ISSR分析范文

ISSR分析范文（精选12篇）

ISSR分析 第1篇

1 不同区域小油桐种质资源的收集

本文通过对不同地区的小油桐进行研究, 并通过进行ISSR分子标记得出小油桐产生种质差异的原因。根据种植面积的不同, 收集的小油桐种子主要来自我国的台湾、云南、贵州农科院、江苏沐阳、江西九江、湖北咸丰6个地区, 见表1。此外, 还有来自贵州、福建、重庆以及云南的小油桐树苗, 分别对这些小油桐种子和小油桐树苗进行注册, 主要是用来进行ISSR分子标记, 其中注册见表2。

对于来自不同地区的小油桐种子及小油桐树苗进行了收集, 并进行了编号, 其目的主要是收集小油桐基因资源, 选取有代表性的地区, 而且该地区种植大面积的小油桐, 在收集的过程中, 要减少其他方面带来的影响, 这样才会使结果更加准确, 减少误差。要研究影响小油桐种质差异是否与地域有关, 需要做到的是保证其他条件相同, 只考虑不同地域的小油桐, 通过比较小油桐的种子形态特征、颗粒质量以及含油率的测试, 对小油桐种质资源进行ISSR分子标记等, 从而更好地得出小油桐与地域的关系。通过研究得出适合小油桐生长的环境, 为以后小油桐的开发利用奠下基础, 这样既能培育出高品质的小油桐, 又能为国家带来能源物质, 还对我们国家的环保有着重要贡献。

2 小油桐种质资源的ISSR分子标记

2.1 小油桐种质的检查与观测

需要对于收集的小油桐种子进行一定的处理, 看看种子是否出现发霉或发芽等情况, 对于出现上述情况的种子将不能使用, 应及时摒弃, 否则会给实验结果带来影响, 影响小油桐的最后测量结果, 对于油桐的处理首先做的是利用天平进行各取小油桐百粒质量[3], 然后对小油桐进行去皮, 根据种子的质量以及种仁的质量得出小油桐种子的出仁率, 对于小油桐种子的含油率可以使用粗脂肪测定方法进行测定, 最后得出小油桐种子的出油率, 在对小油桐种子进行观测时, 要全面考虑各方面的原因, 要及时处理可能会影响结果的问题。小油桐对于我国的发展有着非常重要的作用, 利用它可以生产生物柴油, 也可用来进行生物防治, 当然还可以进行环保, 可以使我国的资源产生非常大的效益, 可以预测, 在未来一段时间内, 它将会得到更广泛的应用, 将会用在生活的方方面面, 这对我们的生活是非常有利的。

2.2 小油桐种质资源的ISSR分子标记

利用ISSR分子对小油桐种质资源进行分子标记, 进行标记的引物会出现不同的序列, 当然扩增的条带也不相同, 对小油桐种质资源进行的ISSR分子标记主要分为DNA提取和ISSR的PCR扩增。首先需要做的就是提取小油桐的基因组总DNA, 对得到的多条ISSR引物进行筛选, 最后得到几条带清晰, 并重复性非常好的引物, 对于PCR技术需要使用酶、缓冲液、引物、模板和PCR反应程序等, 最后需要用到的是电泳, 对于生物电泳需要严格控制温度, 温度或高或低都会给结果带来很大的误差, 最后在凝胶成像仪上观察照相, 根据呈现出来的像进行分析, 在电泳图上每一条带作为一个标记, 代表一个结合反应的位点, 按照同一个水平位置扩增条带的出现与否进行统计, 然后分别进行标记, 在进行标记的过程中, 会出现各种各样的问题, 因此需要及时处理在进行标记的过程中出现的各种问题, 并减少误差。但是在实验的过程中会出现各种各样的误差, 有些误差是不可避免的, 但是有些误差是可以避免的, 我们要尽量避免那些不必要的误差, 这样才能保证结果的准确性, 才能得到准确的结果。

3 对小油桐进行ISSR分子标记的结果与分析

3.1 小油桐种子形态以及百粒质量和出仁率分析

从不同的地区收集的小油桐种子在形态上差别不大, 但是种子在大小上存在一定的差异。从外形上看, 云南引进的小油桐种子较大, 贵州引进的小油桐种子最小, 其余的居中, 对从不同地域收集的种子进行了纵横径测量, 其中最长的是云南引进的种子, 最小的是贵州引进的小油桐种子, 其余的都比较相近, 从横测量结果看, 类似于纵径, 从百粒质量方面来说云南的小油桐种子最重, 同样出油率也是最高的[4], 但是从台湾引进的小油桐种子出油率最低, 这与台湾种保存时间有关。综上所述, 可以发现云南的小油桐种子不仅种子较大, 而且出油率也是非常高的, 贵州种种子比较小, 台湾种出油率比较低, 除了与保存时间有关之外, 还与温度有关, 可以看出小油桐的种质差异与地域存在一定的差异, 但是不能判断小油桐与不同地域有必然的联系, 当然在进行ISSR标记的过程中, 会出现误差, 因此结果还会存在一定的误差, 不能完全判断小油桐与地域之间一定存在某种联系。所以, 要正确分析出现的问题以及研究的结果。最后结果得出:从我们收集的6种小油桐种子外观来看:形态差别不大, 但是个体差别较大, 云南收集的小油桐种子性状最佳, 可以在合适的地区进行推广, 可以进行大面积的种植, 这样有利于我国小油桐的生产和利用。

3.2 小油桐ISSR分子标记结果的分析

至今为止, ISSR分子标记技术已经应用于很多的方面, 主要是对遗传多样性进行分析, 并取得了很好的结果, 用8条ISSR引物对收集的小油桐进行PCR扩增技术, 在所用的引物中, 其中有3条不能扩增出明显的多态性条带, 其余的5条引物可以, 可以从得到结果看:可以明显鉴别出来自台湾、贵州以及重庆的小油桐种子, 其中来自贵州的种子有着明显的不同, 说明我国不同地域种植的小油桐种子可能出自相近的种源, 与所在的地理位置之间没有很大的联系, 从结果可以推测出云南小油桐可能来自不同的地区, 也可能是云南小油桐来自国外。以后还需要更多的进行分析测试, 同样建立多个示范种植基地, 这样不仅可以相互参照, 还有利于选出品种较好的小油桐, 根据不同的需要进行不同的改良;同时, 要多方面考虑可能会出现的问题, 遇到问题时, 要及时解决不可推脱。根据小油桐本身的特性, 可以知道小油桐是极具潜质的能源物质, 此外, 小油桐还是经济作物, 小油桐可以用来生产生物柴油, 这是非常重要的。

此外, 小油桐也可以进行水土防治以及生物防治, 有利于环保, 除了这些, 小油桐还有很多的优点, 我们要利用这些优点, 可以结合具有优良特性的小油桐进行改良, 通过示范种植, 达到改良小油桐性状的目的, 在示范种植期间, 要定期关注小油桐的生长状态, 对于不同的小油桐种质资源进行不同的划分, 尽最大可能的培育出具有高油、高效的小油桐;同时, 生产出具有不同用途的优良品种,

4 结语

在我国, 小油桐的覆盖面积非常大, 因此形成了丰富的生物资源。小油桐是极具潜质的经济作物和能源产物, 小油桐的用处非常广泛, 利用小油桐可以生产生物柴油, 这会增加我国紧缺的能源物质, 此外, 小油桐还可以药物研制、生物防治、环保等。目前, 小油桐已经应用于我国很多的领域, 本文通过对不同地区采集的小油桐种质资源ISSR标记的分析, 可以为以后的小油桐培育打下一定的基础, 改良出能够进行生物防治及高级净化等不同用途的优良品种。

参考文献

[1]徐伟.油桐属植物SSR分子标记的开发和种质遗传多样性的研究[D].扬州:扬州大学, 2012.

[2]向青.川渝地区油桐种质资源评价和核心种质的初步构建[D].雅安:四川农业大学, 2012.

[3]朱炳耀, 杨志敏, 庄志鸿, 等.不同区域小油桐种质差异与ISSR分子标记研究[J].中南林业科技大学学报, 2013, 4 (15) :68-69.

ISSR分析 第2篇

利用ISSR标记对新疆白梭梭居群的遗传多样性分析

利用ISSR分子标记对新疆白梭梭4个居群,105个个体进行了遗传多样性的比较分析.在供试材料中,11个引物共扩增出171个多态位点,多态位点百分率为84.85%,4个居群的多态位点百分率差异在33.92%～40.35%之间.Shannon多样性指数(Ⅰ)为0.3518,物种水平的`Nei基因多样度(h)为0.3482.遗传变异分析表明,物种水平的居群间遗传分化系数Gst为0.6238,居群间的基因流Nm为0.3016.遗传分析表明吐鲁番居群和甘家湖居群的遗传距离最近.

