筛选反应体系范文

筛选反应体系范文（精选6篇）

筛选反应体系 第1篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试亚麻品种有:原2003-84、K-6542、SXY8,均由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供。

1.1.2 酶与试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP、DNA提取试剂盒,100 bp ladder、琼脂糖及常规试剂购于Tiangen生化科技有限公司。

1.1.3 PCR引物

60条ISSR引物委托上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 亚麻总DNA提取与检测

亚麻总DNA提取参照Tiangen DNA提取试剂盒试验步骤。分别取0.6 g 3个亚麻品系的叶片提取总DNA,提取的DNA分装贮于-20℃;亚麻总DNA的浓度检测采用琼脂糖凝胶电泳法,琼脂糖凝胶电泳方法参照文献[6],取1 μL提取的各基因组 DNA在0.8%Agarose上进行电泳,用标准分子量λDNA/Hind Ⅲ 进行比较,进而检测所提取各基因组DNA的浓度和完整性。

1.2.2 ISSR反应条件

为确定最佳的PCR反应体系,设置4个Taq酶浓度:0.5、1.0、1.5、2.0 UmL-1;4个dNTP浓度:0.15、0.20、0.25、0.30 mmolL-1。选用U853引物,其浓度设4个:0.3、0.4、0.5、0.6 μmolL-1;退火温度设3个:50、55、60℃。根据扩增结果,选择出最佳的PCR反应体系。PCR扩增程序为:94℃ 4 min;94℃ 40 s,50、55、60℃ 1 min,72℃ 90 s,40个循环;72℃ 10 min。

2 结果与分析

2.1 PCR反应优化

2.1.1 不同Taq酶浓度对扩增结果的影响

Taq酶浓度共用4个梯度,从图1中可以看出1.0 UmL-1时能扩增出条带,但不清晰,当增加到1.5 UmL-1时扩增效果较好,因此确定1.5 UmL-1是最佳浓度。

2.1.2 不同引物浓度对扩增结果的影响

引物浓度设4个梯度,图2中显示0.3 μmolL-1 时未扩出条带,0.4 μmolL-1扩的条带不清晰,0.5和0.6 μmolL-1扩增的效果好,但二者没有明显区别,因此确定0.5 μmolL-1是最佳浓度。

2.1.3 不同dNTP浓度对扩增结果的影响

dNTP浓度设了4个梯度,图3中dNTP浓度为0.15 mmolL-1时扩增条带少,而且条带模糊,而0.25 mmolL-1扩增的条带数目多而且清晰,因此0.25 mmolL-1是最佳浓度。

2.1.4 不同退火温度对扩增结果的影响

退火温度设3个梯度,由图4可知,55℃是最佳退火温度。

2.2 优化后亚麻最佳ISSR反应条件及PCR程序

通过Taq酶浓度优化、dNTP浓度优化、引物浓度优化,优化出适宜亚麻ISSR的PCR反应体系PCR体系(20 μL):10Buffer 2 μL,Mg2+(2.5 mmolL-1),dNTP(0.25 mmolL-1),ISSR 引物(0.5 μmolL-1),Genome DNA(50 ng),Taq1.5 UμL-1。通过退火温度梯度试验优化出适宜亚麻ISSR的PCR程序,确定优化后的PCR程序为94℃ 4 min;94℃ 40 s,55℃ 1 min,72℃ 90 s,40个循环;72℃ 10 min。

2.3 筛选出适宜亚麻ISSR的引物

该试验筛选出适宜亚麻ISSR的引物13条,其序列见表1。

1:U822,2:U824,3:U835,4:U836,5:U841,6:U848,7:U853,8:U854,9:U857,10:U859,11:U886,12:U888,13:U889,M:100 bp ladder

从60条ISSR引物中选取扩增结果较好的引物(见图5),综合原2003-84、K-6542、SXY8,3个品种为模板的结果,60条ISSR引物中有13条(序列见表1)扩增出的条带清晰,多态性好,重复性高。

