表面散射范文

表面散射范文（精选7篇）

表面散射 第1篇

1 介绍

许多年前染料的各种表面的表面吸附就已经知道, 这种现象常用来确定表面积或粉末的位点面积, 包括染料在溶液中或吸附的聚集状态, 染料如1, 1′一二乙基-2, 2′-花菁或甲叉二丹宁蓝, 得出的相当稳定的结果, 对一种已吸附的染料之间的相互作用, 在基态或激发态, 在伟导带能量状况或金属表面离子体基元的研究都十分有趣。这些已吸附的染料情况Gerischer已经讲座过了。染料吸附在透明金属片和其他支持物上, 对染料吸附在水溶液中的金属胶体上的研究相对更少, 更加引人注目的是金属溶胶可能参加水解反应的发现。分子吸附中银、金、铜电极的表面增加拉曼散射的观察, 开创了一种研究这些关系的新方法。而对几种基片吸附在银和金溶胶上的最近进行的SERS的观察, 尽管对这处作用的解释目前任有争论, 但从到目前为止的积累起来的大量的研究来看, 一引起模式就要出现了。孤对电子的参与或吸附物与表面金属之间的复杂的形成物导致了SERS的必要。在目前的研究中我们试图从几种吸附在金、银溶胶上的几种染料进行检测SERS, 就像下面所显示的那样, 至少, 用碳花氰染料?

2 实验部分

材料:Ag2S04 (贝克曼分析试剂) 、Ag NO3 (MCB) 、柠檬酸钠 (Mallinckradt分析试剂) 、指示PVA (Polysciences, 水解99.0%~99.8%) 、Na BH4 (Alpha无机) 、HAu C14 (依斯特曼。柯达Co。激光级别) 水是经过三次重蒸的。

3 溶胶的准备

三种不同的银溶胶按下列步骤准备:1) Ag2S04 (80mg) 溶解在200m l热水中, 然后再加入5g PVA溶解在接近沸腾温度下吹入HZ3h, 最后将溶液稀释成500ml。2) 将100ml5×10-3MAg NO3逐份加入到300ml2×10-3MNa BH4、Na BH4溶液, 用力地搅拌, 保持温度在冰点温度。在还原过程中加入50ml1%PVA溶液, 然后将浊合液加热沸腾1h以分解过量的Na BH4, 最后将溶液稀释至500ml。3) 900m g Ag NO3溶解在500m l H2O中, 加热沸腾, 加入10m l柠檬酸钠, 然后保持沸腾1h。按步骤1) 和2) 配制的Ag溶胶是棕褐色的, 在400nm处取得最大吸光度, 而按3) 步骤的Ag溶胶为黄绿色, 在400nm处得到最在吸光度。

下面是两种Au溶胶配制:1) 100ml5×10-3MHAu C14逐份加入到300ml强力搅拌的冰点温度2×10-3M-3MNa BH4溶液中, 在还原过程中加入50ml1%PVA, 反应完成后, 煮沸混合液1h以分解过量的Na BH4, 最后将溶液稀释至500ml。2) 240mg HAu C14溶解于50m l水中, 将溶加热沸腾。加入50m l1%柠檬酸钠, 继续加入1h。

尽管金溶胶按步骤1) 配制的是粉红色;而按步骤2) 配制的配制的深红色的, 但它们的最大肖光度都在接近530nm, 除了有其他情况, 否则金、银的聚集以克原子每克来计算。吸光光谱由Cary14分光光度计记录, 罗曼光谱仪由一台Spex1403分光光度讲连接一个Spex-2数字光度计和一个带数据获得监测器的一个Scamp系统控制器。相关的辐射Ar﹢ (在514.5nm) 和Kr﹢ (在647.1nm处) 激光用作激发源。

罗曼光谱样品池是石英圆筒 (1cm厚直径4cm) , 分散的光被聚集起来与激光光束成90°。罗曼信号的分辨率约为±5cm-1。罗曼光谱的获得约花30min左右。在进行拉曼光谱分析的前后光谱很少为变动的事实表明了染料在水溶液中的吸收, 在这段时间内没有分解。

4 结果与讨论

对下面几种染料在银和金胶全上的吸附进行了检测:BICC、SRB、Cu TSPc和甲基橙 (MC) 。被检测的带整电荷的染料要么不吸附要么就引起溶胶的凝聚, 因此免除了对它伞兵检测。然而这并不意味着吸附的染料与溶胶表面通过离子的相互作用进行反就。相反地, 几种结果 (例如, 酒精的作用, 染料的疏水性等) 表明亲水作用作为吸附的主要驱动力 (如下) :

5 碳花氰染料的凝集和吸附

在目前的研究中选择这种染料的主要考虑的是它的吸收光谱, 在红外区很多, 因此很好地与溶胶光谱当它的浓度从4×10-7M增至2×10-6M时在光谱是只能观察到小的变化, 相对于778nm处的吸光度, 在700nm处的吸光度的增加表明在这个范围内只有单体染料分子。然而当染料浓度增至2×10-5M时, 可以观察到二聚物或凝聚。在水中单体染料吸收顶点从它在Mn2SO中的位置蓝移 (λmax=795nm) 。它的吸收系数ε778=1.51×105M-1/cm, 有些偏小, 从表1中可以看出在溶胶吸收区的光谱区域很难探测到染料的吸收。在均相水溶液中, 在浓度达到4×10-5M的范围内, 观察 (λmax=895nm) 不到向红基J凝聚的形成。然而, 经过几天后, 观察到亲水聚合物数目的增加。所有的实验都要新配用新配溶液进行操作。在银溶液胶存在时表蓝染料的光谱图列, 银溶胶自身在λmax=400nm处吸收光, 表明一个微粒的半径为100A, 每个微粒约为2×105个银原子, 其中∽8%是表面原子 (假定为球形微粒, 且银的原子半径为1.38A) 。往溶胶中加入2×105M的BICC仅导致溶胶的光谱增宽, 在溶液里面很少有染料的自由吸收, 我们可以估计的实验条件下大多数溶液少于10%的染料是自由的。染料能轻易地从微粒的表面被覆盖。能过加入酒精如2-Propanol或2-methy1-2propanol或通过高浓度带电粒子的凝结。

摘要：许多年前染料的各种表面的表面吸附就已经知道, 这种现象常用来确定表面积或粉末的位点面积, 包括染料在溶液中或吸附的聚集状态, 分子吸附中银、金、铜电极的表面增加拉曼散射的观察, 开创了一种研究这些关系的新方法。目前的研究中我们试图从几种吸附在金、银溶胶上的几种染料进行检测SERS。

表面散射 第2篇

关键词：体内药物分析,生物样本,表面增强拉曼光谱

一、前言

表面增强拉曼光谱 (SERS) 是一种利用表面电磁场增强提高拉曼信号的分析技术。与红外 (IR) , 紫外 (UV) , 核磁共振 (NMR) , 荧光, X-衍射等光学分析手段相比, 具有很多突出优势。表面增强拉曼检测限非常低, 可用于痕量分析, 甚至可以实现目标检测物的单分子检测;分析过程只需要数毫秒到数十秒不等, 可实现对被分析物快速检测和实时信息反馈;能够提供丰富的指纹图谱信息而具有较高的分析准确性;水分子的拉曼响应较弱, 因此适用于含水样本的分析, 尤其是生物样本, 无需复杂的前处理即可检测;与其他分析方法如IR, 核磁共振等相比, 对样本纯度要求低, 可大大减少样本前处理工作并节约分析成本;拉曼检测所需样本量极少, 且为非入侵破坏性检测, 可为目标检测物的后续分析提供方便。因其可以从复杂基质中提取目标分子结构信息, 故表面增强拉曼光谱尤其适用于生命科学方面的分析应用。体内药物分析是指利用仪器对人或动物体内的血液、尿液、体液、排泄物、组织、器官等样本中药物及其代谢物的分布进行分析, 了解药物进入体内后代谢的途径以及代谢方式等信息, 从而指导药品的生产和临床应用。体内药物分析最大的挑战是生物样品成分复杂、药物及其代谢物浓度低。一般而言, 样本中除了目标检测物外, 还含有大量的蛋白质、多种内源性物质等, 而药物本身的代谢产物、其他共存的药物等也会对检测形成一定的影响。因此其对分析仪器的分离效率和检测限有较高要求。表面增强拉曼光谱由于其超高的灵敏度和指纹图谱分析等优势, 在体内药物分析方面展现了良好的前景。

