公司产品,Gel Logic-200凝胶图象分析仪为Kodak公司产品。PCR引物合成及DNA测序由上海生工公司完成。

1.1.4 培养基

RPMI-1640细胞培养基,小牛血清购于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 Trizol法提取细胞总RNA

收集传代培养至对数期的Jurkat细胞,用PBS洗2次后转入1.5ml的EP管中,再加800μl Trizol试剂。待细胞充分裂解后,向EP管中加300μl氯仿,充分颠倒混匀后室温下静置10min,4℃下13 000r/min离心10min,然后将上清转入新的EP管中,加入500μl异丙醇沉淀RNA,4℃下13 000 r/min离心10min,沉淀用600μl 75%酒精溶液洗涤2次,离心去上清,所得RNA用20μl DEPC-H2O溶解,-80℃保存备用。

1.2.2 RT-PCR克隆ODC的c DNA

以5μg的RNA为模板,oligo(d T)18为引物,在M-MLV反转录酶的催化下,将m RNA反向转录为c DNA第一链。再以2μl反转录产物为模板进行巢式PCR扩增,PCR外侧上游引物(P1)为:5′-CACACGCAGAGGGATTTGGAATTC,外侧下游引物(P2)为:5′-TCTTCCATATGGCTGCATCATGGC。内侧上游引物(P3)为:5′-GCTGCTCGAGATGA ACAACTTTGGTA-ATGAAG,内侧下游引物(P4)为:5′-CCTGAAGCTTCTACA-CATTAATA CTAGCCG。在内侧上下游引物的5′-末端分别引入酶切位点XhoⅠ和HindⅢ以利于随后的克隆操作。外侧PCR的反应体系是30μl,反应条件为:94℃5min;94℃40s,58℃30s,72℃2min,30个循环;72℃10min。将外侧PCR产物1:100稀释后为模板进行内侧PCR扩增,体系为50μl,反应条件为:94℃5min;94℃40s,55℃40s,72℃90s,30个循环;72℃10 min。

1.2.3 质粒pc DNA3.

1(-)/ODC的构建与鉴定用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ消化巢式PCR所得产物和pc DNA3.1(-)质粒载体,1%琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段,切胶回收载体和ODC基因片段,两片段连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并用酶切鉴定和DNA测序鉴定。

1.2.4 含ODC基因反义片段的质粒pc DNA3.1(+)/RODC的构建

以构建成功的重组质粒pc DNA3.1(-)/ODC为模板,扩增由ODC基因第3和第4外显子编码的序列,PCR上游引物(P5):5′-GCTGCTCGAGATGAACAACTTTGGTAATGAAG,下游引物(P6):5′-GCTCAAGCTTAACTGTATTTCAGTCTTGC-TAG,在两引物的5′-末端分别引入酶切位点XhoⅠ和HindⅢ,所得目的片段经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后,克隆入真核表达载体pc DNA3.1(+)中并转化大肠杆菌DH5α,筛选出的阳性克隆用酶切鉴定和DNA测序鉴定。

1.2.5 ODC表达抑制的Hep G2细胞株的构建与筛选

常规培养Hep G2细胞至60%融合时,用脂质体转染法将pc DNA3.1(+)/RODC质粒导入Hep G2细胞,转染4h后换常规细胞培养液培养24h,然后用含400mg/L G418的培养液培养3w,挑选细胞单克隆继续放大培养,用RT-PCR和Western印迹法从中筛选ODC表达抑制的阳性细胞株。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖

将对数生长期的Hep G2细胞以2106个/L接种于96孔板中,每孔100μl。37℃培养24h后,向孔内加入不同浓度(0μg/L,1μg/L,5μg/L,50μg/L,100μg/L)米托蒽醌/RPMI-1640培养基100μl。分别培养24h、48h或72h后,去细胞培养液,加入浓度为200mg/L的MTT/RPMI-1640培养基(无血清和双抗)每孔100μl,37℃继续培养4h,去上清后每孔加200μl DMSO,室温下溶解结晶20min,然后在全波长酶标仪上读取波长为570nm的吸光值A。细胞生存率=A药物/A对照100%。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期