3 结论与讨论

植物材料DNA的提取质量往往是决定PCR成功与否的关键。由于亚麻叶片中含有大量单宁、多糖类及色素等物质,同时蛋白质含量也较高,且越老的叶片中这些杂质含量越高,这些物质易与DNA结合形成粘稠的胶状物,既难溶解,又会抑制Taq酶活性,从而影响PCR反应的质量。因此该试验以亚麻的幼嫩叶片为材料提取DNA,并且采用Tiangen公司生产的DNA提取试剂盒,这样既保证了试验质量,又提高了试验效率。

通过优化适宜亚麻ISSR的PCR体系和程序,利用筛选出的适宜亚麻的ISSR引物可以对亚麻种质资源进行分子鉴定,并为亚麻种质资源的亲缘关系提供分子依据。

参考文献

[1]Zietkiewiecz E,Rafalske A,Iabuda D.Genome finger-printing by si mple sequence repeat(SSR)anchored poly-merase,chain reaction amplyficatlon[J].Genome,1994,20:178-183.

[2]Fritsch P,Riese L H.The use of random amplified poly-morphic DNA(RAPD)in conservation geneties[M]//SmithT B,Wayne R K.Molecular Genetic Approachesin Conser-vation.London:Oxford University Press,1996:54-73.

[3]Hedrick P W.Conservation genetics and molecular tech-niques:Apespective[M]//Smith T B,Wayne R K.Molec-ular Genetic Approaches in Conservation.London:OxfordUniversity Press,1996:459-477.

[4]CHEN Xiang-ming,ZHENG Guo-sheng,MENG Li.RAPD-PCRanalysis of genetic diversity of different colour35 tree paeonia cultivars[J].Sci Agric Sin,2002,35(5):546-551.

[5]LI Jin-bo,JI ANG Liang-rong,LI Chun-hai,et al.Compari-sions of genetic analysis based on ISSR and SSRin PGMSand TGMS rice lines[J].Moecul Plant Breed,2003,1(1):42-47.

筛选反应体系 第2篇

关键词：芒果；SRA标记；正交试验设计；体系优化；引物筛选

中图分类号： Q9432；S667703文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-004-03

芒果（Mangifera indica L）为漆树科常绿果树，是著名的热带亚热带水果，享有“热带果王”之美誉，为世界五大名果之一。近年来由于我国芒果种质资源的深入挖掘利用以及芒果育种的进步，特别是国外引进品种的增多，芒果种质资源日益丰富，为芒果的品种创新奠定了坚实的基础，同時也对芒果遗传多样性鉴定和新品种测试与保护工作提出了新的挑战。

相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRA）是Li等于200年发明的一种新的标记技术。该技术集随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAD）和扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFL）技术的优点于一体，具有简单、稳定、在基因组中分布均匀等优点。目前已应用于苹果、柑橘类果树、樱桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲坚果[2]、菠萝、桃、花生[3]、番木瓜[4]等，但至今尚未见SRA分子标记应用于我国芒果遗传多样性分析、分类鉴定等方面的报道。[3]笔者在开展芒果遗传多样性及其亲缘关系研究的过程中发现，SRA-CR条件的变化会得到不同的结果，影响芒果的遗传多样性评价，因此构建适用于芒果的SRA-CR体系至关重要。

[3]本试验以0份芒果种质为材料，借鉴其他作物的研究成果，就影响芒果SRA-CR反应的因素进行探索，建立了适合芒果SRA分析的反应条件及体系，旨在为芒果种质资源鉴定和创新、分子标记辅助育种等提供技术帮助，为近一步开展芒果种质资源遗传多样性研究及遗传连锁图谱的构建奠定基础。

材料与方法

试验材料

参试芒果种质共0份，均采自广西亚热带作物研究所芒果种质资源圃。选取芒果健康植株上的无病虫嫩叶，采摘洗净后于-70 ℃保存，反应体系的优化以金煌芒DNA为模板完成，供试品种见表。

2试验方法

2DNA的提取和检测芒果基因组DNA的提取参照何新华等的CTAB法[5]，并稍加改良，利用0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，根据样品D260 nm/D280 nm计算DNA纯度，根据D260 nm值计算样品DNA的浓度，并稀释至0 ng/μL，于-20 ℃保存备用。