二、体内药物分析常用方法

目前常用的几类生物样品分析方法有: (1) 色谱法, 可用于大多数药物的检测。 (2) 免疫学方法, 多用于蛋白质多肽类物质检测。 (3) 微生物学方法, 主要用于抗菌药物的测定。

三、表面增强拉曼散射简介

与红外光谱相似, 拉曼光谱是一种分子振动、转动光谱。但前者是通过检测分子偶极矩的变化, 而后者则通过分子极化率的改变获得相关信息。普通拉曼光谱的信号响应非常弱, 其强度大约只有激发光的10-10倍。同时, 普通拉曼光谱的荧光干扰非常强, 即便是目标物或者基质中极弱的荧光响应, 也能覆盖拉曼散射。20世纪70年代, Fleischmann等首次报道了在粗糙的银电极表面吸附的单层吡啶的高质量拉曼光谱。三年后, Van Duyne等证明吸附在粗糙银表面的每个吡啶分子的拉曼信号强度在比其在溶液中增强了106倍。该现象被定义为表面增强效应。SERS是指当目标检测分子被吸附到某些粗糙的金属表面 (如金、银、铜等) 上时, 它们的拉曼散射强度会增加104~106倍;谐振时, 可以高达1014~1015倍, 其中又以银的增强效果最佳。目前认为SERS增强主要基于电磁场增强和化学增强两种机制, 纳米粒子的形貌尺寸以及与相邻纳米粒的距离均会影响粒子周围的电磁场, 进而影响增强效果, 并且被测分子只有位于金属纳米粒产生的电磁场中时才会产生增强的效果, 电磁场越强, 增强效果越好。目前SERS技术已经广泛应用于生物学、材料学、电化学、医药学等各个方面。

四、表面增强拉曼散射用于药物分析

SERS应用于药物分析是近几年才发展起来的。拉曼光谱可以从以下几个方面应用于药物分析: (1) 药物的基础结构鉴定:拉曼光谱已经被用于多种药物的结构分析, 包括苯乙胺类镇静催眠药、手性的β受体阻断剂, 镇静催眠药等。 (2) 对活性成分的定量分析:目前已有通过偏最小二乘法和线性回归分析阿司匹林、对乙酰氨基酚的拉曼数据, 进行定量检测的相关报道。在选定的拉曼光谱频率区间内, 通过改变参数可以对药物中的活性成分进行准确检测。通过对拉曼光谱的分析, 已经实现了抗生素中含有的对乙酰氨基酚单斜和正交晶系含量的准确检测。 (3) 药物的晶型的分析:拉曼光谱也可以用于药物的多晶型分析。盐酸雷尼替丁片中包含有两种晶型的药物———Ⅰ型和Ⅱ型, 这两种晶型可以采用拉曼光谱进行区别并确定含量。该研究认为, 拉曼光谱是一种可以用于定量分析晶型含量的有效方法, 商业药品中的多晶型杂质应低于2%。目前, SERS用于药物分析的相关研究主要集中在药物标准品等纯度较高体系的分析。已有相关研究包括检测苯丙胺、地西泮等精神类药物, 吗啡、可待因等麻醉药物, 地虫硫磷等农药, 另外还有5-氟尿嘧啶, 利福霉素, 阿司匹林等。这些研究多以银纳米溶胶为增强基质, 检测标准样本中的药物, 其最低检测浓度可以达到10-6mol/L。采用SERS分析生物的样本中的目标检测物也有一定测尝试。

五、表面增强拉曼散射用于体内药物分析

直接检测是表面增强拉曼散射最普遍的检测方式, 目标分子吸附在金属纳米粒上, 即可得到目标分子的指纹图谱。大分子和小分子物质的痕量检测都有大量的文献报道。用于生物样本中的直接检验主要针对于单一目标检测, 根据生物样本的种类, 可分为唾液样本分析, 尿液样本分析和血液样本分析。唾液分析相对血浆等常用生物样本有其独特的优势。首先, 样本的获得不会对受试者产生创伤, 减少了试验的危险性和不良事件的产生。其次唾液成分简单, 99.5%以上的成分都是水, 因此对样本的处理要求也相对简单而可以节约实验成本和时间。第三, 在微克级别时, 唾液中的药物含量与血液中的浓度几乎是一致的。采用硅醇还原银或金离子获得SERS活性的毛细管, 唾液中5-氟尿嘧啶, 毒品 (苯丙胺、地西泮、美沙酮、可卡因) 等的检测均已实现, 但技术尚不成熟, 检测限也较高。前者先加水对唾液进行稀释, 在去除硫氰酸根离子等的干扰后, 其5-氟尿嘧啶的检测限可以达到50μg/m L。Frank Inscore等对唾液样本进行固相萃取后, 将其注入含金或银溶胶的毛细管, 并采用便携式拉曼光谱仪检测, 分别检测出了样本中含有的可卡因、苯丙胺、海洛因等药物。其检测限虽只有0.5μg/m L, 但采用便携式拉曼光谱仪进行检测, 为样本的现场鉴定和实时检测提供了可能。

尿液是一种常见的样本, 在美国, 每年大约有3亿的尿液相关分析。Charles J.Choi在常用的IV或尿液收集软管中嵌入了紧密排列的纳米汞和SERS传感器, 实现了人工尿液中异丙嗪和尿素的在线定量监测。其浓度—信号强度曲线的相关系数为0.999, 其检测限大约为3mg/m L。Gerd Trachta等采用HPLC-SERS联用的方法检测了尿液和血液中的双氢可待因、多赛平、西酞普兰, 曲米帕明, 卡马西平, 美沙酮等药物含量。该方法用乙酸乙酯对样本进行萃取富集后, 再采用HPLC进行分离, 根据保留时间取分离后的样本至SERS增强基底上, 进而实现SERS分析。采用该方法, 他们检测了两个过量使用精神药物而致死患者的尿液和血液, 获得了相关药物的SERS图谱。血液是人体组织的重要组成部分, 当人体组织处于不同状态或人生理状况发生变化时, 体内代谢物质在血液中将有所反映, 通过分析人血液的拉曼光谱以实现人体疾病的检测是国内外学术界关注的研究课题, 按照全血取样后的处理方法, 又包括血浆和血清两种。表面增强拉曼散射 (SERS) 技术具有高检测灵敏度、可提供指纹图谱、样品前处理简便, 同时血液中富含的各种生化物质容易与金属纳米粒子相结合, 因此, 将SERS技术应用于人体血液检测具有特别的优势。同时血液样本具有易于获得, 容量较大, 相关报道较多而易于对比借鉴等优点。其中, 血液中抗癌药物的SERS检测具有重大意义。抗癌药物副作用与用药剂量有显著关系, 故通过个体化监测血药浓度来调整给药剂量可显著降低抗癌药物的副作用, 提高病人对药物的耐受性。Yuen C等用SERS检测血浆样本中的紫杉醇。其以微波处理金薄膜-聚乙烯颗粒, 获得重现性较高, 增强效果非常好的增强基底。其标准血浆样本基本不需要进一步处理即可进行检测, 且检测限可以达到10-8mol/L。

六、总结

表面散射 第3篇

在以上理论的基础上, 本实验在SERS检测中引入合适的生物洗脱体系——甘氨酸-HCI缓冲体系, 以探究本方法的洗脱效果、稳定性和重复使用性。

1 材料与方法

1.1 材料

用Frens法制备得的金溶胶, 粒径大约30~40 nm。浓度1 mmol/L的苯硫酚和浓度1 mmol/L的4, 4’-联吡啶分子溶液。3.34 mg/L的羊抗人IgG。小牛血清白蛋白 (BSA) (5%p) 。pH 9的硼砂缓冲溶液。美国Full Moon BioSystems公司的生物芯片。TBS/0.1%Tween、TBS和三次水。

1.2 方法

1.2.1 制备金溶胶作免疫标记

用Frens法制备得到紫红色浑浊的金溶胶, 粒径大约30~40 nm。将浓度1 mmol/L的苯硫酚1μl和浓度1 mmol/L的4, 4’-联吡啶0.4μl两种标记分子溶液分别加入金溶胶中做标记, 同时对标记溶胶进行多次离心, 之后重新悬浮, 以去掉多出来的标记分子。把3.34 mg/L的羊抗人IgG 5μl加进标记溶胶中, 在室温下充分反应后, 对标记溶胶再次离心, 使其悬浮。选择5%p的BSA即小牛血清白蛋白把表面的空位进行封闭, 然后离心, 在硼砂缓冲溶液 (pH 9) 的作用下, 再实现溶胶的悬浮。