作 者：张萍 董玉芝 魏岩 胡成志 ZHANG Ping DONG Yu-Zhi WEI Yan HU Cheng-Zhi  作者单位：张萍,董玉芝,魏岩,ZHANG Ping,DONG Yu-Zhi,WEI Yan(新疆农业大学林学院,新疆,乌鲁木齐,830052)

胡成志,HU Cheng-Zhi(新疆大学,新疆,乌鲁木齐,830046)

刊 名：云南植物研究  ISTIC PKU英文刊名：ACTA BOTANICA YUNNANICA 年，卷(期)：2006 28(4) 分类号：Q943 关键词：白梭梭   ISSR   遗传多样性  

ISSR分析 第3篇

关键词：平菇；ISSR；遗传多样性；聚类分析

中图分类号： S646.1+40.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0073-03

收稿日期：2015-04-07

基金项目：河北省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队建设专项；河北省科技支撑计划 （编号：15226404D）。

作者简介：郑素月（1969—），女，河北石家庄人，博士，教授，主要从事食用菌新品种选育与菌种生产技术方面的研究。E-mail：zhengsuyue@sina.com。平菇营养丰富，味道鲜美，具有较高的营养价值和保健功能，是人们喜爱的食用菌之一。平菇抗逆性强、适应性好、产量高、易栽培，是我国栽培规模最大、产量最高的一种食用菌。目前，生产上平菇菌种混杂、种源不清、同物异名严重，严重制约平菇产业的发展。随着科学技术的迅猛发展，许多生化和分子生物学手段已在食用菌种质资源研究中得到了广泛应用。微卫星间区分子标记技术具有多态性丰富、稳定可靠、试验重复性好等优点，在食用菌种质鉴定方面得到了广泛的应用。张金霞等利用ISSR技术对侧耳属菌株进行研究[1-2]；李辉平等利用ISSR技术研究木耳菌株的遗传多样性[3-4]；李莹等研究杏鲍菇的ISSR标记多态性[5]；秦莲花等用ISSR鉴别香菇生产用种[6-7]。本试验采用ISSR分子标记技术，对河北省冀中南地区16个平菇生产菌株进行鉴别及遗传多样性分析，可为解决平菇品种混乱、对平菇进行资源利用和品种选育奠定基础。

1材料与方法

1.1供试菌株及来源

供试平菇菌株共16个，分别收集于河北省冀中南地区，由笔者所在实验室保存。菌株编号、名称见表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取PDA培养基平板上铺玻璃纸隔膜培养菌表1供试菌株丝，液氮研磨菌丝后用DNA提取试剂盒提取菌株DNA， 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计测定其D260 nm、D280 nm ，去离子水稀释到20 ng/μL左右， -20 ℃保存备用。

1.2.2引物筛选所用引物及扩增程序参考李辉平的研究[8]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

1.2.3PCR反应体系25 μL反应体系：2 μL DNA模板（约50 ng），2.5 μL 10×Taq PCR buffer，0.8 μL dNTPs（各0.25 mmol/L） ，1 μL引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），18.5 μL双蒸水。

1.2.4扩增程序94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃补齐10 min； 4 ℃终止反应。

1.2.5琼脂糖凝胶电泳配制1.4%琼脂糖凝胶，缓冲液为1×TAE，PCR产物在电压100 V下电泳70 min。

2结果与分析

2.1DNA提取结果

16个菌株基因组DNA提取结果见图1。由于采用了基因组DNA提取试剂盒，与传统的DNA提取方法相比，得到的DNA比较纯净，条带清晰、杂质较少，在紫外分光光度计上测定其D260 nm、D280 nm。可以看出，D260 nm、D280 nm 值均在1.8～2.0

之间，可用于PCR扩增。

2.2引物的筛选

本试验从供试的16个ISSR引物中筛选出8个扩增效果较好的引物，可扩增出所有供试菌株的DNA条带，且条带清晰、稳定、分布合理、重复性好，而在对照中没有扩增出DNA条带。这些引物分别为P2、P3、P5、P6、P7、P8、P11、P13。

2.3ISSR扩增图谱分析

用筛选出的8个引物对16个平菇菌株进行ISSR扩增，共扩增出78个多态性位点（图2），且分布均匀，大小在200～3 000 bp之间。以凝胶DNA片段的有无分别记为1或0，用统计软件NTSYSpc计算菌株间的遗传相似性系数，进行遗传相似性分析。由图3聚类分析结果可知，遗传相似水平在0.75 左右，16个菌株分为6个组群：第1组（Ⅰ）包括为以89为代表的5个菌株；第2组（Ⅱ）包括白平菇菌株；第3组（Ⅲ）包括以冀农11为代表的4个菌株；第4组（Ⅳ）包括558菌株；第5组（Ⅴ）包括以99为代表3个菌株；第6组（Ⅵ）包括夏抗8为代表的2个高温菌株。

3结论与讨论

ISSR分子标记技术是1994年由Zietkiewicz等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，其技术原理是在SSR序列的3′端或5′端加锚1～4个随机的碱基为引物，对两侧具有反向排列的简单序列间的基因片段进行扩增，不仅多态性好、稳定性高，而且简单、快速、通用性好，在食用菌种质资源研究中得到了广泛的应用[9]。笔者所在课题组在前期工作中收集了冀中南地区54个不同栽培平菇菌株，并进行了拮抗与酯酶同工酶测定，将54个菌株分为12个营养不亲和群[10]。本试验在此基础上选取16个代表菌株进一步进行ISSR分析。结果表明，用筛选出的8个引物对平菇菌株DNA进行ISSR扩增，共扩增出78个多态性位点，大小在200～3 000 bp 之间，且分布均匀。聚类分析结果表明，同一营养亲和群的平菇89和早秋615、双抗黑平和新平106、以及99、特抗黑平和平菇206菌株群内ISSR图谱完全相同，不同营养亲和群菌株ISSR图谱存在差异，进一步说明ISSR分析在食用菌菌株鉴定方面的可靠性。

参考文献：

[1]张金霞，黄晨阳，管桂萍，等. 白黄侧耳Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析[J]. 菌物学报，2007，26（1）：115-121.

[2]马志刚，吕作舟，郑和斌，等. ISSR标记在侧耳属菌株分类学中的初步应用[J]. 华中农业大学学报，2006，25（1）：55-59.

[3]李辉平，黄晨阳，陈强，等. 黑木耳栽培菌株的ISSR分析[J]. 园艺学报，2007，34（4）：935-940.

[4]戴肖东，马银鹏，张介驰，等. 黑龙江省木耳主栽品种遗传多样性分析[J]. 生物技术，2014，24（5）：86-89.

[5]李莹，李莉，刘艳玲，等. 杏鲍菇菌种遗传多态性的ISSR分析[J]. 微生物学杂志，2014，34（2）：24-28.

[6]秦莲花，宋春艳，谭琦，等. 用ITS和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种[J]. 菌物学报，2006，25（1）：94-100.

[7]贾定洪，王波，郑林用，等. 应用拮抗及ISSR方法鉴定袋料香菇菌株[J]. 西南农业学报，2013，26（2）：832-834.

[8]李辉平. 应用ISSR标记对食用菌的遗传多样性分析[D]. 北京：中国农业科学院，2007.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

ISSR分析 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试亚麻品种有:原2003-84、K-6542、SXY8,均由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供。

1.1.2 酶与试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP、DNA提取试剂盒,100 bp ladder、琼脂糖及常规试剂购于Tiangen生化科技有限公司。

1.1.3 PCR引物

60条ISSR引物委托上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 亚麻总DNA提取与检测

亚麻总DNA提取参照Tiangen DNA提取试剂盒试验步骤。分别取0.6 g 3个亚麻品系的叶片提取总DNA,提取的DNA分装贮于-20℃;亚麻总DNA的浓度检测采用琼脂糖凝胶电泳法,琼脂糖凝胶电泳方法参照文献[6],取1 μL提取的各基因组 DNA在0.8%Agarose上进行电泳,用标准分子量λDNA/Hind Ⅲ 进行比较,进而检测所提取各基因组DNA的浓度和完整性。

1.2.2 ISSR反应条件

为确定最佳的PCR反应体系,设置4个Taq酶浓度:0.5、1.0、1.5、2.0 UmL-1;4个dNTP浓度:0.15、0.20、0.25、0.30 mmolL-1。选用U853引物,其浓度设4个:0.3、0.4、0.5、0.6 μmolL-1;退火温度设3个:50、55、60℃。根据扩增结果,选择出最佳的PCR反应体系。PCR扩增程序为:94℃ 4 min;94℃ 40 s,50、55、60℃ 1 min,72℃ 90 s,40个循环;72℃ 10 min。

2 结果与分析

2.1 PCR反应优化

2.1.1 不同Taq酶浓度对扩增结果的影响

Taq酶浓度共用4个梯度,从图1中可以看出1.0 UmL-1时能扩增出条带,但不清晰,当增加到1.5 UmL-1时扩增效果较好,因此确定1.5 UmL-1是最佳浓度。