22SRA-CR反应条件参考Li等所用引物[，6]，设计0条正向引物和0条反向引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。选用引物Me9与Em9进行体系优化，试验重复2次。扩增程序：94 ℃预变性 min，35 ℃退火 min，72 ℃延伸5 min，5个循环；94 ℃预变性 min，50 ℃ 退火 min，72 ℃ 延伸 5 min，35个循环；72 ℃延伸0 min，4 ℃保存备用。CR产物用20%琼脂糖凝胶在 05×TBE 电泳缓冲液中、85 W条件下电泳5 h，采用核酸染料染色法进行条带检测。电泳结束后，于凝胶成像系统上检测并拍照，依照扩增条带的敏感性与特异性，即条带的强弱及杂带的多少来判断各体系的优劣。

24优化体系的稳定性检测及引物筛选随机选择6对SRA引物组合对优化体系进行验证，确定芒果SRA-CR的最佳反应体系和扩增条件，并对00条引物组合进行CR扩增，筛选多态性引物。

2结果与分析

2芒果基因组DNA的检测结果

DNA的提取质量是决定SRA-CR扩增效果的关键因素之一。本试验以芒果嫩叶为材料，对0份芒果种质材料的基因组DNA 进行提取，最后得到的DNA呈透明絮状，电泳后条带清晰，无拖尾现象（图）。经分光光度计测定，所用DNA样品的D260 nm/D230 nm值均在20～25之间，D260 nm/D280 nm 值均在7～9之间，表明所提取的DNA质量较高，符合试验要求。

[FK（W0][TZYtif][FK）]

22正交试验设计的SRA-CR扩增结果分析

由图2可见，25个芒果正交试验处理的SRA-CR扩增结果存在着一定的差异。从2次重复试验的结果来看，、6、0、4、5、22号处理谱带少且不清晰，4、5、8、9、2、3与7号组合的谱[2]带清晰，亮度、重复性好。综合扩增条带的数目、强弱、清晰度、可分辩率与节约成本等指标，确定组合8号是比较理想的扩增模式体系，即25 μL反应体系中含30 ng DNA，03 μmol/L 引物，25 μL 2×Taq CR Master Mix。

23引物筛选

以随机选取的芒果DNA作模板，用00对引物进行CR扩增，从中选择扩增条带清晰、稳定且多态性高的适合芒果种质鉴定的引物进行正式扩增。根据扩增条带的多少、清晰度、稳定性和多态性高低，最终从所合成的00对引物中筛选出36对引物用于SRA扩增（表5）。

24SRA 优化体系在不同芒果种间的扩增

根据上述试验的优化结果，随机选取Me6与Em引物组合来对0份芒果种质的DNA进行扩增，以进一步验证该扩增反应体系的效果。由图3可以看出，引物Me6与Em不

但对0份芒果种质均能扩增出较好的条带，而且也存在着很明显[CM（25]的多态性条带，由此说明所优化的扩增体系比较可靠，适合芒果种质的SRA分析研究。

3结论与讨论

CR反应体系的优化方法主要有3种：单因素试验、均匀试验和正交试验优化。正交试验设计相对单因素试验而言具有试验次数较少、效用明确且能较快地获得极佳的试验结果的特点，避免了单一因素试验结果的不足。目前，正交试验设计已成功应用于枣、价廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反应体系优化[7]，但在芒果上还未曾见报道。本试验通过正交设计，对影响芒果SRA 反应体系的模板DNA含量、引物浓度、2×Taq CR Master Mix含量进行了优化，建立了适用于芒果的最优SRA反应体系，即25μL反应体系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同时，在00个引物组合中，共得到多态性引物组合36个。该反应体系及36个多态性引物组合可用于芒果种质遗传多样性分析、系统发育和育种应用等方面，同时也为芒果品种鉴定、亲缘关系分析及优良新品种的选育等提供技术参考。