1.2.2 制作固相抗体

抗体使用的稀释液是硼砂缓冲溶液 (pH 9) , 稀释的浓度以每毫升200~500μg为宜, 之后把稀释好的液体滴在美国Full Moon BioSystems公司的生物芯片所做的固相基底上, 形成拉曼光谱的采集点。环境湿度维持65%~75%, 把上面所制作好的芯片放入, 12 h后拿出, 然后放在普通室温中, 干燥0.5 h。

1.2.3 组装三明治结构的复合物和进行SERS检测

把之前制得的抗体分别在BSA溶液 (5%) 中、人抗原的缓冲溶液中和标记免疫金溶胶溶液振荡0.5 h、2~4 h和2 h, 在每次震荡后分别用三次水以及TBS/0.1%Tween、TBS和三次水依次冲洗, 再分别用氮气吹干。制得“固相抗体-待测抗原-标记免疫金溶胶”, 它是三明治结构的复合物, 可以用该抗体来进行SERS检测。

1.2.4 仪器

使用的仪器与设备有LEO-1530型扫描电子显微镜、法国Jobin Yvon公司的HR800共聚焦激光拉曼散射仪、He-Ne激光器、电荷耦合检测器和100倍的长焦镜头物镜。

1.2.5 选择洗脱体系

先用人抗原和羊抗人抗体制备抗原和抗体的复合物, 第一次选择强酸的盐酸溶液 (pH 2) 进行洗脱, 让基底在强酸溶液中震荡, 震荡2 h, 把4, 4’-联吡啶作为免疫标记分子, 第二次组装三明治结构的复合物, 用来进行SERS检测, 观察SERS谱图。在看到生物缓冲体系的作用后, 采用甘氨酸-HCI (0.2 mol/L) 生物缓冲体系, 调节体系的pH值, 使pH为2, 再把已制备好三明治夹心结构的基底浸入其中。观察洗脱之前、洗脱5 h、洗脱10 h、洗脱24 h后测得的SEM图。

1.2.6 洗脱后基底的稳定性

选择羊抗人抗体抗原和苯硫酚, 把后者作为标记分子, 制备抗原抗体复合物。然后再用用甘氨酸-HCI体系对复合物洗脱, 分别在暗处放置在10 d、1个月、2个月后, 第二次制备三明治结构。分析经过静置再次组装的三明治结构SERS谱图。

1.2.7 观察载体的重复使用性

洗脱基底1、5、10次, 再分别进行组装, 第二次抗原检测以苯硫酚作为免疫检测标记分子, 通过分析之后的SEM图来研究基底的可重复使用次数。

2 结果

首先通过改变pH值来试图解离抗体抗原复合物, 把洗脱2 h之后第二次组装的三明治夹心结构复合物进行SERS检测, 谱图上显示有3个样点有明显的标记分子信号。洗脱后预期目的已基本达到, 但是在少部分区域出现与标记分子4, 4’-联吡啶特征峰不一样的杂峰和比较复杂的谱峰。该结果提示, 只有强酸体系解离复合物并不利于维持生物环境。因此, 分离的高选择性和彻底性和保护体系生物活性的重要性是SERS检测可再生性的关系因素, 而使用生物缓冲体系后, 既能防止pH变化对提取效果的影响, 又能防止因pH值变化过度而导致的某些活性物质的变性。

之后采用甘氨酸-HCI (0.2 mol/L) 生物缓冲体系进行洗脱, 通过洗脱之前、洗脱5 h、洗脱10 h、洗脱24 h后测得的SEM图进行分析得知, 洗脱时间的选择与抗体抗原分离的彻底性密切相关, 且在洗脱时间为24 h时, 抗原和抗体能充分分离, 因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原, 洗脱效果较好。

把洗脱后的基底分别静置在阴暗处10 d、1个月、2个月后, 第二次制备抗原抗体复合物。通过分析处理后二次制备的复合物SERS谱图, 可见a1振动模式特征谱峰在999和1 573 CTn-1的位置, 而具有苯硫酚特征的峰值清晰。

洗脱基底重复1、5、10遍, 然后再分别组装, 这一过程的SEM图中, 基底上的纳米粒子和洗脱基底再组装的次数呈反比, 这与基底活性点被洗脱次数增加有关。基于上述结果, 第二次抗原检测以苯硫酚作为免疫检测标记分子, 基底洗脱后再组装的次数增加, 可达10次左右。在这一过程的SERS谱图上, 挑选重复1、5、10次的谱图, 这些图谱在1000~1600/cm处具有分辨率不良的、较复杂的杂质峰。

3 讨论

自从1974年Fleisehmarm发现吡啶的表面增强拉曼散射光谱 (SERS) 以来, SERS已经逐渐成为一种研究物质结构性质的快速有效的手段[5]。SERS标记免疫检测是将SERS与标记免疫学相结合, 利用SERS的高灵敏度和光谱选择性, 结合抗体抗原的特异反应作用而进行的纳米标记免疫分析技术[6], 能避免溶液中类似物质的信号干扰, 从而轻易获取高分辨的表面分子信号[7], 由于具有高灵敏度、快捷、方便等特点[8], SERS标记免疫检测已被广泛用于表面科学相关的领域, 其应用领域的有效拓宽直接与活性基底的制备和增强机理的研究密切相关[9], SERS免疫检测已逐渐有成为新的免疫技术的趋势[10]。

本次研究中, 对抗原抗体复合物采用的洗脱的方式选择的是甘氨酸-HCl缓冲体系, 在洗脱1 d后, 抗原和抗体能充分分离, 因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原。优良的再生效果体现在复合物在经过重新组装后, 识别标记分子从而进行SERS检测的能力不变, 仍能使用的次数大约为10次。经过本研究的实验结果证明, 通过甘氨酸-HCI生物缓冲体系洗脱是一种洗脱基底再生效果好和稳定性强的方法。

摘要：目的:探讨表面增强拉曼散射标记免疫检测技术的循环利用问题和价值。方法:采用4, 4’-联吡啶和苯硫酚制备金溶胶作SERS标记分子, 并组装抗原抗体复合物, 用其进行SERS检测, 通过对SERS谱图的分析识别加入的抗原, 重点研究固相抗体的重复使用方法。甘氨酸-HCI缓冲体系能彻底分离抗原和抗体, 在SERS标记免疫检测中, 能通过实验研究该体系对基底再生性和稳定性的影响。结果:使用甘氨酸-HCl缓冲体系对抗原抗体复合物进行洗脱, 在洗脱时间为24h时, 抗原和抗体能充分分离, 因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原。第二次制备抗原抗体复合物时, 基底的再生能力良好, 重复使用的次数可达约10次, 同时能继续识别标记分子, 并进行SERS检测, 具有稳定性。结论:通过甘氨酸-HCI生物缓冲体系洗脱是一种洗脱基底再生效果好和稳定性强的方法。

关键词：表面增强拉曼散射,标记免疫检测,再生性

参考文献

[1]汪佳俐, 曹晓卫, 李欣然, 等.胱氨酸与半胱氨酸混合体系拉曼光谱的化学计量学解析[J].光谱学与光谱分析, 2010, 30 (11) :243-244.

[2]鲍芳.过渡金属核壳纳米粒子的制备及其表面增强拉曼光谱研究[D].苏州大学博士学位论文, 2009.

[3]韩洪文, 闫循领, 班戈, 等.皮疹病人血清的表面增强拉曼光谱[J].光谱学与光谱分析, 2010, 30 (1) :102-104.

[4]葛明, 姚建林, 孙如, 等.基于SERS标记免疫检测的再生性研究[J].光谱学与光谱分析, 2010, 30 (7) :1785-1788.

[5]苏永波, 司民真, 张德清, 等.三种致病性细菌的SERS光谱研究[J].光谱学与光谱分析, 2012, 32 (7) :1825-1828.

[6]韩三阳.磁性复合纳米粒子的制备, 性质及其应用研究[D].苏州大学学位论文, 2010.

[7]卢军军.新型SERS纳米探针的制备及其应用[D].湖南大学硕士学位论文, 2011.