将对照和低表达ODC的Hep G2细胞用含80%乙醇的固定液(80%无水乙醇,1.99mmol/L PBS,0.5mmol/L EDTA Na2)固定1h,PBS洗涤细胞1次,再加入500μl DNA染色液(0.1%Triton X-100,50mg/L RNase,8.95mmol/L PBS,100mg/L Propidium Iodide),室温避光保温30min后,经流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.8 DNA片段化分析

用10μg/L的米托蒽醌处理对照和低表达ODC的Hep G2细胞48h后收集细胞,PBS洗涤一次,用DNA片段化裂解液(50mmol/L Tris-HCl p H 8.0,20mmol/L EDTA,0.5%Triton X-100)在冰上裂解细胞30min。1 2000 r/min离心10min去除细胞核后将上清转到新的离心管中,经等体积酚/氯仿抽提,将上清转入新的试管并加入1/10体积3mol/L醋酸钠(p H5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀核酸,将沉淀溶于0.1XSSC缓冲液后,加入无DNA酶的RNase 37℃消化1h,加Na Cl至终浓度为1mol/L,等体积酚/氯仿再次抽提,乙醇沉淀,最后将DNA片段溶解于dd H2O中,1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.9 统计学方法

实验结果以均数±标准差表示,使用SPSS11.5软件进行统计学分析,样本均数的比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 ODC的克隆与真核表达载体构建

采用反转录-巢式PCR技术从Jurkat细胞的总RNA中扩增获得ODC基因的c DNA(Fig.1)。在巢式PCR一对内侧引物的5′末端,分别设计有XhoⅠ和HindⅢ酶切位点,PCR产物片段大小为1 386bp,经上述两种酶酶切后,双粘端克隆入pc DNA3.1(-)的真核表达载体中,小量制备的pc DNA3.1(-)/ODC质粒经XhoⅠ+HindⅢ和NdeⅠ分别消化,所得限制性片段大小与预期一致(Fig.2)。经DNA测序分析证实,ODC的碱基序列、插入方向和阅读框架均正确。

2.2 ODC基因反义RNA真核表达载体的构建

以pc DNA3.1(-)/ODC质粒为模板,PCR扩增ODC基因中由第3和第4外显子编码、长290bp的DNA片段(Fig.3)。上述片段经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后,克隆进pc DNA3.1(+)的真核表达载体,筛选的阳性质粒经酶切、PCR以及DNA测序鉴定,插入片段的大小、碱基序列和插入方向正确无误(Fig.4)。在细胞内,该真核表达质粒将指导合成出能与天然ODC m RNA分子部分互补的反义RNA链。

2.3 低表达ODC细胞株的构建与筛选

用pc DNA3.1(+)/RODC转染Hep G2细胞后,G418筛选3w,得到的细胞单克隆继续放大培养,收集细胞提取细胞的总RNA和细胞总蛋白,然后用RT-PCR和Western Blotting筛选ODC低表达的阳性细胞株。结果细胞株Hr1被证明在m RNA水平(Fig.5)和蛋白水平上(Fig.6)均有ODC的表达抑制。

M:DNA Marker;1:PCR product by primer P1 and P2;2:PCR product by primer P3 and P4.

M:DNA Marker;1:pc DNA3.1(-)/ODC;2:pc DNA3.1(-)/ODC digested by XhoⅠand HindⅢ;3:pc DNA3.1(-)/ODC digested by NdeⅠ.

M:DNA Marker;P:PCR product by primer P5 and P6.

M:DNA Marker;1:pc DNA3.1(+)/RODC;2:PCR product with primer P5 and P6;3:pc DNA3.1(+)/RODC digested by XhoⅠand HindⅢ;4:pc DNA3.1(+)/RODC digested by XhoⅠand NdeⅠ.