影响SRA-CR反应的因素相对复杂，不同植物适应的SRA 反应体系不同，且各因素之间存在着相互效应，只有各因子之间的浓度配比达到最佳状态时才能得到稳定、可重复的扩增结果。因此，SRA标记应用到不同物种上时需要优化反应体系和条件。在芒果SRA 体系优化的过程中，发现DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物浓度等均会影响SRA扩增效果，但模板DNA含量对扩增无明显影响（20～60 ng 之间均有稳定的扩增），这与其他学者的研究结果相似[2，8-0]。可见，对芒果SRA 反应条件进行优化是非常必要的。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]

[ZK（#]Li G，Quiros C F Sequence-related amplified polymorpgism （SRA） a new marker system based on a simple CR reaction：its application to mapping and gene tagging in BrassicaTheoretical and Applied Genetics，200，03（2/3）：455-46

[2]郭凌飞，邹明宏，杜丽清，等 均匀设计优化澳洲坚果SRA反应体系 果树学报，2008，25（2）：250-253

[3]邱文武，孙伟生，窦美安 菠萝SRA反应体系的建立及优化 生物技术，2008，8（）：39-42

[4]韦金菊，何凡，范鸿雁，等 番木瓜DNA提取与SRA反应体系优化 中国南方果树，200，39（）：33-36

[5]何新华，李杨瑞，郭永泽，等 23个广西本地芒果品种的ISSR分析 分子植物育种，2005，3（6）：829-834

[6][2]Ahmad R，otter D，Southwick S M Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRA molecular markers ournal of the American Society for Horticultural Science，2004，29（2）：204-20

[7]杨祥燕，蔡元保，陈豪军，等 番石榴SRA反应体系的建立与正交优化 中国农学通报，20，27（22）：29-223

[8]Budak H，Shearman R C，armaksiz I，et al Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs，SSRs，RADs，and SRAs Theoretical and Applied Genetics，2004，09（2）：280-288

[9]刘冲，葛才林，任云英，等 SRA、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用 生物工程学报，2006，22（4）：657-66[ZK）]

筛选反应体系 第3篇

1 IRT的基本介绍

IRT是一系列心理统计学模型的总称。 美国心理测量学家Lord于1952 年提出著名的累积正态模型 (normal ogive model) 标志着IRT的正式诞生。 IRT对所测量的项目可以找到一条项目特征曲线 (ICC) , 通过被试者对项目的反应与其潜在特质之间的关系用一单调递增的项目反应函数来估计被试者的能力水平。 ICC是IRT的基础, 两个常用的参数 (区分度和难度) 决定了它的形状, 常为一条“S”型曲线, 见图1。 难度参数 (b, 也称阈值参数) 是指被试者按给定方向选择某个选项的概率为50%所对应的潜在能力点;难度参数越大, 被试者选择这个选项需要的能力就越大。区分度参数 (a) 是指难度参数对应的ICC曲线拐点的斜率。 区分度参数越大, 表示条目对不同潜在特质水平的人群有越高的区分能力。 三参数模型还可以估计伪机遇参数 (c) , 在考试中, c的估计可以提高能力估计的精度, 但在健康研究中, 估计c的意义不大, 反而增加了参数估计的复杂性。 对于多级记分模型, 不同模型的难度参数概念略有不同, 它们的原理都是将k个选项的条目分成 (k-1) 个二分类条目, 故有 (k-1) 个阈值参数。 在ICC的基础上, IRT还可以产生类别反应曲线 (CRCs) , 它表示每个反应选项在特定能力水平下被选择的概率, 因此, 每个选项都有一条相应的类别反应曲线, 如图2 为一个5 分类条目的CRCs, 若条目基于分部评分模型, 则相邻两个类别反应曲线的交点可作为这个条目的阈值参数。

IRT的另一个重要特征就是信息函数, 它是潜在能力 θ 的一个连续函数。 对具有同一能力 θ 的一组被试, 其能力估计值的标准误差越小, 估计值对真实值提供的信息量就越大, 当用极大似然法估计 θ 时, 估计量随样本量的增大而渐近正态分布, 则测验信息函数可以定义为能力估计值的方差的倒数, 即I (θ) =1/var (θ) 或者。 测验信息与测量误差是一一对应的, 信息量越大, 测量精度越高, 信息量最大值所对应的能力水平代表该条目所能最精确测量到的能力参数估计值。若记项目信息函数为Ii (θ) , n个条目的信息累加, 则可产生测验信息函数, 其数学表达式为。可见, 每个条目可以单独对量表总信息作贡献, 贡献量大小不受量表其它条目的影响, 因此可以为增加或者删除条目提供依据。