[8]康颐璞, 司民真, 刘仁明, 等.氯霉素在电解法制备纳米银膜上的表面增强拉曼光谱的研究[J].光散射学报, 2009, 21 (1) :25-28.

[9]沈红霞.铁氧化物/金核壳粒子的制备及表面增强拉曼光谱研究[D].苏州大学博士学位论文, 2009.

表面散射 第4篇

1 表面增强拉曼散射

1928年,印度科学家Raman首次发现了光的非弹性散射现象,即拉曼散射效应。然而,拉曼散射信号强度微弱以及极易受到强烈荧光背景的干扰极大地限制了拉曼光谱分析在有机分子、生物化学检测方面的广泛应用。表面增强拉曼效应的发现解决了拉曼散射信号强度过低的问题,使得拉曼光谱分析的应用范围得以大幅度地推广。

1974年,Fleischman等在粗糙的银电极表面吸附的吡啶中观察到了极强的拉曼散射信号[2],这一现象被称为表面增强拉曼效应 ( Surface - Enhanced Raman Spectroscopy,SERS) ,它给拉曼散射的进一步应用提供了可能,但是由于当时的增强因子只有103~ 106,所涉及的检测浓度仅能达到10- 1~ 10- 3M( mol / L) ,与痕量检测还相差甚远,并没有达到实际应用水准。

进入20世纪90年代之后,随着纳米技术的快速发展,表面增强拉曼技术也取得了巨大的突破。1997年Nie等[3]以及Kneipp等[4]分别在银溶胶及银纳米颗粒中独立发现了极强的表面增强拉曼效应,这时的增强因子也达到了1013~ 1014,使表面增强拉曼检测几乎达到了单分子级的水平。

关于SERS产生的机理至今还有疑问,目前普遍认同的是电磁场增强机理和化学增强机理。电磁场机理认为具有一定粗糙度的金属的存在,使得入射光能够激发金属表面所有电子集体运动,产生表面等离子体共振,从而让吸附在表面的分子的拉曼散射信号大大增强了; 化学增强则认为被吸附分子与金属表面的成键作用使得信号得以增强。大量的实验表明单纯的某一种理论并不足以解释所有现象,在很多体系中两种理论共同存在[5]。

SERS光谱基于拉曼散射原理,不仅具有拉曼光谱几乎所有的优点,而且检测灵敏度异常高,能够抑制荧光背景,拉曼的数据处理也简单,准确率高[6]。目前表面增强拉曼散射已经成为环境检测、疾病诊断领域快速、灵敏的高效分析手段,是今后非常有应用前景的技术之一[7]。

2 癌症检测

现代医学技术发达的今天,不管是在广大的发展中国家,还是医疗设备更先进的发达国家,癌症的治疗都是一件非常棘手的问题。提高癌症患者的生存率主要手段考早期的诊断与治疗[8]。细胞之中各种生物分子,磷酸、脂类、糖类以及核酸等,在结构与数量上的细微的变化能够反映出细胞整体的代谢和病理变化[9]。因此,通过癌细胞的SERS光谱,能够在分子层面研究癌变机理。

2. 1 离体肿瘤细胞及细胞成分检测

2. 1. 1 鼻咽癌

鼻咽癌是一种人类头颈部癌症,耳鼻喉科中发病率最高的恶性肿瘤[10]。早期病变难以诊断,一旦查出,大都已进入中晚期,准确、高效、灵敏的检测手段至关重要。

Feng等通过盐酸羟胺还原得到平均尺寸为34 nm的银纳米溶胶,将43例鼻咽癌患者与33例正常人的血浆分别与溶胶直接混合,检测SERS光谱,通过主成分分析 - 线性判决分析( Principal Component Analysis - Linear Discriminate Analysis,PCA- LDA) 联用处理增强数据,其检测灵敏度到达了100% ,特异性达到了90. 7% 。分析图谱发现肿瘤患者血浆中的生化物质,如磷脂、核酸、糖类的含量与正常人相比具有明显的差异[11]。Huang等制备了平均粒径为43 nm的金纳米颗粒,与鼻咽癌细胞在培养液中同时孵育,通过细胞的内吞作用导入细胞内部,分析这种内 吞金纳米 颗粒 ( Intracellularly grown goldnanoparticles,IGAu N) 鼻咽癌细胞的表面增强拉曼光谱,对比鼻咽癌细胞正常拉曼光谱的6处明显的峰 ( 718、1001、1123、1336、1446、1660 cm- 1) ,具有超过20多处的峰得到了增强,细胞内的蛋白、脂类、糖类甚至是细胞核中的DNA产生的峰都能展现[12]。这种细胞内吞法检测细胞SERS光谱为癌细胞( 不仅局限于鼻咽癌细胞) 的研究及诊断提供了重要的参考,具有广阔的应用前景。

2. 1. 2 乳腺癌

乳腺癌是一种严重威胁妇女身心健康及生命的肿瘤,全世界范围内其发病率呈逐年上升趋势[13]。利用SERS光谱技术可以有效的检测乳腺癌。钱晨等人通过细胞内吞金纳米颗粒,检测出了27处蛋白、核酸、磷脂和糖类分子常规拉曼检测不出来的特征峰,493、826、1022、1151以及1427 cm- 1处得到了明显增强[14]。

2. 1. 3 食管癌

相比大部分研究采用的血浆,内部物质浓度不高、拉曼信号不强的缺点,血红蛋白成分更纯,信号更好,更能反映细胞的状况[15]。周雪等用40 nm的银溶胶作为增强基底,以食管癌患者的血红蛋白为检测对象,对24例食管癌患者和20例健康人的血红蛋白SERS光谱进行统计分析,发现两组样本之间存在的巨大差异: 1200 ~ 1800 cm- 1段处食管癌患者的图谱强度弱于正常人,746 cm- 1处明显高于常人。分析归属表可知,食管癌患者的血红蛋白中的苯丙氨酸、络氨酸低于正常人,吡咯环呼吸振动及伸缩振动强于正常人。与健康的人相比,患者血红蛋白中的亚铁离子更多的处于低自旋状态。PCA计算结果表明,其灵敏度达到了96% ,特异性85% ,总正确率91% ,能够为食管癌提供依据[16]。

2. 2 活体肿瘤检测

表面增强拉曼在非侵入式体内肿瘤的分子成像方面引起很大的关注[17]。拉曼成像作为一种重要的生物成像技术,具有窄光谱线、荧光背景干扰小、近红外光激发等优点[18],并且具有作为非侵入式检测体内肿瘤的分子成像对生物样本无损的特点[19],同时与其他生物成像技术相比,拉曼成像光稳定性也更好[20]。

聂课题组制备了偶联有Sc Fv抗体的金纳米颗粒用作体内与体外肿瘤检测的拉曼探针,这种探针能够特异识别上皮生长因子受体 ( EGFR) ,当其结合到EGFR阳性的人头颈癌细胞( Tu686) 时显示出了极强的SERS信号,而对于EGFR阴性的肺癌细胞 ( NCI - H520) 则观察不到明显的信号。此外,这种纳米复合物可以通过SERS检测体内1 ~ 2 cm处的人头颈癌[21]。

Gambhir课题组报道了纳米颗粒Au@ Si O2- Raman活性分子和单壁碳纳米管 ( SWNT) 作为造影剂,利用拉曼显微系统进行活体无损、深层组织的分子拉曼成像。与SERS活性分子相比可知,SWNT在1593 cm- 1处具有极强的特征峰,很容易识别,这表明SWNT可以作为极佳的造影剂用于拉曼生物成像技术当中。将不同碳同位素标记的C12 /13 SWNTs,C12 - SWNT和C13 - SWNTs用作多色拉曼探针,可看出在1528,1590和1544 cm- 1具有存在明显的位移差别的拉曼G带峰,通过修饰不同的靶向 分子,RGD,Herceptin ( anti - Her2) 和Erbitu( anti - Her1) 多肽,利用多通道多色拉曼成像分别靶向结合三种不同的肿瘤细胞,即U87MG ( 人恶性胶质瘤,Integrinαvβ3+ ) ,BT474 ( 人乳腺癌,Her2 + ) 和MDA - MB - 468 ( 人乳腺癌,Her1 + )[22]。