2.1.2 不同引物浓度对扩增结果的影响

引物浓度设4个梯度,图2中显示0.3 μmolL-1 时未扩出条带,0.4 μmolL-1扩的条带不清晰,0.5和0.6 μmolL-1扩增的效果好,但二者没有明显区别,因此确定0.5 μmolL-1是最佳浓度。

2.1.3 不同dNTP浓度对扩增结果的影响

dNTP浓度设了4个梯度,图3中dNTP浓度为0.15 mmolL-1时扩增条带少,而且条带模糊,而0.25 mmolL-1扩增的条带数目多而且清晰,因此0.25 mmolL-1是最佳浓度。

2.1.4 不同退火温度对扩增结果的影响

退火温度设3个梯度,由图4可知,55℃是最佳退火温度。

2.2 优化后亚麻最佳ISSR反应条件及PCR程序

通过Taq酶浓度优化、dNTP浓度优化、引物浓度优化,优化出适宜亚麻ISSR的PCR反应体系PCR体系(20 μL):10Buffer 2 μL,Mg2+(2.5 mmolL-1),dNTP(0.25 mmolL-1),ISSR 引物(0.5 μmolL-1),Genome DNA(50 ng),Taq1.5 UμL-1。通过退火温度梯度试验优化出适宜亚麻ISSR的PCR程序,确定优化后的PCR程序为94℃ 4 min;94℃ 40 s,55℃ 1 min,72℃ 90 s,40个循环;72℃ 10 min。

2.3 筛选出适宜亚麻ISSR的引物

该试验筛选出适宜亚麻ISSR的引物13条,其序列见表1。

1:U822,2:U824,3:U835,4:U836,5:U841,6:U848,7:U853,8:U854,9:U857,10:U859,11:U886,12:U888,13:U889,M:100 bp ladder

从60条ISSR引物中选取扩增结果较好的引物(见图5),综合原2003-84、K-6542、SXY8,3个品种为模板的结果,60条ISSR引物中有13条(序列见表1)扩增出的条带清晰,多态性好,重复性高。

3 结论与讨论

植物材料DNA的提取质量往往是决定PCR成功与否的关键。由于亚麻叶片中含有大量单宁、多糖类及色素等物质,同时蛋白质含量也较高,且越老的叶片中这些杂质含量越高,这些物质易与DNA结合形成粘稠的胶状物,既难溶解,又会抑制Taq酶活性,从而影响PCR反应的质量。因此该试验以亚麻的幼嫩叶片为材料提取DNA,并且采用Tiangen公司生产的DNA提取试剂盒,这样既保证了试验质量,又提高了试验效率。

通过优化适宜亚麻ISSR的PCR体系和程序,利用筛选出的适宜亚麻的ISSR引物可以对亚麻种质资源进行分子鉴定,并为亚麻种质资源的亲缘关系提供分子依据。

参考文献

[1]Zietkiewiecz E,Rafalske A,Iabuda D.Genome finger-printing by si mple sequence repeat(SSR)anchored poly-merase,chain reaction amplyficatlon[J].Genome,1994,20:178-183.

[2]Fritsch P,Riese L H.The use of random amplified poly-morphic DNA(RAPD)in conservation geneties[M]//SmithT B,Wayne R K.Molecular Genetic Approachesin Conser-vation.London:Oxford University Press,1996:54-73.

[3]Hedrick P W.Conservation genetics and molecular tech-niques:Apespective[M]//Smith T B,Wayne R K.Molec-ular Genetic Approaches in Conservation.London:OxfordUniversity Press,1996:459-477.

[4]CHEN Xiang-ming,ZHENG Guo-sheng,MENG Li.RAPD-PCRanalysis of genetic diversity of different colour35 tree paeonia cultivars[J].Sci Agric Sin,2002,35(5):546-551.

[5]LI Jin-bo,JI ANG Liang-rong,LI Chun-hai,et al.Compari-sions of genetic analysis based on ISSR and SSRin PGMSand TGMS rice lines[J].Moecul Plant Breed,2003,1(1):42-47.

ISSR分析 第5篇

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度.得到既稳定又能扩出最多条带的`适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20 μl的反应体系中含有1buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3 μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl.然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1 ℃.这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序.

作 者：陈志宏 黄琳凯 张新全 王志刚  作者单位：陈志宏,王志刚(全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心,北京,100094)

黄琳凯,张新全(四川农业大学动物科技学院草业科学系,四川雅安,625014)

ISSR分析 第6篇

关键词：油松；分子标记；ISSR-PCR；反应体系；正交设计

中图分类号： S722.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0046-04

收稿日期：2013-11-01

基金项目：河北省自然科学基金（编号：C2008000231）；河北农业大学科研基金（编号：QJ201230）。

作者简介：王树香（1977—），女，河北唐山人，硕士，实验师，主要从事微生物学、分子生态学研究。Tel：（0312）7528256；E-mail：wangshuxiang77@163.com。

通信作者：高宝嘉，博士，教授，主要从事生态学、森林有害生物管理研究。E-mail：baojiagao@163.com。油松（Pinus tabulaeformis）为我国特有树种，是我国温带针叶林中主要的建群树种，在工业用材、城镇绿化和荒山造林中具有重要的价值。就目前研究的相关资料来看，国内关于油松的遗传多样性和遗传结构的研究较多。如李毳等利用RAPD、ISSR（inter simple sequence repeat，简单重复序列区间）等分子标记方法对天然油松群体作了遗传多样性分析[1-4]；郝真真等从表观上对ISSR-PCR进行了优化，并研究了油松种群遗传多样性和空间遗传结构特征[5]。ISSR分子标记技术具有多态性水平高、可重复性好、DNA用量少、成本低等优点，广泛用于群体遗传多样性分析和种质鉴别等研究[6-13]。但是，采用正交设计的方法对油松ISSR-PCR反应体系进行优化还无报道，因此，本试验利用正交设计从Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA、Mg2+等5个因素4个水平进行分析，优化并建立油松ISSR-PCR反应体系，从而提高ISSR分析结果的可靠性和重复性，为油松品种的分子鉴定、遗传多样性分析和品种改良奠定试验基础。

1材料与方法

1.1材料

油松选于河北省辽河源国家级森林公园（北纬41°00′～41°10′、东经118°30′～118°40′），采集当年生针叶置于冰盒中带回实验室，置于-70 ℃超低温冰箱中保存备用。试验用Taq DNA聚合酶、dNTP购自上海宝生科技发展有限公司，引物（USB811）由上海宝生科技发展有限公司合成。

1.2基因组DNA提取和PCR扩增

采用UNIQ-10 柱式新型植物基因组DNA抽提试剂盒[购自生工生物工程（上海）股份有限公司]从油松叶片中提取多株植物基因组总DNA，提取的DNA作为ISSR-PCR反应体系的模板。所提DNA样品的纯度和含量用紫外吸收和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3PCR反应因素的确定与正交表的设计

为了确定PCR反应中5个因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物）的最佳反应浓度，采用正交设计L16（45）于4个水平上进行试验，每个处理重复2次，每个处理体积均为20 μL（表1），其中加入2.0 μL无Mg2+的10×Buffer，其他成分按照正交设计所分析的浓度加入，不足 20 μL 的用超纯水补足。16个处理在美国ABI 2720型PCR仪上进行扩增，反应程序初步定为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保温。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶在 3 V/cm 电压下电泳，电泳结果采用BIO-RAD Doc-2000自动凝胶成像系统成像，并用SPSS 18.0软件进行方差分析，进而获得油松ISSR-PCR最佳反应条件。

1.4退火温度梯度检测

在正交试验结果分析的基础上，利用扩增仪进行PCR反应程序中退火温度梯度试验，退火温度设置为46～55 ℃，扩增仪自动生成46.0、49.0、52.0、55.0 ℃等4个温度梯度。所用的PCR扩增体系为正交设计所得出的最佳体系。

2结果与分析

2.1电泳结果评分

正交试验PCR产物电泳结果见图1，获得的16个处理的谱带结果存在很大差异。参照何正文等的方法[14]，依据谱带强弱和杂带的多少对PCR扩增结果依次打分。其中，条带数量多、清晰的扩增结果计16分，最差的计1分。2次重复分别独立统计，16个处理的分数见表1。

2.2各因素对ISSR-PCR反应影响的差异分析

将上述处理和评分结果用SPSS数据处理软件进行方差分析，结果见表2。由F值可知，模版DNA的浓度对反应结果的影响最大，dNTPs浓度的影响最小，各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板DNA的浓度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物的浓度、Mg2+的浓度、dNTPs的浓度。由于各因素水平间的差异除dNTPs和Mg2+的浓度外均达到了显著水平，可以进一步进行因素内水平间的多重比较（表3）。