2 IRT在条目筛选中的应用

2.1 IRT模型的选择

IRT模型是建立在强假设的基础上, 若假设不成立, 则可能导致得到的结果不能很好地解释数据信息。 因此, 选择适当的模型是很重要的。 IRT有单维、多维的参数模型及非参数模型等多种模型, 由于后两种模型较复杂且应用少, 本文主要介绍单维的参数模型[3,4]。 选择模型时, 需要考虑条目的选项个数、模型参数及参数是否受到限制等问题, 表1 总结了8 种模型的主要特征。

注:*表示Rasch族模型;a:区分度参数;b:难度参数;c:伪机遇参数;k:选项个数

目前IRT的参数估计方法很多, 大多数方法是以极大似然估计法和Bayes估计法为基础, 其中极大似然估计法的应用最广泛。 目前对于PCM、GPCM、GRM等模型的选择没有明确的标准, 主要根据个人的偏好或者对软件的熟悉程度选择其中一个模型。 比如Rumm、Parscale、Winsteps等软件可用于PCM的估计, 而Multilog软件多用于GRM的估计。

2.2 评价IRT模型的拟合情况

2.2.1 考察模型假设IRT的应用有两个基本的假设[3]:单维性和局部独立性。 前提假设满足的程度越高, 越能体现IRT模型应用的有效性。1单维性是指量表或者子量表中的每个条目测量的都是同一种潜在特质, 如躁狂人格量表主要测量患者的躁狂水平。 实际上任何量表都不可能是严格单维性, 而是指在被试者反应的所有因子中仅有一个因子占主导地位, 且是感兴趣的因子。 目前检验的方法主要有4 种:探索性因子分析, 是最常用的一种方法[5];证实性因子分析;残差主成分分析[6];平行分析。 这些方法可以单独使用, 也可以联合使用。2局部独立性是指具有同一能力水平的被试者对量表中的每个条目的反应都只受其能力的影响, 而独立于其他条目的反应。 目前检验的方法主要有 χ2检验和残差相关分析[7]。 实际上, 局部独立性与单维性是相关联的, 只有基于单一潜在特质变量的项目反应是局部独立的, 这个数据才是单维的[3]。 3若条目在不同群体 (如性别) 中表现的特性不同, 则单维性假设也可能不满足。 因此还需要检测条目的项目功能差异 (DIF) , 以保证条目内容在不同群体中的等价性。 在生存质量研究中, DIF是指具有不同的文化背景和生活经历但具有相同生存质量 (能力) 的不同群体 (比如性别) 对同一条目的理解和反应不同[8]。DIF分析在教育、心理测量和生存质量研究中已得到广泛的应用。 目前分析DIF的方法很多, 如STAND、SIBTEST、Mantel-Haenszel、Logistic回归、基于IRT的方法 (MIMIC、DFIT、IRTLRDIF、TESTGRAF) [8]等。

2.2.2 模型-数据的拟合优度检验对于模型-数据的整体拟合, 不同的软件提供不同的拟合指标。 多数软件是对观察分数与模型预测值之间的分布进行 χ2检验。 如BIOLOG、MULTILOG及PARSCALE等的拟合统计量主要是 χ2统计量 (-2 倍的对数似然函数) [9];Rumm软件提供条目特质 χ2拟合统计量 (item-traitinteraction statistic) ;也有研究认为对于同一条目的每个类别, 观察频率与模型概率的差异小于0.02, 便可认为模型与数据是拟合的[10]。 对于条目 (个体) -模型的拟合, 一般是通过拟合残差 (所有被试者对某一条目反应得分的标准化残差之和) 评价条目水平上单维模型的拟合情况。目前很多IRT软件都提供不同的拟合指标, 如Rumm提供条目拟合残差;Winsteps提供Infit均方和Outfit均方;IRTFIT还可以针对上述8 种模型通过G2和 χ2判断每个条目的拟合情况[11]。 此外, 很多IRT软件还提供个体拟合残差, 从个体水平上评价个体反应模式与模型预测模式的一致性。