以上研究展现了SERS在非侵入肿瘤成像领域极高的应用价值。

3 总结与展望

SERS技术由于快速、无损以及具有极高的灵敏度和特异性,在癌症检测中展示了良好的应用前景,有望成为临床上癌症诊断的新方法。目前,SERS的研究还处于起步阶段: SER的基底仅限于几种贵金属中,理想的SERS活性基底要求稳定性和可重复性好,至少在一段时间内它的增强能力不变,并且活性基底应做到均一性良好,整个基底的测试性能应该有所保证,信号偏差不能过大,这样的高灵敏的基底才是SERS检测中追求的。进一步挖掘SERS技术的优势,建立和完善癌症的SERS检测数据库,为临床提供依据和标准是今后一段时间科研工作者迫切需要做的。相信对着技术不断的发展,SERS技术在临床检测癌症中能够起着更加重要的作用。

摘要：表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)由于特异性强、灵敏度高,在生物医学领域有着广泛的应用。癌症是目前人类健康的主要杀手之一,及时的诊断与治疗是提高癌症患者生存率的最佳方式。SERS光谱能够准确给出被检测的癌细胞分子层面的信息,运用表面增强拉曼散射技术准确检测癌症成为生命科学和纳米材料领域研究的热点。本文对表面增强拉曼散射原理及在癌症检测方面最新的研究进展进行了综述。

表面散射 第5篇

与传统的检测方法相比，基于激光散射理论的检测手段具有高精度、高效率、非接触的特点，并能实现实时检测。文章搭建了检测系统，实现了对超净光学表面的检测和评定。

1 散射理论基础

假定表面污染物为各向同性、均匀的球型粒子，根据Mie理论的严格推导，有[2,3,4,5,6]:

其中，I0为入射光强，λ为入射光波长，s1和s2为米氏函数。

2 检测原理及实验装置

基于激光散射理论检测的原理是，当激光束以一定角度照射到光学表面后，会发生透射、反射、散射，能量主要集中在反射光和透射光，散射光较微弱。激光束照射在光学表面的微小颗粒上，其散射光向360°的空间范围扩散，利用微光探测器接收微弱散射光，可识别微小颗粒是否存在。当照射区域没有微小颗粒物时，接收器接收不到散射光信号，当照射区域存在微小颗粒时，接收器会接收到微小颗粒的散射光信号，根据区域内的散射光信号强度统计分析，可判断光学表面的污染程度。基本原理示意图如图1所示。

3 系统设计

由于散射光比较微弱，系统采用低噪声前置放大电路及锁相放大电路实现微弱信号的检测，锁相放大电路原理示意图如图2所示。

图2中，MCU控制DDS（数字频率合成器）产生稳定的调制信号，通过激光二极管驱动电路驱动980nm半导体激光器，同时提供同频同相的参考信号给锁相放大电路。激光照射到微尘颗粒后的散射光通过光电探测器转变为电信号，再通过前置放大电路放大，锁相放大电路得到与散射光强度相对应的信号幅值，该信号通过ADC采集并进行模数转换后，通过串口发送给上位机。

根据光电二极管特性设计低噪声前置放大电路，将电流信号转为电压信号。前置放大电路图如图3所示。

乘法运算是锁相放大的核心部分，选用AD633低成本高精度乘法器，其在满幅输出精度误差只有2%，能够满足锁相放大器电路设计要求。锁相放大电路中的乘法器电路图如图4所示。

4 实验

根据以上原理及装置，搭建实验系统如图5所示。把5μm的微尘颗粒样品铺放在样片上，在照明光源的照射下，调节焦距和放大倍数，使之在显微相机上成像，并传送到显示终端。同时，采用与显微系统同轴的激光照射到微尘颗粒上，激光经颗粒散射后，有一部分散射光进入信号接收和处理单元，处理后的数据能够直接在显示终端输出。

图5中的样片采用光学加工精度1级的定制玻片，随机涂抹直径5微米的二氧化硅颗粒，其粒径分布均匀，如图6所示。

首先对系统进行24小时拷机测试，测试结果如图7所示。由图7可知，在测试的24小时内，散射强度读数变化范围为22～23，绝对变化范围为1，相对误差范围小于0.5，说明系统在拷机过程中没有明显温飘，具有很好的稳定性。

通过以上系统进行5μm微尘颗粒扫描实验，实验结果如图8所示。

图8中右侧为显微图像，中间为激光光斑，由图可见，视场中有1个5μm直径的颗粒。图8中左侧为微尘检测锁相放大电路采集并发送给上位机的数据，其数值大小正比于目标散射光强度，通过平移台移动样片，使光斑在5μm颗粒上反复扫过，即形成图中左侧散射强度曲线，可见该系统对于单个5μm颗粒物具有良好的灵敏度和信噪比。

进一步对两组不同洁净度的样片进行全方位扫描实验，样片如图8所示，一个为方形样片，另一个为圆形样片，扫描测试结果如图9所示。

对图9中的扫描结果进行统计分析，统计分析结果如图10所示。

由图11可明显看出，圆形光学表面上存在更多或更大的颗粒物，洁净度较差，因此通过检测和统计分析，可以对光学表面的洁净度和粗糙度进行评价。

5结束语

文章研制的超净光学表面微尘颗粒检测系统具有很好的稳定性、灵敏度和信噪比，对5微米微尘颗粒的散射光具有足够响应，通过对数据的统计分析可定性判断不同光学表面的洁净度和粗糙度。文章的研究为超净光学表面的检测评定提出了高精度、高效率的解决方案，对军工领域和民用领域的光学表面的无损检测具有重要意义。

参考文献

[1]吴东江,曹先锁,王强国,等.KDP晶体加工表面的亚表面损伤检测与分析[J].光学精密工程,2007,15(11):1711-1726.

[2]曹楷,程兆谷,高海军.硅片表面球形粒子散射研究[J].光子学报,2006,35(4):517-520.

[3]Max Born,Emil Wolf.Principles of Optics.Cambridge:Cambridge University Press,1999:759-789.

[4]Wiscombe W J.Improved Mie scattering algorithms.Applied Opti cs,1980,19:1505-1509.

[5]郑刚,蔡小舒,王乃宁.Mie散射的数值计算[J].应用激光,1992,12(5):220-222.

表面散射 第6篇

以往的粗糙面散射研究中,大多采用近似解析法,但近似解析法如基尔霍夫近似法[9](KA)和微扰法[10](SPM)等有小斜率近似的限制,它们的求解不够准确,而且近似解析方法仅能够解决微粗糙度粗糙面的电磁散射问题,矩量法是一种有效研究这类粗糙面散射问题的方法及工具,这是因为它能够避开近似解析方法的上述局限性。本文依据土壤的介电特性,应用矩量法研究了锥形波[3,11]入射时,一维指数型粗糙土壤表面的电磁散射特性,数值计算得到了散射系数随散射角的变化曲线,讨论了粗糙面高度起伏均方根、相关长度、土壤湿度、入射波频率对散射系数的影响。

1理论计算公式

图1为粗糙面电磁散射问题的几何示意图。一维指数型粗糙土壤表面由Monte Carlo方法模拟产生[3],粗面随机起伏高度为z=f(x),且有=0。粗糙土壤表面轮廓记为Sr,θi和θs分别为入射角和散射角。考虑电磁波入射到一维粗糙面上,表示粗糙面Sr上表面任意点的磁场,表示粗糙面Sr下表面磁场,它们满足下面积分方程

这里,G0(undefined,undefined′)和G1(undefined,undefined′)分别为上半空间Ω0和下半空间Ω1中的格林函数,对于粗糙面Sr上的任意点undefined,undefined和undefined满足边界条件

式(2b)中,undefined。

将式(2)代入式(1),并沿x轴离散粗糙表面轮廓Sr为N断,采用脉冲基函数,以点匹配做检验,可得到下面矩阵方程

矩阵方程中,undefined,undefined,f(x)为粗糙面高度起伏函数。其中每个矩阵的元素的具体表达式为

此处:γ=1.781 07,e=2.171 813 8,undefined为上半空间中的Ω0的波矢,undefined为下半空间Ω1中的波矢,Hundefined为第1类1阶汉克尔函数,f′(x)和f″(x)分别为粗糙面高度起伏函数f(x)的一阶和二阶导数。