试验中模板DNA对反应体系影响显著，这与白锦军等的研究结果[15]相似，但与吴根土等的研究结果[16-17]相反，其原因可能是因为模板DNA中含有酚、多糖等杂质，会抑制Taq DNA聚合酶活性，从而影响结果，因此说明高质量的基因组DNA是获得稳定ISSR-PCR结果的前提。在油松的 ISSR-PCR 反應体系中，Taq DNA聚合酶、Mg2+和引物的浓度对PCR扩增结果影响显著，这与前人的研究结果[18-19]相同。本试验结果显示dNTPs的浓度变化对PCR结果影响不显著，这不同于其他研究结果[20-21]，分析其原因可能是单因素梯度试验结果的分析未考虑其他因素的交叉影响，造成不可避免的试验误差，而本试验采用正交试验方差分析，从而提高了分析结果的可靠性。

本试验构建的油松ISSR-PCR最佳反应体系中，除模板DNA浓度偏高外，Taq DNA聚合酶量、Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度均与其他亲缘相近树种相似，如红松[22]、云南松[23]等。ISSR反应对某些物种模板DNA浓度不太敏感，但本研究结果显示影响是极显著的，也与贺佳等的研究结果[24]相同。退火温度在减少模板与引物间的非特异性结合，进而提高PCR反应的特异性方面具有重要作用，因此本试验对筛选出的14条引物逐个进行退火温度梯度试验，确定每个引物的最适退火温度，为以后相似研究提供参考。本试验优化的稳定ISSR反应体系可以为油松品种选育奠定基础，同时对油松种质资源鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析、遗传图谱构建等领域提供科学依据。

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ISSR分析 第7篇

墨兰 (Cymbidium sinense) 花瓣香气浓郁、花色多变、叶形独特, 是国兰中株型最大, 花茎最长的种类。目前对于墨兰的研究主要集中在形态学、生理学及孢粉学上, 而在分子DNA水平上研究很少[1,2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一种新型分子标记技术[3], 该技术在SSR (即简单序列重复) 技术的基础上有所发展, 使实验操作简便且迅速, 稳定性好, 多态性高, 现今在基因定位、遗传作图、遗传多样性、进化以及系统发育等研究中被广泛应用[4]。不同植物对ISSR-PCR反应体系要求不同, 因此在利用ISSR标记之前, 必须建立该种植物最适ISSR-PCR反应体系。本研究旨在通过正交试验分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5个因子在4个水平上对墨兰ISSR-PCR反应影响, 并据此建立墨兰最适ISSR-PCR反应体系, 为利用ISSR标记对其进行后续研究奠定基础。

2 材料与方法

试验材料墨兰来源于国家林业局保育重点实验室。试验方法包括以下3种。

(1) 墨兰基因组DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨兰基因组DNA。

(2) 墨兰ISSR-PCR反应引物筛选。根据哥伦比亚大学公布的60个ISSR反应体系引物序列随机选取11个引物801 (AT) 8T、804 (AT) 8A、812 (GA) 8A、818 (CA) 8G、831 (AC) 8YA、836 (AT) 8YA、838 (TA) 8RC、848 (CA) 8RG、825 (AC) 8T、853 (TC) 8RG、860 (TG) 8RA进行筛选, 采用ISSR-PCR反应体系进行筛选目标引物[6,7,8]。

(3) 正交试验设计。对墨兰ISSR反应5因素 (Taq酶浓度、Mg2+浓度、DNA浓度、dNTPs浓度、目标引物浓度) 进行4浓度梯度试验, 共16个处理L16 (45) , 每个处理重复3次 (表1) 。

3 结果与分析

3.1 目标引物确定

对11个引物进行筛选, 引物818、836、812、825、848的电泳结果都有明显条带, 其中引物836条带最多且清晰, 其它引物的效果都不是很明显, 因此选定引物836作为墨兰ISSR-PCR正交反应试验的目标引物 (图1) 。

3.2 ISSR-PCR最优反应体系

基于引物836墨兰DNA ISSR-PCR反应的正交试验验结果见图2和图3。图中各有8个处理, 24组。16个处理中除1、7和14之外, 其余13个处理都能够扩增出清晰条带, 并且每个处理3个重复效果一致。

根据何正文等的正交设计直观分析方法[9], 以Marker为参照, 根据带的多少和亮度给每个处理打分。带数为4以上=10分, 带数为3=8分, 带数为2=6分, 带数为1=4分, 带数为0=2分;亮度最亮=10分, 很亮=8分, 较亮=6分, 微亮=4, 不亮=2分;3个重复组总和为每个处理后得分。从表2看出, 处理11得分最高, 处理3和处理12次之。处理11为Tag酶浓度1.6U/25μL、Mg2+浓度2.72mmol/L、dNTP浓度0.68mmol/L、引物浓度0.48μmol/L、DNA浓度80ng/25μL, 是最优的ISSR-PCR反应体系。

3.3 墨兰ISSR-PCR单因子分析

当Tag酶浓度为0.4~1.6U/25μL时, 分值随Tag酶浓度的增加而明显增加, 当Tag酶浓度为1.6U~2.2U/25μL时, 分值增加不明显。当Mg2+浓度为2.4mmol/L时, 分值最高。当dNTP浓度为0.4~0.96mmol/L时, 分值随浓度的增加而增加;当dNTP浓度为0.96~1.24mmol/L时, 分值差异不明显。引物浓度为0.64μmol/L, 分值最大。当模板DNA浓度为3.2ng/25μL, 分值最大 (表3) 。

4 结语

采用正交试验分析5个因素 (Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度) 在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响, 结果表明:Tag酶浓度为1.6U/25μL、Mg2+浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。Tag酶用量直接影响扩增反应成功与否, 浓度过高造成浪费, 但如果Tag酶浓度过低, 会导致产物合成效率下降。Mg2+浓度主要是通过影响Tag酶活性从而影响PCR反应。dNTP作为PCR反应的原料, 浓度太低会使扩增不完全, 从而降低PCR产物产量;浓度过高会对Mg2+产生抑制作用, 降低Mg2+的有效浓度, 影响Tag酶的活力, 造成浪费。本试验验结果为进一步建立优化、系统的ISSR-PCR反应体系提供了初步的科学数据, 利用IS-SR分子标记技术对墨兰进行种质资源鉴定、遗传多样性及遗传图谱构建等研究奠定了基础。

摘要：为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系, 采用正交试验分析了5个因素 (Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度) 在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响。结果表明:Tag酶浓度为1.6U/25μL、Mg2+浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。

ISSR分析 第8篇

ISSR-PCR的扩增反应体系的研究,虽然已经有一些其它物种的研究和报道[2,3],但是不同的物种对ISSR-PCR的反应的条件要求是不一样的,对芋而言,这方面的研究至今尚未相关的报道[4,5,6,7,8,9,10]。所以我们利用正交设计从Mg2+浓度、dNTPs的浓度、引物浓度、Taq酶和DNA模版5种因素4个水平上,对芋ISSR-PCR的反应体系进行优化分析,以建立适合芋ISSR-PCR反应的最佳体系,为今后芋种质资源的遗传多样性分析研究、种质鉴定和分子标记辅助育种等研究提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的芋种质资源均来自于国家种质武汉水生蔬菜资源圃。采取芋的嫩叶置于液氮中,带回实验室洗净、液氮冷冻之后储存于-75℃的冰箱中备用。试验所用的ISSR引物选取英国哥伦比亚大学(University of British Columbia)公布的引物,由上海生工生物工程公司合成,dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶等试剂均来源于MBI Fermentas 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采用DNeasy Plant Mini kit(Qiagen)提取与纯化芋基因组DNA,纯化后的DNA通过通过核酸定量仪检测并推算出DNA的浓度,1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,并将DNA浓度稀释至终浓度为40ng/μl,置于-20oC冰箱保存备用。

1.2.2 ISSR-PCR正交反应体系的设计

对于影响ISSR-PCR反应体系的五个因素Mg2+、dNTPs、模版DNA、Taq酶和引物,我们采用正交试验在4个水平上进行实验(表1),设计出5因素4水平L16(45)的正交试验设计表(表2)。共用16个处理,每个处理重复2次,每个处理的PCR反应体系总体积为25μl,通过试验筛选出最佳的组合。以UBC-810为试验引物,用芋的种质资源的DNA为模版,在ABI Veriti PCR扩增仪上进行扩增。反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35个循环;最后一个循环结束后,72℃后延伸7 min,4℃保存。ISSR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,EB染色,在凝胶成像仪上成像检测。

1.2.3 ISSR引物的筛选和退火温度的确定

应用正交试验得出的ISSR-PCR最佳反应体系,从30条引物中筛选出多态性丰富的引物。对每条引物的退火温度进行梯度试验,以所选引物的理论退火温度Tm为中心,设置六个温度梯度,使用梯度PCR仪,逐一确定所筛选引物的最适退火温度,以Tm值为52.18℃的引物UBC-810为例,围绕Tm左右分散设置50℃、51℃、52℃、53℃、54℃和55℃ 六个温度梯度,通过梯度PCR试验最终确定该引物的最佳退火温度。

1.2.4 最佳反应体系的验证

通过采用36种不同的芋种质资源和不同的ISSR引物多次验证ISSR-PCR最佳反应体系及其反应程序,以确定其在实验应用中的扩增稳定性。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR正交试验的直观分析

引物UBC810正交试验的PCR产物电泳结果见图1,通过对表2的16个反应体系PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测,观察比较电泳图谱,处理11的扩增的谱带带型丰产度高、主带亮,确定为芋的最佳反应体系,即在25μl的反应体系中,40ng DNA模板、0.4μmol/L引物浓度、2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶。

2.2 引物筛选和退火温度的确定

利用上述芋的ISSR-PCR最佳反应体系,从30条引物中筛选出13条多态性丰富的引物。通过逐个对每条引物的退火温度设计了梯度试验,最总确定每条引物的最佳退火温度(表3)。

M:DNA Marker;1～16:不同的反应体系编号,见表2。

M:DNA Marker;1-16:reaction system treatments listed in Table 2.