2.3 条目筛选和评价指标

根据Edelen等[12]和Meads等[13]的研究, 目前基于IRT的条目筛选指标主要有:1区分度参数 (a) , a太小说明条目对被试者的能力估计提供的信息量太少;2根据类别反应曲线 (CRCs) 和难度参数判断条目是否存在逆反阈值 (reversed thresholds) 、条目选项的有效性及条目的难度范围是否合适;3个体-条目图, 将条目难度和个体潜在特性反应在同一尺度上, 用于考察条目测量被试者能力的范围及条目是否足够或者出现冗余等情况;4条目对模型的拟合情况;5条目信息量及信息曲线, 选择信息量大和覆盖能力范围广的条目, 通过信息曲线可以判断条目冗余的情况;6条目在不同群体上的功能差异分析。 不同的模型提供不同的指标, 因此不是所有模型都提供上述6 种指标, 比如分部评分模型不提供区分度参数, 等级反应模型不提供个体条目图等。 对于量表的编制或者修订, 应该根据选定的模型选择相应的筛选指标, 删除某些不符合要求的条目后, 再对剩余条目进行重新评价, 直至所有条目都满足要求为止。 对于较成熟的量表, 除考虑上述指标外, 还可以用其他方法考察量表简化的情况。 Bjorner等[14]根据简明量表的条目构建评分算法预测原始量表的总分, 评价预测分与原始分的关系。

3 样本量

大多数应用IRT的文献都没有对样本量有明确的说明, 样本量的多少是否会影响IRT模型的应用呢? 根据国外文献, 模型越复杂, 需要的样本量越大。Linacre[15]认为, 要保证Rasch模型参数估计的稳定性, 至少需要100 名被试者。 对于拥有两个及以上参数的模型, 如等级反应模型至少需要250 人, 但为了更精确的估计参数, 样本量为500 人较为合适[3]。 样本量越大, 条目参数估计对应的标准误越小, 测量也越精确。 如果IRT是用于条目池的项目分析, 则需要的样本量较大, 而若是用于成熟量表条目特性的评价, 则需要的样本量较小[12]。 此外, 数据满足IRT模型假设的程度越好, 需要的样本量越小[9]。

4 展望

随着生存质量和患者报告结局的不断发展, 人群健康评价、患者生存质量监测、患者筛选 (如抑郁患者) 等研究需要越来越多的量表, IRT的引入为这些量表的发展及简化提供了有力的工具。然而IRT的引入并不意味着要摒弃经典测量理论。 经典测量理论主要从宏观的角度评价量表, 而IRT则从微观的角度分析每个条目, 两种理论相辅相成, 互相补充, 将两者有机融合能使最终量表具有更好的信度和效度。 随着IRT在生存质量量表研究中的应用的不断增多, 其自身的某些缺陷也逐渐突现, 如IRT是建立在比较复杂的数学模型上, 理解比较困难, 依赖较强的假设。在健康结局测量研究中, 多数量表由多个方面组成, 很少只测量单一的能力, 因此IRT的单维性假设在健康研究中很难实现。 若分维度来分析多维度量表, 单维性的问题解决了, 但在每个维度包含的条目数很少的情况下会增大测量误差, 且没有考虑多维度之间的相关性, 致使测量结果准确性下降。 为解决这些问题, 国外研究者开始向多维IRT模型 (MIRT) 和非参数IRT模型 (NIRT) 发展, 探讨它们在健康研究中的应用, 不同模型之间的比较以及不同模型对样本量的要求等问题。 本文的研究目的是介绍基本的IRT方法, 鼓励更多的研究者应用IRT去发展和修订量表, 感兴趣的研究者也可以从上述方面更深入的研究IRT, 拓展IRT在国内的发展。