为了避免人为的边缘效衍射,利用Thorsos锥形波[3]代替一般的平面波入射, 锥形波的射束宽度参数取undefined。利用共轭梯度法解矩阵方程(3)就可以得到U1(x),U2(x),采用锥形波入射后,粗糙面的散射截面为

undefined

式(6)中

2 数值计算结果和讨论

用一维指数型粗糙面来模拟实际的土壤表面,如图1所示。在下面计算过程中若不特殊说明,锥形入射波参数取θi=300,f=0.3 GHz。粗糙面长度Lx=80 λ,将粗糙面长度划分为1 024个网格,采用50个粗糙面样本统计。土壤类型选择沙壤土,含沙量S%=51.5%,黏土含量C%=13.5%,选择不同的土壤湿度mv,土壤的复介电常数ε=ε′-jε″可根据文献[12]计算得到,本文只考虑锥形TM入射波的情形下,一维指数型土壤粗糙表面的电磁散射问题。

2.1 粗糙面高度起伏均方根对散射系数的影响

取l=2.0λ,mv=0.1 g/cm3,f=0.3 GHz,分别取δ=0.1λ,δ=0.2λ,δ=0.4λ,研究粗糙面高度起伏均方根δ对散射系数的影响,数值计算结果如图2所示。可以看出,散射系数σ的镜向幅值随着高度起伏均方根δ的增大而减小,这是因为土壤表面粗糙度随着高度起伏均方根δ的增大而增大,导致相干散射分量减小。另外,当高度起伏均方根δ>0.2λ时,镜向方向不再是整个散射范围内散射系数最大的方向,取而代之的是后向散射方向,其散射系数最大,即后向增强效应。

2.2 粗糙面相关长度对散射系数的影响

图3计算了δ=0.1 λ,mv=0.1 g/cm3,f= 0.3 GHz时,不同粗糙面相关长度l=1.0 λ,l= 3.0λ,l=6.0λ对应的散射系数σ随散射角θs的变化曲线。不难看出,随着粗糙面相关长度l的增大,除镜向附近一个小范围内散射系数σ增大以外,其他大部分散射角范围内,散射系数σ均减小,这主要是由于随着相关长度l的增大,均方根斜率减小,导致散射能量角分布变窄,即表现为相干散射系数增大,非相干散射系数减小。

2.3 土壤湿度对散射系数的影响

取δ=0.2 λ,l=2.0 λ,f=0.3 GHz,土壤类型为沙壤土,含沙量s%=51.5%,黏土含量c%=13.5%,土壤湿度分别取mv=0.1 g/cm3,mv=0.1 g/cm3,mv= 0.1 g/cm3根据文献计算可得到对应的土壤复介电常数ε=4.95+0.09i,ε=4.94+0.16i,ε=18.22+ 0.31i,研究土壤湿度mv对散射系数σ的影响,数值计算结果如图4所示。可以看出,随着土壤湿度mv的增大,散射系数σ在整个散射角θs范围内均有所增加,这主要是因为当土壤湿度mv增大时,土壤有效介电常数的实部增大,导致土壤表面的反射增强,散射σ系数随之增大。

2.4 入射波频率对散射系数的影响

为了进一步研究散射系数σ随入射波频率f变化的特征,本文对此进行了数值计算如图5所示,在计算时取δ=0.2 m,l=2.0 m,mv=0.1 g/cm3,Lx= 80 m,入射波频率分别为f=0.3 GHz,f=1.0 GHz,f=1.2 GHz,土壤类型为沙壤土,通过计算得到不同频率f对应的土壤等效复介电常数ε=4.95-0.09i,ε=4.94-0.16i,ε=4.92-0.25i,研究入射波频率f对散射系数σ的影响,数值计算结果如图5所示。可以看出,随着入射波频率f的增大,散射σ的镜向幅值逐渐减小,这主要是因为土壤表面的粗糙度及目标参数均固定,入射波频率f越高,则粗糙面的相对粗糙度就越大,导致镜向散射系数σ幅值随入射波f增大而减小。

3 结束语

本文使用矩量法离散了粗糙土壤表面积分方程,并利用共轭梯度法求解了该矩阵方程,数值计算了由Monte Carlo方法模拟的一维指数型粗糙土壤表面在锥形波入射情形下电磁散射的特性,讨论了粗糙面高度起伏均方根、相关长度、土壤湿度、入射波频率对复合散射系数的影响。得出一维指数型土壤表面散射系数的基本特征和随频率变化特征。结果表明,高度起伏均方根、相关长度、土壤湿度、入射波频率对粗糙面散射系数有显著影响。毫无疑问,这些结果在诸如环境遥感、探地雷达、无线电传播与通信、粗糙面重构等电磁散射问题中有着广泛的应用。当然本文仅限于对一维指数型粗糙土壤表面电磁散射进行了研究,对于其它类型的一维粗糙面、以及更为复杂的二维粗糙面的电磁散射问题有待于今后作进一步研究,有关理论和计算结果还有待于实验验证。

参考文献

[1] Ulaby F T,Moore R K,Fung A K.Microwave remote sensing.Lon-don:Addision-Wesbey Publishing,1982

[2] Menedez J,Pinczuk A.Light scattering determinations of band offsetsin semiconductor Heterostructures.IEEE Journal of Quantum Elec-tronics,1988;24(8):1698—1710

[3] Tsang L,Kong J A,Ding K H,Scattering of electromagnetic waves.New York:John Wiley&Sons.Inc,2001

[4] Thorsos E I.The validity of the perturbation approximation for roughsurface scattering using a Gaussian roughness spectrum.Acoust SocAm,1989;86(1):261—277

[5] Elfouhaily T M,Johnson J T.A new model for rough surface scatter-ing.IEEE Trans on GRS,2007;45(7):2300—2308

[6]刘鹏.三维粗糙面电磁双站散射的直接型区域分解计算.计算物理,2010;27(1):73—81

[7]葛德彪,闫玉波.电磁波时域有限差分方法.西安:西安电子科技大学出版社,2002

[8] Ku Hwarching,Awadallah R S,McDonald R L.Fast and accurate al-gorithm for electromagnetic scattering from 1-D dielectric ocean sur-face.IEEE Transaction on Antennas ands Propagation,2006;54(8):2381—2391

[9] Ishimaru A,Chen J S.Scattering from very rough metallic and dielec-tric surface:a theory based on the modified Kirchhoff approximation.Waves in Random Media,1991;1(1):21—34

[10] Yang Junhua,Guo Lixin,Wan Jianwei.Study of electromagnetiscattering from fractal sea surface based on non-fully developed seaspectrum.Acta physic sinica,2007;56(4):2106—2114

[11] Throsos E.The validity of the Kirchoff approximation for rough sur-face scattering using a Gaussian roughness spectrum.J Acous SocAm,1988;83(1):78—92

表面散射 第7篇

已有研究表明表面增强拉曼散射方法在检测单个分子及纳米生物诊断技术领域有巨大的潜能[4,5,6]。本研究根据既往研究结果, 协同组合拉曼信号增强方法与生物亲和性分析方法而设计了一种基于表面增强拉曼散射的检测新方法。铜蓝蛋白 (Azurin) 能够被癌症细胞选择性结合而进入细胞内, 且其能够和p53形成稳定和特异性复合物, 从而增加p53抑癌作用[7]。本研究使用4-氨基硫代苯酚 (4-Aminothio phenol, 4-ATP) 作为连接物, 4-ATP一侧为硫醇基, 能够与金纳米颗粒结合, 另一侧为重氮基团, 可以与p53富含电子的芳香族侧链结合。连接金纳米颗粒的p53和由Azurin分子层构成的捕获底物组成检测分子。由于p53-4-ATP纳米颗粒拉曼光谱大幅度增强, 这使得检测分子能够高灵敏度和高特异性性地检测p53分子, 其最低检出浓度可达5×10-3M。

1 材料与方法

1.1 官能化金纳米粒子制备

金纳米颗粒母液与4-ATP (0.5 mg/m L溶于五水乙醇中) 以体积比1∶1混合。得到的混合溶液在20℃下温育3 h。通过拉曼光谱和紫外-可见分光光度法观察4-ATP和金纳米粒子之间共价键的形成。除去过量的未结合4-ATP且促使乙醇和Milli-Q水溶液置换, 采用截留分子量100 KDa的膜透析溶液。紫外检测膜上的液体, 当检测不到4-ATP时停止透析。随后, 在约2℃下200μL酸化亚硝化剂Na NO2缓慢加入200μL 4-ATP纳米颗粒溶液透析液中持续搅拌15 min。只观察到很少的氮气气泡, 证实了重氮化4-ATP纳米粒子系统的稳定性。在混合物中加入苯酚监测该反应, 当反应溶液出现红色时即表示反应完成。2℃Milli-Q冰水中透析除去过量的亚硝酸和盐酸, 所得溶液p H值用磷酸盐缓冲液稳定在7.2, 以避免在偶联反应中脱氨的和蛋白质伸展的危险。将200μL p53加入到反应得到的重氮化合物, 进一步透析以除去未结合的蛋白, 由拉曼光谱和紫外可见分光法评估重氮化偶联反应率。