2.3 ISSR最佳反应体系的验证

随机挑选引物UBC 841和36份芋种质资源进行扩增,以检测所确立的芋种质资源ISSR-PCR最佳反应体系的稳定性,结果(图2)显示,所选引物可在36份芋种质资源上扩增出清晰、多态性丰富的谱带。可见,本研究所建立的ISSR-PCR体系和反应程序稳定可靠、重复性好,适合用于芋种质资源的ISSR-PCR扩增。

M:DNA Marker;1～36:不同的芋种质资源。

M:DNA Marker;1-36:different taro germplasm resources.

3 讨论

ISSR分子标记技术以其简便、经济、快速、多态性高、稳定性强等优点,在多种作物的种质资源研究尤其是种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系及基因定位等方面已经得到较为广泛的应用[11,12,13,14],但ISSR分子标记技术对芋的研究应用报道很少,国内外多利用AFLP或RAPD分子标记研究芋的遗传多样性[15,16,17,18,19]。

在应用过程中,ISSR分子标记技术易受多种因素的影响,不同的物种对ISSR-PCR的反应的条件要求不一样[20,21,22,23],我们利用正交设计从Mg2+浓度、dNTPs的浓度、引物浓度、Taq酶和DNA模版5种因素4个水平上,建立了芋ISSR-PCR的最佳反应体系。本研究结果证明:在影响ISSR分子标记技术的诸多因素中,基因组DNA质量是影响整个反应体系的最关键因素,其次,单因素试验工作量大,试验过程中也会顾此失彼,正交设计采取多因素分析正好弥补其不足,通过有限的试验从多因素中选出主要因素及其最优水平。

ISSR分析 第9篇

1 ISSR分子标记技术的原理

ISSR分子标记技术是基于微卫星技术和单引物PCR技术发展起来的一种新型分子标记技术[6], 其原理是利用动植物中广泛存在SSR序列的特点, 利用在基因组中经常出现的SSR设计引物, 无需预先克隆和测序。利用锚定的SSR序列作为单引物, 在SSR序列的3'端或5'端加2~4个随机核苷酸 (非重复的锚定核苷酸) , 以此为引物, 其引物长度通常为16~18碱基序列, 对位于反向排列、可有效扩增范围内重复序列间的基因组片段进行PCR扩增, 再进行电泳与染色, 根据谱带的有无及相对位置, 来分析不同样品间ISSR标记的多态性。

2 ISSR分子标记技术的特点

ISSR分子标记技术具有良好的专一性和稳定性, 该技术采用了较长的引物, 引物与基因组DNA中SSR的5'末端或3'末端结合, 避免了微卫星序列在基因组上的滑动, 大大提高了PCR扩增的专一性和稳定性。ISSR分子标记技术具有共显性, 并呈孟德尔式遗传, 因此ISSR分子标记数据便于记录和统计, 可以通过遗传经典理论进行分析。ISSR分子标记技术模板需要量少, 方便研究对象的样本采集, 对于珍稀濒危动植物采取非损伤性取样即可满足研究要求。ISSR分子标记技术在同一块凝胶中可揭示多基因位点的信息, 蕴含了大量的遗传信息, 从而揭示更多的多态性[6]。ISSR分子标记技术的应用过程无需试剂盒, 操作简单, 试验成本较低。

3 鸟类遗传研究中ISSR分子标记技术的应用现状

3.1 遗传多样性研究

世界自然保护联盟 (IUCN) 将遗传多样性保护、生态系统多样性保护、物种多样性保护列为全球生物多样性保护的3个优先内容。遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的基础, 也是生命进化和物种分化的前提, 更是评价自然生物资源的重要依据。对任何一个物种来说, 个体的生命是短暂的, 由于个体构成的种群或种群系统 (亚种、种) 在时间上是连续的, 因此是进化的基本单位。通常, 遗传多样性最直接的表现形式就是遗传变异水平的高低。一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力取决于种内遗传变异的大小, 同时也依赖于遗传变异的种群结构。利用ISSR分子标记技术对泰国已灭绝后期又再次引入物种赤颈鹤的遗传多样性和遗传结构进行分析, 结果发现, 赤颈鹤的遗传多样性较低, 遗传结构不明显, 并且处于非平衡状态[7]。ISSR分子标记技术可以分析鸟类物种的遗传多样性, 也可以分析多个种群的遗传多样性, 并且还可以进一步探讨各种群间的遗传结构, 遗传多样性主要来源于哪个重要的种群。J.Gonzalez等[8]利用ISSR分子标记技术分析了棘尾雷雀主要分布区的8个种群的遗传多样性和遗传结构, 结果发现, 此物种整体遗传多样性较低, 主要遗传多样性来自分布于莫卡岛的亚种 (A.s.bullocki) , 各种群间的基因流水平较高, 因此导致没有明显的遗传结构。武玉珍[9]利用ISSR分子标记技术分析了我国一级重点保护动物褐马鸡的遗传多样性, 结果显示, 物种水平的遗传多样性高于种群水平的遗传多样性, 各种群的遗传多样性比较接近。

3.2 种质资源评价

ISSR分子标记技术是野外鸟类种质资源评价的重要方式, 大石鸡和石鸡是我国北方干旱、半干旱荒漠环境的指示鸟类, 其中大石鸡是我国特有物种, 分布区狭窄, 目前两种鸟类已经形成了杂交区, 利用IS-SR分子标记技术对杂交区域的种群情况进行研究, 基因交流不仅存在于种群间, 还存在于物种间, 但这种交流为单向的从石鸡向大石鸡遗传渐渗, 杂交个体只存在于大石鸡的种群, 说明大石鸡是我国的特有种群, 应禁止人为将石鸡引入大石鸡地区, 减少它们之间的杂交, 以阻止大石鸡被石鸡遗传同化, 造成大石鸡的遗传灭绝[10]。ISSR分子标记技术除了用于评价野生鸟类的资源现状外, 还用于评价饲养种类的种质资源。利用ISSR分子标记技术对我国极其珍稀的中型灰鹅品种雁鹅的安徽省郎溪县雁鹅原种鹅场的种质资源评价进行研究, 结果发现, 该人工种群遗传多样性较好, 分为3个谱系, 这为雁鹅种质资源研究和育种提供了科学借鉴。饲养鸟类的生产性状与IS-SR分子标记的多态性条带的相关性明显, 对吉林白鹅的种质资源进行评价时发现, 产肉性能与ISSR分子标记的多态性条带具有相关性, 这对品种选育十分有利, 可提高选中的准确率。

3.3 亲缘关系分析

与RFLP、SSR等分子标记技术比较, ISSR分子标记技术能更多地揭示DNA基因组多态性, 是一种较好的DNA标记, 因此该分子标记技术在鸟类亲缘关系研究方面发挥着良好作用。对于水雉类鸟类, 一直认为其婚配制度为一雌多雄制, 通过ISSR分子标记技术对梳冠水雉的婚配制度进行研究, 结果表明, 梳冠水雉是一雌一雄的婚配制度[11], ISSR分子标记技术在此研究过程中发挥了重要作用, 此种方法可用于其他一雌多雄制水雉类鸟类的亲权确定。对由波氏柳莺和林柳莺组成的一个混合繁殖进行研究, 利用ISSR分子标记作为DNA指纹标记确定了这个繁殖对亲本与雏鸟的亲权关系, 这是第一次通过遗传手段证实了两种鸣禽混合繁殖的事实[12]。