2.4 ODC基因反义RNA抑制Hep G2细胞的生长

MTT实验结果显示,当用可表达ODC反义RNA的载体pc DNA3.1(+)/RODC稳定转染Hep G2细胞后,细胞的生长速率显著性低于Hep G2对照细胞,提示ODC反义RNA能抑制肝癌细胞的生长。

Data expressed as the mean±SD(n=3),*p<0.05,p<0.01.

2.5 ODC基因反义RNA对Hep G2细胞周期的影响

用流式细胞术检测了Hep G2对照细胞和Hr1细胞的细胞周期状态,结果发现,ODC反义RNA使Hep G2细胞G1期细胞显著性增加,而S期细胞显著性下降,表明ODC反义RNA导致Hep G2细胞G1/S周期抑制。

Data expressed as the mean±SD(n=3),*p<0.05.

2.6 ODC基因反义RNA改变细胞对抗癌药物米托蒽醌的敏感性

(1)用MTT法检测了抗癌药物米托蒽醌对Hep G2对照细胞和Hr1细胞的生长抑制作用,结果显示,Hr1对药物的反应比对照细胞更加敏感。用50μg/L的米托蒽醌处理两种细胞48h后,药物对对照细胞的抑制率为25.5%而对Hr1的抑制率为45.1%;处理72h后药物对对照细胞的抑制率为48.2%,对Hr1的抑制率高达70.1%;100μg/L米托蒽醌处理48h后,药物对Hep G2和Hr1的抑制率分别是33.4%和60.6%,72h后的抑制率分别是60.8%和83.8%(Fig.8)。

(2)DNA片段化分析发现,用10μg/L米托蒽醌处理Hep G2对照细胞和Hr1细胞48h后,Hr1细胞DNA片段化的程度较对照细胞明显增加(Fig.9),提示用反义RNA抑制ODC表达后,抗癌药物米托蒽醌更容易诱导其发生细胞凋亡。

M:DNA Marker;1:Hep G2 control cells treated by 10μg/L mitoxantrone for 48 hours;2:Hr1 cells treated by 10μg/ml mitoxantrone for 48 hours.

3 讨论

ODC基因被认为具有癌基因的特性,多种肿瘤细胞中ODC基因表达及其酶活性均显著增高,用ODC抑制剂处理则能抑制肿瘤细胞的生长,由此ODC逐渐成为广受关注的抗肿瘤药物设计和治疗的靶点[4,5]。

由ODC高表达导致的多胺合成增加是肿瘤细胞快速增殖的分子基础之一[6,7,8]。为了评价ODC反义RNA在抗肿瘤治疗中的作用,本研究中我们首先克隆出由ODC基因第3和第4外显子编码的c DNA序列,并反向插入真核表达载体pc DNA3.1(+)中。由于该插入序列覆盖ODC翻译起始位点及其附近区域,用pc DNA3.1(+)/RODC稳定转染肝癌Hep G2细胞后,该质粒指导合成出能与天然ODC m RNA分子翻译起始位点处互补的反义RNA链,并由此抑制ODC的表达。实验中我们用RT-PCR和Western Blotting技术筛选出ODC表达抑制的Hep G2细胞株,然后以此细胞株为模型,分析ODC反义RNA对肝癌细胞的影响。结果发现,用反义RNA抑制ODC表达后,Hep G2细胞生长速率明显减慢,这可能与细胞中多胺合成途径阻断有关。随后我们检测了ODC反义RNA对细胞周期的影响,流式细胞分析结果表明,与对照Hep G2细胞相比较,ODC表达抑制使G1期的细胞比例显著增加,而S期细胞比例明显减少,提示ODC反义RNA能使肝癌细胞周期停滞于G1期。当用抗肿瘤药物米托蒽醌处理细胞时,与对照细胞比较,药物对低表达ODC的肝癌细胞具有更强的抑制能力和更容易诱导其发生细胞程序性凋亡,但ODC反义RNA增强肝癌细胞对抗肿瘤药物敏感性的机制尚不完全明了,有待今后进一步深入研究。

参考文献

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