玻璃基片在丙酮中超声清洗2 min, 并采用Piranha蚀刻以增加基片表面硅烷醇基团数目, 随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶解在2-丙醇, 静置4 h以形成自组装层。修饰后的基片用2-丙醇彻底冲洗, 在110℃下烘烤10 min, 然后在室温下与1%的戊二醛溶液反应30 min。用Milli-Q水彻底漂洗后, 醛基修饰基片与天青蛋白或不同摩尔比p53/人血清蛋白共同孵育, 并通过暴露于溶剂中的氨基基团形成自组装单分子膜蛋白 (图1) 。

1.2 纳米粒子表征

原子力显微镜和扫描探针显微镜扫描检测制备过程中样品表面形态。

蛋白质覆盖的基底与之前在磷酸盐缓冲液中结合到4-ATP纳米颗上的相关蛋白室温下孵育3 h, 使得铜蓝蛋白与p53相互作用, 然后用磷酸盐缓冲液冲洗基板以除去未结合的p53-4-ATP纳米粒子。

采用装备有帕尔贴 (Peltier) 制冷片的CCD探测器及单光栅摄谱仪的Lab Ram共聚焦装置记录20℃下空气中拉曼光谱和表面增强拉曼散射光谱。数值孔径为0.9的100×显微镜物镜产生直径约1μm的激光斑点。光源为He-Ne激光器, 功率为 (6.5±0.5) m W, 提供632.8 nm的辐射。通过在相同的共聚焦区扫描每个时间单位不同采样区域获得SERS光谱, 以提高表面增强光谱“热点”辐射数目, 且同时减少对辐射样本的漂白效果。典型的拉曼光谱采集数为积分时间20 s重复5次扫描。采用光程长为1 cm的比色皿和频宽0.5 nm的双光束Jasco V-550紫外-可见分光光度计室温下记录光学吸光度。

1.3 统计学方法

所有测试重复三组, 所有数据均用平均值±标准差 (±s) 表示, 单向方差和Bon-ferroni的事后检测分析数据集的差异, P<0.05被认为差异有显著性, 所使用统计软件为SPSS 18.0。

2 结果

2.1 p53-4-ATP纳米颗粒系统形成过程中的拉曼光谱特征

p53-4-ATP纳米颗粒系统形成的每一步都进行拉曼光谱分析, 振动光谱包含在选择的波数范围内, 参考以往文献, 检测发生改变的光谱 (图2) 。

本研究表明4-ATP连接器与金纳米粒子共轭前 (图2A) 后 (图2B) 光谱之间有显著差异。S-Au共价键形成表明4-ATP与金纳米颗粒成功结合, 而S-Au共价键形成的标志是振动光谱在波段中心2 550 cm-1处消失, 这正是S-H固有的伸缩振动波带 (图2A、B) 。此外, 大部分4-ATP与纳米粒子结合后, 1 000~1 700 cm-1区域中的峰强度明显增加, 且还伴有相对强度发生变化以及可观的频率红移。

重氮化反应后, 其中涉及通过暴露组氨酸和/或酪氨酸残基与p53结合, p53-4-ATP纳米粒子系统整体SERS光谱显示集中于约1 328 cm-1处的附加谱带 (图2C) , 新频谱属于重氮键的伸缩振动模型, 该键使蛋白紧密结合在4-ATP纳米粒子系统上。此频谱强度随着用于重氮化反应的p53浓度增加, 表明随着p53浓度的增加每个4-ATP纳米粒子系统能够与数目不断增加的p53分子结合。因此, 1 328 cm-1处的频谱构成了p53共价结合至4-ATP纳米粒子上的光谱指纹谱, 其存在表明p53被包含识别元件的天青蛋白捕获。1 390~1 435 cm-1周围的其他拉曼谱带是4-ATP纳米粒子系统的特征, 可用来检测4-ATP与纳米粒子的结合。

2.2 p53-4-ATP纳米颗粒系统形成过程中的共振吸收带特征

由于金纳米颗粒表面电子的集体振荡能够产生共振吸收带, 也就是局域表面等离子体 (localized surface plasmons, LSPs) , 采用紫外-可见光谱 (ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis) 监测共振吸收带能够追踪与研究P53-4-ATP纳米粒子的组装过程。裸纳米颗粒吸收带集中在530 nm处 (图3, 实线) , 而4-ATP与纳米粒子结合后, 等离子共振带从最大处530 nm偏移至541 nm (图3, 点状线) 。由于红移与吸附到金纳米粒子上的分子数目成比例, 本研究推测在最大位移处纳米粒子表面被4-ATP分子完全覆盖。当4-ATP金纳米颗粒进一步与p53分子结合后, 等离子共振带从最大处541 nm偏移至555nm (图3, 虚线) 。在此最大偏移处, 本研究推测每个4-ATP纳米粒子被p53分子完全覆盖。此外, 吸收峰上在红移处有高斯卷积的肩峰特征, 这提示等离子共振带在630 nm处还有集中的深层分布 (图3, 黑点) 。

2.3 铜蓝蛋白修饰基板与p53-4-ATP结合的SERS光谱特征

为了检测p53, 本研究将p53-4-ATP纳米粒子溶液流入由固定天青蛋白单层组成的捕获平台上。短暂孵育后, 冲洗该系统数次以除去未结合的p53-4-ATP纳米分子, 继而进行SERS光谱测定。图5显示了铜蓝蛋白修饰基板与不同浓度p53-4-ATP结合前后的SERS光谱特征 (图5A-D) 。在图5A中未见拉曼特征指纹图谱, 而在图5B-D中可以清楚观察到, 证实p53分子被铜蓝蛋白识别和捕获。随着p53浓度的减少拉曼信号的信噪比逐渐降低。低于5×10-13时 (图5D) , 该比率变得过低 (信噪比<3) , 因此本研究该浓度是本方法p53最低检测限。对照组中4-ATP纳米粒子浓度降低, 且没有p53结合, 因而不能与铜蓝蛋白包覆平台结合, 导致无拉曼特征频谱产生 (图5A) 。每个p53浓度用三个独立的样本重复进行表面增强拉曼光谱实验, 所得结果具有良好的重复性。

2.4 铜蓝蛋白修饰基板与p53-4-ATP结合前后纳米粒子表面形态

本研究结果发现即使当表面增强拉曼光谱波段与噪音难以区分时, p53-铜蓝蛋白生物识别行为仍然能够被检测到。图6A中, 垂直剖面显示各项同性分子填料高度约 (3.1±0.5) nm, 粗糙度约 (1.7±0.5) nm, 这与单个铜蓝蛋白分子层一致。图6B显示颗粒较大且相当有规律的斑点出现在基板上, 这与结合到p53上的纳米粒子一致。基板与缺乏p53的4-ATP纳米粒子孵育后表面形态特征与图5A中所示相似。

虽然这种原子力显微镜方法对特异性超灵敏度检测很有希望, 但仍需要进一步研究以获得能够定量检测且重复性好的基础, 然而, 这需要对基板上形成复合物的量进行评估。对获得的图像进行统计学分析显示复合物形成消耗的p53-4-ATP纳米颗粒分子, 只占最初加入的与铜蓝蛋白反应的p53-4-ATP纳米颗粒的20%。这表明只有20%的官能化纳米粒子与基板成功反应。