3.4 分类研究

Gupta等人利用ISSR分子标记对5种植物、鱼、鸡、牛和人合计9种真核生物进行分析, 结果发现, ISSR分子标记的多态性能区分物种个体、亚种、品系和变种间的差异。由于ISSR分子标记的多态性较高, 因此不是十分适用于高阶元的系统分化研究, 目前诸多研究主要集中在物种间和种下的亲缘关系及分类方面。在利用ISSR、SSR和小卫星DNA[又称可变数目串联重复 (VNTR) ]分子标记对鹦鹉科4种鹦鹉进行种间差异分析时, 发现SSR、VNTR分子标记技术比ISSR分子标记技术显现出更多的多态性, 但ISSR分子标记技术对紫蓝金刚鹦鹉、绿翅金刚鹦鹉和蓝黄金刚鹦鹉3个物种能够进行很好地区分[13]。在利用ISSR分子标记技术对南灰伯劳的亚种系统分化研究时发现:加那利群岛的L.m.koenigi亚种与分布于欧洲的L.m.meridionalis亚种存在明显差异, 明确了L.m.koenigi亚种的分类地位;L.m.koenigi亚种与分布于非洲大陆的L.m.algeriensis亚种无明显差异, 认为两者是一个亚种的同名词[14]。

3.5 分子系统地理学研究

Avise等人首次将此研究领域命名为系统地理学, 并定义系统地理学是研究物种间及物种内不同类群形成现有分布格局的历史原因和演化过程的一门科学。基于分子水平, 能更准确地界定物种的分布格局, 有力地促使分子系统地理学形成并发展。目前, 本领域主要探讨现有近源种间和种内种群的分布状况, 进而探讨其分布的起因, 阐述其进化历程, 分析区域类群在时间上和空间上的发展变化, 从而重建生物区系的历史。由于ISSR分子标记的多态性较高, 因此在种内的分子系统地理学研究中起到了良好作用。在对北美地区环颈鸻的分子系统地理学研究中, 利用ISSR和mt DNA分子标记技术得到的结果是不同的;根据mt DNA控制区构建的系统发生树显示波多黎各种群与北美大陆其他地区截然不同, 而根据ISSR分子标记技术进行的巢式分析显示波多黎各种群来源于北美大陆的东部地区;mt DNA控制区研究结果显示出微弱的分子系统地理结构, 而ISSR分子标记技术的研究结果明显将北美各种群从落基山脉分成东、西两个地理谱系。

4 展望

ISSR分析 第10篇

水藓科为变齿藓目植物之一,是藓类植物中罕有的完全水中生长类型。全世界有2个亚科和3个属;中国有水藓亚科(Fontinaloideae)的水藓属(Fontinalis)和弯刀藓属(Dichelyma)植物。水藓属为较早确定的藓类植物之一,全世界约有20种,中国有2种,一种为大水藓(Fontinalis antipyretica),另一种为羽枝水藓(Fontinalis hypnoides),其中羽枝水藓为濒危物种;弯刀藓属在全世界有6种,我国仅有1种,为网齿弯刀藓(Dichelyma falcatum)。水藓科在我国分布的种类不多,对其遗传多样性的研究具有非常重要的意义。

随着分子生物学的发展,已出现多种DNA分子标记方法,如DNA随机扩增多态性(randomlyamplified polymorphism DNA,RAPD), 扩增酶切片段多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP),简单序列重复(simple sequence repeat,SSR),可用于植物遗传多样性、品种鉴定、遗传作图、生物进化和分子生态学等方面的研究。与其他标记方法相比,ISSR分子标记具有很多优点:可以在不同的物种间通用,揭示的多态性高,精确度高,信息量大,检测方便等。该技术已在农作物[1,2,3,4,5,6]、树木[7,8,9]和花卉[10,11,12,13]等多方面得到了广泛应用。目前,有关藓类植物遗传多样性的研究不是太多[14,15,16,17,18],而关于水藓科植物的遗传多样性研究更是至今未见报道。本实验通过正交方法对ISSR-PCR反应体系进行优化,以期为后续水藓科植物遗传多样性的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

水藓科植物于2011年由新疆大学采自新疆喀纳斯国家级自然保护区和巴尔鲁克山野巴旦杏自然保护区。

1.1.2 实验试剂

dNTPs、Taq DNA Polymerase购自上海生工;2000 DNA Marker由大连宝生物公司生产;电泳用琼脂糖和CTAB由上海生工生产;ISSR引物由上海生工合成。

1.1.3 实验设备

DY-3型号电泳仪(由北京六一仪器厂生产);PCR仪(美国PE-9600);DYCP-31D型NanoDrop 2000超微量分光光度计(型号为:美国ND-2000);高速冷冻离心机HERMLEZ323K(德国进口);紫外凝胶成像系统(型号为:UVPGDS-8000)。

1.2 方法

1.2.1 提取水藓科基因组总DNA

通过改良的CTAB法[19]提取水藓科的基因组总DNA。步骤如下:

(1)取0.2g材料用双蒸水冲洗2～3遍,用吸水纸将叶片表面水分吸干,快速置于-80℃冰箱中冰冻12h。

(2)将材料取出快速放置到预冷的研钵中,加入少量的Vc和PVP,倒入液氮迅速研磨至细粉状,转入1.5mL EP管中。

(3)向EP管中加入1mL预冷的Buffer A溶液[Buffer A溶液,100mL水中加入5molL-1 NaCl 5mL ,0.5molL-1 EDTA 1mL,1molL-1 TrisHCl 10mL]充分混匀,冰浴0.5h,使用4℃离心机,转速12 000r/min离心10min,将上清液去除。(若离心后溶液太粘稠,可重复步骤3),直至上清澄清)

(4)加入800μL 65℃预热的2%CTAB溶液[2%CTAB溶液,50mL水中加入NaCl 8.16g,CTAB 2g,1molL-1 TrisHCl(pH 8.0) 10mL、0.5molL-1 EDTA(pH 8.0) 5mL加去离子水至100mL],轻轻混匀,65℃水浴60min,期间轻摇混匀2～3次,室温冷却1min。

(5)4℃条件下,转速为13 000r/min,离心10min,小心吸取上清液到新的离心管中,向管内加入相同体积的CI溶液[CI溶液,氯仿溶液的量:异戊醇溶液的量=24:1]重复抽提2～3次,最后离心吸取上清液。

(6)向EP管中加入相同体积的预冷异丙醇,混匀后在-20℃冰箱中静置1h。

(7)用4℃离心机将溶液12 000r/min离心10min,去除上清液,加入4℃保存的75%乙醇溶液将沉淀充分洗涤2次,一次5min左右(第一次13 000r/min,第二次8 000r/min)。

(8) 弃上清液,将沉淀倒置在冰上自然风干至无乙醇味。加入50μL TLE溶液[TLE溶液,1molL-1 TrisHCl(pH 8.0) 1mL,0.5molL-1 EDTA(pH 8.0) 20μL加去离子水至100mL]溶解。

(9) 若有RNA污染,向TLE溶液中加入3mL RNaseA试剂,4℃放置1h,于-80℃冰箱内保存备用。

1.2.2 基因组DNA的检测

通过核酸检测仪检测DNA的纯度和浓度;以1%琼脂糖凝胶电泳, 以Marker 2 000为标准, 检查所得DNA的大致分子量、纯度及完整性。

1.2.3 水藓ISSR-PCR反应因素的优化

因模板DNA、引物、Mg2+、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度等均会对PCR 扩增结果产生影响,为了得到客观和清晰的结果,需要对ISSR-PCR反应因素进行优化。以大水藓基因组DNA为模板,UBC860(AGAGAGAGAGAGAGAGC)为引物,设计正交实验表对模板、引物、Mg2+、dNTP和Taq DNA 聚合酶浓度进行5个因素4个水平筛选[20](见表1)。PCR扩增设计的反应程序:94℃预变性5min;94℃高温变性30s,52℃低温退火1min,72℃适温延伸2min,共35个循环;然后72℃延伸10min;最后4℃保存。PCR 用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,待测样品点10μL,电泳的电场强度为5V/cm,电泳缓冲液为1TBE,电泳结束后在紫外凝胶成像系统下(UVPGDS-8000)分析并照像。

1.2.4 电泳图谱的统计分析

根据扩增条带的强弱赋值:清晰明亮的条带记为3分,相对明亮的条带记为2 分,较暗的条带记为1分,无条带的记为0分。将16组体系按照条带的数量和明亮带的强弱计算出总的分数(表2),再根据表2的得分计算出5个因子在4个水平上的总分以及极差,以此可以推导出最佳的反应体系。

1.2.5 最佳反应体系的验证

通过反应因素的优化,以UBC845(CTCTCTCTCTCTCTCTRG)为引物对13种水藓基因组DNA进行PCR扩增,从而验证最佳反应体系。

2 结果与分析

2.1 水藓基因组DNA的提取

M:DNA Marker; 1～13:基因组DNA。

M:DNA Marker; 1-13:Genomic DNA.