2.5 铜蓝蛋白纳米颗粒检测p53的特异性

为了检测该方法是否在多种蛋白中选择性检测到肿瘤标记物p53, 本研究首先分析铜蓝蛋白在过量人血清蛋白存在条件下能否识辨和捕获p53, 人血清蛋白是人血清中最丰富的蛋白。本研究使用一个供选择的装置, 在其中天青蛋白与4-ATP经重氮化偶联, 并且用SERS标记物来筛选各种样本, 将不同浓度含有p53和人血清蛋白的样本滴加至载玻片上孵育, 从而使人血清蛋白和p53固定化。接着, 是铜蓝蛋白-4-ATP纳米粒子系统流到基板上且用大量的清水漂洗未被蛋白包覆的基板捕获的物质后进行SERS测量。图7显示了人血清白蛋白/p53样本在0、10、100及1 000摩尔比及只含有人血清白蛋白样本的典型SERS光谱, 所有这些样本都经铜蓝蛋白改性的纳米粒子处理过。值得注意的是铜蓝蛋白-4-ATP纳米粒子系统的特征SERS波段的强度随着人血清白蛋白/p53摩尔比的增加逐级减小 (图7A-D) 。这些波段在只含有人血清白蛋白的基板上不存在 (图7E) 。因此, 可以推断只有在铜蓝蛋白-4-ATP纳米粒子分子与固定在基板上的p53形成复合物时才出现SERS信号指纹图谱。

A:未结合p53-4-ATP的铜蓝蛋白修饰基板表面形态;B:结合p53-4-ATP的铜蓝蛋白修饰基板表面形态

值得注意的是, 来源于铜蓝蛋白4-ATP纳米粒子共轭物的拉曼标记物比相应的之前的配置产生更强烈的SERS信号, 这是由于每个纳米粒子周围有较大数目的铜蓝蛋白分子。事实上, 通过假定铜蓝蛋白和p53为球体, 直径分别为3和6 nm, 本研究推测最多约980个铜蓝蛋白分子和250个p53分子紧密堆积在每个纳米粒子周围, 直径约50 nm。

对照试验中使用了人血清, 因其除了白蛋白还包含其他分子。为此, 玻璃基板醛基部分与人血清共同孵育。随后, 铜蓝蛋白-4-ATP纳米粒子溶液流过这些基板以检查铜蓝蛋白和血清中分子的任何相互作用。漂洗后, 没有检测到明显的SERS信号, 且所得到的光谱的确类似于图7E所示。这表明铜蓝蛋白改性的纳米粒子与人血清分子没有相互作用, 所以可以推断没有干扰p53-铜蓝蛋白复合物的形成。

3 讨论

本研究拉曼-SERS结果表明p53-4-ATP纳米粒子系统可显著提高拉曼指纹图谱信号, 且振动功能容易分辨及时间较为稳定。通常的, 当分子被结合到金属表面 (SERS效应) 拉曼横截面增大是由于两个主要的SERS机制, 即, 电磁场增强机制, 其与表面等离子体共振引起的大局部场有关, 及从金属到吸附分子的电荷转移[7,8]。对于4-ATP结合到金纳米粒子上, 在图2B中所观察到的在1 141 cm-1和1 435 cm-1处条带着增强可以归因于电荷转移机制, 4-ATP纳米粒子的其他条带选择性增强主要是由于电磁场增强机制[9]。从信号到C-S团的噪声强度比, 估计SERS有约7个数量级的增强。如此巨大的提高使得本研究p53检测方法的最小检出值优于文献报道的结果。最新研究报告了新颖的基于生物亲和性的方法, 采用一致的DNA序列和单克隆抗体吸附在等离子共振体表面、金电极及金属纳米结构上, 其能够提高酶联免疫吸附测定法的肿瘤标志物的检测限。这些新技术可以在皮摩尔浓度证明p53基因[10], 提示本研究方法检测值可以与这些生物传感器所得到的最好的结果相媲美甚至更好[11]。因而本研究方法的主要优点是在低浓度下很容易检测出目的蛋白及分析时间相对较短。此外, 与经典的夹心酶联免疫法一样不需要多个步骤。值得注意的是, 本研究基于SERS的检测方法仍然需要进一步改进以灌输增强因子, 如:优化金纳米粒子的尺寸, 拉曼标记物与纳米粒子表面之间的距离, 甚至铜蓝蛋白分子在基板上的排列进一步改进。

TM-AFM图像上很少的大斑点的存在可能是由于二聚体的形成, 与紫外可见光谱下中心630 nm处观察到的等离子模式相对应, 这可能与一些颗粒间的偶合效应有关[12]。因此, 本研究推测, 在重氮化偶合反应中, 一些p53分子与不同硝基化4-ATP纳米粒子形成多重键, 从而促进局部电浆带颗粒间的调制。这一效应可能是一些胶体多分散性的原因。

通过耦合SERS与原子力显微镜单分子成像能力实现检测水平的进一步降低, 使得监测单独复合物形成成为可能。事实上, 铜蓝蛋白包被的基板与p53-4-ATP纳米粒子溶液孵育后, 采用TM-AFM检测可观察到大的斑点, 这表明纳米粒子在基板上有效沉积, 及共存的铜蓝蛋白与p53之间特异性复合物的形成。

在人血清中其他分子存在的情况下本研究方法具有特异性检测p53的能力, 提示该方法具有选择性。该检测方法不但具有选择性, 还具有高重复性、精确度和速度, 是有效的检测p53的生物传感器。

摘要：目的 制备超灵敏检测p53基因的基于表面增强拉曼散射的纳米生物传感器。方法 p53分子通过双官能团连接4-氨基苯硫酚 (4-ATP) 的方式固定在金纳米粒子上。p53-4-ATP纳米粒子系统的特征振动谱带用来识别p53分子, 当这些分子被包含有单分子层天青蛋白分子中有对这种抑癌基因显著亲和力的识别衬底捕获。结果 由4-ATP介导交联p5350 nm金纳米颗粒实现的拉曼信号增强使在浓度低至5×10-13M时检测出这种蛋白。p53-4-ATP纳米粒子系统可显著提高拉曼指纹图谱信号, 振动功能容易分辨, 时间较为稳定, 且在低浓度下很容易检测出目的蛋白及分析时间相对较短。铜蓝蛋白包被的基板与p53-4-ATP纳米粒子溶液孵育后, 采用TM-AFM检测可观察到大的斑点, 这表明纳米粒子在基板上有效沉积, 及共存的铜蓝蛋白与p53之间特异性复合物的形成。结论 基于铜蓝蛋白的SERS方法检测p53肿瘤抑制基因的方法具有高灵敏度和选择性。能够检测到p53的最低浓度是5×10-13M, 在血清甚至血清环境中其他生物分子存在的情况下能够选择性地检测到p53。

关键词：表面增强拉曼光谱,p53,超灵敏检测,原子力显微镜

参考文献

[1]LANE DP, CHEOK CF, LAIN S.p53-based cancer therapy[J].Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010, 2 (9) :1222-1228.

[2]LEVINE AJ, OREN M.The first 30 years of p53:growing ever more complex[J].Nat Rev Cancer, 2009, 9 (10) :749-758.

[3]JEONG HA YOO, IN SANG YOO, WON JUNG YOON, et al.Surface enhanced Raman scattering[J].Chem Soc Rev, 1998, 127 (16) :241-250.

[4]HU X, MENG G, HUANG Q, et al.Nano-petri-dish array assisted glancing angle sputtering for Ag-NP assembled bi-nanoring arrays as effective SERS substrates[J].ACS Appl Mater Interfaces, 2014, 6 (11) :7991-7995.

[5]AVCI E, CULHA M.Influence of protein size on surface-enhanced raman scattering (SERS) spectra in binary protein mixtures[J].Appl Spectrosc, 2014, 68 (8) :890-899.

[6]ZHONG LB, YIN J, ZHENG YM, et al.Self-assembly of Au nanoparticles on PMMA template as flexible, transparent, and highly active SERS substrates[J].Anal Chem, 2014, 86 (13) :6262-6267.

[7]BIZZARRI AR, CANNISTRARO S.Levy statistics of vibrational mode fluctuations of single molecules from surface-enhanced Raman scattering[J].Phys Rev Lett, 2005, 94 (7) :068303-068306.

[8]BIZZARRI AR, CANNISTRARO S.Statistical analysis of intensity fluctuations in single molecule SERS spectra[J].Phys Chem Chem Phys, 2009, 9 (7) :5314-5319.

[9]WANG J, KONG LT, GUO Z, et al.Synthesis of novel decorated one-dimensional gold nanoparticle and its application in ultrasensitive detection of insecticide[J].J Mater Chem, 2010, 20 (12) :5271-5279.

[10]JACKSON JB, HALAS NJ.Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (16) :17930-17935.

[11]WU Y, BURANDA T, METZENBERG RL, et al.Diazo coupling method for covalent attachment of proteins to solid substrates[J].Bioconjug Chem, 2006, 17:359-365.