本实验利用改进的CTAB法提取基因组DNA(见图1),从图中可见DNA条带清晰,无明显降解现象[21]。用紫外分光光度计测定DNA在260nm和280nm的光吸收比值(A260/A280)为1.8～2.0,浓度在100～200ng/μL之间,达到PCR反应要求。

2.2 水藓ISSR-PCR反应因素的优化

通过对16个反应体系的处理(见图2),发现条带的数量和亮度上均存在明显区别,这说明Mg2+、模板、引物、dNTPs、Taq 酶等5个影响因子在4个水平上对反应体系扩增的结果有很大的影响,因此对水藓科植物PCR反应体系的优化是十分必要的[22]。

1～16为正交反应中不同体系的处理(表1);M为DNA Marker。

1～16:treatments of differents systerm in orthogonal reactions(Tab.1); M:DNA Marker.

通过条带的数量和明亮带的强弱的差异,计算出16个优化反应体系的得分数(见表2),明亮的带记为3分,亮带记为2分,暗带记为1分,分别计算出5个因子的4个水平的得分,进而求取极差(见表3)。

通过表3可知16个反应体系中,反应10的分数最高且明亮带和亮带最多,是最适合的反应体系。因此最佳反应体系组合为A3B2C4D3E1,即20μL体系中,2.0μL Buffer溶液、1.52mmolL-1Mg2+、1.28μmolL-1引物、1.20mmolL-1dNTPs、70.0 ng模板、0.50U Taq酶。极差可以反映出5个因子对ISSR-PCR体系扩增的影响程度,极差值越大表示该因子对体系扩增的影响越大[22]。所以通过表2可知影响扩增反映的因素顺序为Mg2+>Taq 酶>dNTPs> 模板DNA=引物。

M:DNA Marker; 1～13:13份水藓DNA。

M:DNA Marker; 1-13:13 Fontinaloideae DNAs.

2.3 最佳反应体系的验证

利用最佳反应体系对13份水藓植物基因组DNA进行扩增,以UBC845作为ISSR分析的引物,进行最佳反应体系的验证(见图2)。结果显示,扩增的条带清晰,多态性高,可作为其他引物对水藓扩增的反应体系。

3 讨论

植物基因组DNA提取的方法很多,其中以Doyle和Domle提出的CTAB法以及一系列改良的CTAB法的应用最为广泛。本文通过改良的CTAB法提取水藓基因DNA,裂解液中较高浓度的CTAB能增强对细胞壁的破坏能力;使用氯仿/异戊醇反复抽提3次,可以在很大程度上除去多糖。实验结果发现,DNA电泳条带较清晰,无明显降解,RNA去除彻底,DNA含量和纯度较高,可达到ISSR-PCR的反应的要求。

ISSR分子标记技术是基于PCR反应的一种方法,具有重复性高的优点,但受到Mg2+浓度、引物、dNTPs 、模板DNA和Taq 酶等多种因素的影响。Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活剂,浓度过高会使非特异性扩增产物增加,过低则造成扩增产物减少,甚至不能扩增。当Mg2+浓度为1.52mmolL-1时扩增产物最清晰,Mg2+浓度为1.6mmolL-1时扩增结果不稳定,Mg2+浓度为1.44mmolL-1时扩增条带较少,说明Mg2+的浓度影响了Taq酶的活性,所以适当的浓度有助于扩增的效果。Taq DNA聚合酶在PCR 反应中常用的浓度为0.5～2.0U反应体系, 本实验中当浓度为0.5U时凝胶电泳条带较清晰,适合水藓植物的遗传多样性研究。适宜浓度的dNTP对于获得理想的PCR反应条带也很重要,当dNTP为1.20mmolL-1时,条带较明亮。分析发现,模板浓度和引物浓度对该反应体系的影响较小。刘芸君等人与刘梦培等人通过ISSR-PCR正交反应的方法分别对岩白菜和华杏仁的体系进行了优化,发现Mg2+、Taq酶及dNTP的浓度是5个因子中比较重要的3个因子,支婷等人同李慧慧等人分别对鸭梨和栝楼的ISSR-PCR反应体系进行优化,发现模版DNA浓度对扩增结果的影响最小。本研究采用在4个水平上对影响水藓植物的五个因子进行优化,影响扩增反应的排列结果为Mg2+>Taq 酶>dNTPs> 模板DNA=引物。这与前述文献基本一致。与植物PCR扩增反应体系正交优化的相关研究较多,但至今还未曾见到有关水藓科植物的报道。优化反应体系的方法很多,包括单因素梯度试验法,但其不能反映各因素之间的相互关系。正交反应是研究多因素多水平的一种设计方法,它是根据正交性挑选出均匀分散,齐整可比的点进行试验,是一种高效率、客观、快速的实验设计方法[23]。本实验利用正交反应对水藓进行ISSR-PCR体系优化,通过电泳条带的亮度、条带数筛选出最佳反应体系,即20μL体系中,2.0μL Buffer溶液、1.52mmolL-1Mg2+、1.28μmolL-1引物、1.20mmolL-1dNTPs、70.0 ng模板、0.50 U Taq酶。

利用最佳反应体系以UBC845为引物,13份水藓基因组DNA为模板进行PCR反应扩增,扩增条带清晰、稳定性好、重复性高,表明优化的反应体系适用于水藓科植物,为水藓的遗传多样性研究奠定基础。

4 结论

4.1影响扩增反应的五个因子因素排列结果为Mg2+>Taq酶>d NTPs>模板DNA=引物。

ISSR分析 第11篇

关键词：沙地云杉；叶基因组DNA；ISSR-PCR；优化

中图分类号：S791.180.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0048-03

沙地云杉（Picea mongolica）是中国稀有珍贵树种，集中成片地分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区以克什克腾旗的白音敖包自然保护区，形成了罕见的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防风阻沙、调节气候等特点，并且生存年代久远，所以被称为沙漠上的“绿宝石”和“生物活化石”^[1]。自引种到辽宁、北京、呼和浩特成功之后^[2]，沙地云杉不再是内蒙古草原的特有树种。目前，沙地云杉的研究仍停滞在生态学水平，对其遗传多样性的研究尚未见报道。

简单重复序列间区标记技术（inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年发展起来的一种微卫星的分子标记^[3]。ISSR标记呈孟德尔式遗传，大部分ISSR标记为显性标记。它结合了SSR和RAPD的优点^[4]，具有模板 DNA用量少、质量要求低，扩增产物特异性强，重复性高，试验操作简便，费用较低等特点，又比RFLP、RAPD、SSR能更多地提供遗传信息，已被广泛应用于品种鉴定、遗传多样性、系统进化关系、遗传作图、基因定位、标记辅助选择^[5]等研究，通过遗传多样性手段对沙地云杉作进一步研究。本试验以沙地云杉叶基因组为模板DNA，分析引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度对ISSR-PCR扩增的影响，建立适合沙地云杉ISSR-PCR的反应体系，为研究沙地云杉的系统进化、物种鉴定和种間杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 试验材料来自内蒙古浑善达克沙地，种子于40 ℃烘箱中烘干后取出，浸于75%甲醇中一段时间，然后放在培养箱中培养。将长出的嫩叶放入-80 ℃保存，以备取用。

1.1.2 试剂 提取基因组DNA：CTAB提取液，β-巯基乙醇，1×TE缓冲液。引物参照哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）公布的ISSR引物序列，由北京华大基因有限公司合成。本试验反应体系优化试验固定引物UBC 835的序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGC。用于ISSR-PCR的试剂：dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker（DL2000）购自天根（TIANGEN）生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 本试验采用CTAB法提取沙地云杉基因组DNA。

1.2.2 DNA浓度及纯度检测 用紫外分光光度计测定DNA样品在260 nm和280 nm处的吸光度，检测其浓度和纯度。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量并进行PCR扩增，最后稀释至50 ng/μL保存在-20 ℃中备用。

1.2.3 PCR单因素试验 单因素试验是其他因子保持不变，其中1个因子按照一定浓度梯度变化，从而筛选出各因子适合继续优化的最适浓度。本试验是为了筛选出适合于沙地云杉ISSR-PCR反应体系的各因素最佳浓度。不同因素浓度水平见表1。

1.2.4 PCR反应条件 94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，UBC 835的退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存备用。

1.2.5 扩增产物检测 1.2%的琼脂糖凝胶在0.5 ×TBE缓冲液中电泳检测，用UVP凝胶成像系统照相保存。

2 结果与分析

2.1 引物浓度的优化

引物浓度是影响PCR结果的重要变量之一。浓度过低阻碍引物与模板DNA的结合，不能产生有效扩增条带。浓度过高会引起非特异性扩增产物和引物二聚体等的形成^[6]，使目的DNA片段扩增量下降，条带不清晰。由图1可见，浓度为0.15 μmol/L时，扩增条带较弱，不清晰；0.20、0.30 μmol/L 条带比0.15 μmol/L清晰，但有弥散现象，不是很稳定，所以20 μL反应体积中确定条带稳定的 0.25 μmol/L 为最适引物浓度。

2.2 Mg2+浓度的优化

Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产物有显著的影响，Mg2+作为Taq DNA 聚合酶的依赖性因子，不仅影响Taq酶的活性，反应体系中的dNTPs、模板DNA及引物都会与Mg2+结合^[7]。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。由图2可知， 4个Mg2+浓度， 即2.0、1.0、1.5、2.5 mmol/L条件下均有扩增产物，但是Mg2+浓度在1.0、1.5 mmol/L时，条带较少；浓度在2.5 mmol/L时出现非特异性扩增，浓度在 2.0 mmol/L 时条带清晰，稳定性高。所以Mg2+用量为 2.0 mmol/L 是最佳浓度。

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2.3 Taq DNA聚合酶的优化

Taq DNA聚合酶的用量是影响扩增的重要因素，浓度过低会使酶过早地消耗完造成合成效率下降，浓度过高容易产生非特异性扩增且增加成本。从图3可见，不同Taq DNA聚合酶浓度从0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有扩增产物，浓度在0.5 U/μL条带相对较弱，1.0、1.5、2.0 U/μL时扩增出的条带无显著差异，考虑稳定性和成本，而且1.5 U/μL的条带亮度高和稳定性强。最终确定Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/μL。

2.4 dNTPs浓度的优化

dNTPs浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度高会导致片段缺失，而浓度太低又会导致扩增产率下降^[4]。从图4中可见，dNTPs浓度为0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有扩增条带，dNTPs浓度为0.15、0.30 mmol/L时，扩增出的条带较少；在0.20、0.25 mmol/L时扩增条带较多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 条带清晰。因此确定dNTPs浓度为0.25 mmol/L。

2.5 退火温度的优化

为了确定引物的最适退火温度，参照所选引物序列计算理论退火温度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。温度低于Tm值，扩增产物特异性降低，扩增出来的条带较弱；温度过高不利于引物扩增。在本试验中所用引物的Tm值为53 ℃， 从

3 结论与讨论

试验结果表明，通过各个因素的综合对比分析，得出反应体系中4个因子的最佳浓度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反应条件：94℃预变性4min；94 ℃ 变性 45 s，UBC 835退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重复性的优点，但其扩增仍受多种因素的影响，如Mg2+用量、引物浓度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火温度、模板DNA等。试验研究发现，模板DNA对ISSR-PCR扩增的影响不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+对其有很大的作用。Mg2+浓度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR扩增的关键。而dNTP是PCR反应的原料，浓度过高时容易导致错配，同时dNTP会对Mg2+产生拮抗作用^[9]，退火温度高低制约扩增条带的分辨率。上述因素相互依赖、相互抑制。为获得重复性好、可靠性高的扩增条带^[10-11]，本试验采用单因素试验方法来确定各因素的最佳浓度。单因素试验设计可对每个影响因子不同水平进行直观的判断。确定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最适浓度，试验结果对沙地云杉进行遗传多样性分析等研究奠定了基础。

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ISSR分析 第12篇

1 材料

1.1 实验样本

从杭州市随机选取20棵桂花植株, 分别摘取5~6片较嫩叶子, 放入物证袋中分别标记为1~20号, -20℃冰箱保存备用。

1.2 主要仪器

ABI9700PCR扩增仪, ABI3100-A遗传分析仪均购自美国ABI应用生物技术有限公司, 纯水仪购自美国密理博 (millipore) 公司。

1.3 主要试剂

ISSR扩增混合液Amplitaq gold 360 master Mix、Hi-DiTMFomamide (HD) 、GenescanTM-500 LIZTM Size Standard (LIZ 500) 购自美国ABI应用生物技术有限公司, 荧光标记 (FAM) 引物UBC811由上海生工合成, 植物DNA提取试剂盒 (Plant DNAmini kit) 购自由杭州新捷生物科技有限公司。

2 方法

2.1 提取DNA

称取50微克植物叶片, 加入石英砂, 在液氮浸没桂花树叶的条件下研磨后用植物DNA提取试剂盒按说明书操作访求提取桂花DNA, 得到的模板DNA4℃冰箱保存备用。

2.2 PCR扩增

PCR扩增采用25μl反应体系进行扩增, 25μl反应体系中包括13μlISSR扩增混合液, 2μl引物, 2μl模板DNA, 8μl去离子水。

扩增条件为预变性95℃10min, 和30个热循环扩增, 热循环参数设定为95℃30 sec, 53℃30 sec, 72℃1 min, 热循环结束后, 进行72℃延伸10min, 4℃保温。

2.3 扩增产物检测

取1μlPCR扩增产物、12μl去离子甲酰胺和0.2μlLIZ-500内标的混合物放入96孔板中, 混合均匀后, 在3100-A型遗传分析仪上电泳检测, 检测毛细管长度为36cm, 电泳电压为15000V, 激光诱导荧光检测, 用Genmapper3.2软件读取电泳片段长度, 对电泳结果进行分析。

3 实验结果

实验考查了退火温度, 最后延伸时间, 热循环次数对实验的影响。

3.1 退火温度对扩增产物的影响

退火温度对实验至关重要, 退火温度一般与引物的长度和引物中的G-C含量有关;退火温度不能太高也不能太低, 既要保证引物与模板DNA进行有效结合, 又要保证引物与模板结合的可靠性, 温度太高, 引物与模板不能有效结合, 温度太低, 会引起引物与模板错配, 实验重现性差。本文考查了51℃~57℃的范围内退火温度对扩增的影响, 实验结果表明, 退火温度从51℃升高到53℃时, 检测到的电泳峰的数量在减少, 峰的高度在增加, 重现性提高, 温度从53℃升高到57℃时, 电泳峰的数量减少直至消失, 说明随着退火温度的升高, 引物与模板的结合强度降低;以上结果表明, 53℃为本试验的相对较优的退火温度。

3.2 最后延伸时间对扩增产物的影响

本文考查了最后延伸时间对峰高度的影响, 最后延伸时间对扩增有重要的影响, 一般说来, 在每次的扩增过程中, 不是所有的DNA片段都能进行完整的扩增, 因此在扩增的热循环结束后都有一个72℃的最后延伸阶段, 以保障长片段DNA也能完成完整的扩增。本文考查延伸时间在5~20分钟时, 不同时间长度对扩增结果的影响, 实验结果表明:最后延伸时间在10~20分钟之间时, 峰高度区别不大, 但当时间减少到7分钟时, 峰的高度明显降低, 说明, 10分钟是一个合适的延长时间, 本文确定最后延伸时间为10分钟。

3.3 循环次数对扩增产物的影响

一般说来, 在其他条件不变的情况下, 随着循环次数的增加, DNA产物的量也会增加, 相应的DNA检测到的峰的高度也会增高。通常情况下PCR扩增热循环的次数为28次, 热循环次数太少, 产物量不足以检测, 热循环次数太多, 会造成扩增结果不可靠。本实验最初热循环次数设定为28次, 扩增结果不甚理想, 当热循环次数由28次增加到30次时, DNA检测峰高明显提高, 扩增出峰的数量也有所增加, 出现DNA扩增带也随之增加, 对同一样品进行重复实验后, 结果表明, 实验重现性好, 本实验确定热循环次数为30次。扩增后检测得到的电泳谱图见图1。

4 讨论

通过比对20株桂花的ISSR电泳谱图发现, 桂花的ISSR扩增峰主要出现在150~250bp之间, 虽然在实验中仅使用了一个引物UBC811对桂花DNA样本进行扩增, 20个桂花样本共扩增出24个特征峰, 每个桂花样本平均约扩增出5个峰, 通过对电泳谱图的比对, 20个桂花样本没有相同的电泳谱图出现, 说明, 通过ISSR分析可以很好的区分这20个桂花个体, ISSR分析方法可以用于法医植物个体的区分。

目前为止, 已经公开的ISSR分析引物约100余条, 本实验中所用的样品的数量较少情况下, 单一个引物的区分能力可以区分出所有样本, 当样本数量增加的情况下, 可以通过增加引物的数量来增加ISSR分析的区分度, 以区别不同的植物个体。值得一提的是, 对于同一个个体的认定还要进一步进行理论和实验研究。

本论文得到浙江省公安厅支持, 项目名称:《ISSR指纹技术用于生物检材同一认定/排除研究》, 项目编号:20100203

摘要：文章以桂花为例, 对ISSR分析方法用于法庭植物个体识别的可行性进行了初步探索, 文章采用美国ABI公司ISSR分析试剂盒, 以UBC811为引物, 在53℃为退火温度, 10分钟最后延伸时间, 30个循环次数下对20株桂花样本进行ISSR分析, 能得到较好区分结果, 实验共扩增出24条DNA片段, 全为多态性DNA条带。ISSR扩增后检测结果表明ISSR分析技术可用于法庭植物个体识别。