摘要：本文着重介绍项目反应理论 (IRT) 的基本特征及其在医学量表编制和修订中的具体应用。IRT具有项目参数不变性, 可以为条目和量表提供信息量及不同潜在能力对应的测量信度。因此, IRT主要从项目参数、项目特征曲线、个体-条目图、条目对模型的拟合情况、条目信息量、条目在不同群体上的项目功能差异等方面判断条目的 优劣。

共性技术筛选指标体系及模型研究 第4篇

关键词：共性技术,设计原则,指标体系,筛选模型

1 引言

共性技术是指在产业领域、不同行业或不同区域能够广泛共享应用, 对经济和社会发展产生普遍推动作用的技术。筛选标准是指具体实施共性技术评价筛选工作的技术、手段和工具。

由于共性技术的研发可能存在着“市场失灵”、“组织失灵”、“政府干预失灵”三重失灵现象[1], 使得共性技术的供给严重不足。但是, 在当前我国建设创新型国家, 产业结构全面调整的背景下, 共性技术的研究开发与应用又显得十分重要。2007年12月29日修订通过的《科学技术进步法》第六十条将“重大共性关键技术研究与应用” 规定为财政性科学技术资金应当投入的主要事项之一。然而, 目前无论在科技管理理论上还是科技管理实践工作中, 既缺乏从众多技术中筛选出共性技术的制度规范, 也缺乏共性技术的鉴别与筛选标准, 从而有可能使得新的《科学技术进步法》第六十条的可操作性大打折扣。因此, 有必要按照新的《科学技术进步法》规定的“科学技术评价制度应当根据不同科学技术活动的特点, 按照公平、公正、公开的原则, 实行分类评价”的精神, 建立一套科学、实用的共性技术筛选指标体系及其模型, 以服务于科技管理实际工作。

2 共性技术筛选指标体系设计原则

(1) 科学性原则。

科学性是建立筛选指标体系的前提和基础。选取的指标应科学合理、具有先进性, 能真实有效地反应共性技术的特征和水平。

(2) 系统性原则。

指标体系应能全面地反映共性技术的综合情况, 从中抓住主要因素, 能反映共性技术的本质属性, 以保证综合评价的全面性和可信度。

(3) 可测性原则。

可测性原则要求选取的指标应涵义明确, 数据资料收集方便, 计算简单, 易于掌握。

(4) 定性分析与定量分析结合原则。

共性技术筛选指标体系的设计是一个全新的问题, 没有成熟的模型可供参考, 而共性技术的特点也并非完全可以定量化处理, 为了进行综合评价, 必须将部分反映共性技术基本特点的定性指标定量化、规范化, 为采用定量评价方法打下基础。

(5) 层次性原则。

指标体系涉及多方面因素, 既要符合客观逻辑, 又要符合主观思维程序, 因此, 指标设计要有层次性, 这为衡量共性技术的效果和确定指标权重提供方便。

(6) 无相关性原则。

指标体系设计过程中要避免显见的包含关系, 对隐含的相关关系, 要在模型中以适当的方法消除。

3 共性技术指标体系结构设计

一般来讲, 对系统进行评价需从技术、经济、社会影响和环境等方面去综合考虑。筛选指标的选取是一个受到多种因素、过程和参与者影响的复杂现象。每一种视角都代表了一种不同的观点, 吸纳了特定的核心因素。共性技术由于其应用的广泛性, 种类繁多, 指标体系的设计不能用一个固定的模式, 在实际操作中, 应视具体情况而定。依据筛选模型构建的理论与实践基础, 遵循共性技术筛选指标的设计原则, 本文对共性技术筛选指标体系的层次结构进行了探索, 如图1所示, 包括技术的共性程度、技术水平与性能、经济效益与社会效益等三个准则, 即为准则层。

3.1 技术的共性程度

技术的共性程度是指在产业领域、不同行业或不同区域能够广泛共享应用程度, 可以用基础性、共享性和规范性三个指标来描述。

3.1.1 基础性。

基础性是指共性技术为后续开发提供基本的手段和技术支持, 为后续技术的推广应用提供技术基础。共性技术研究开发一般介于基础研究和应用开发研究之间, 只有在共性技术得到较为成功的解决后, 才能进一步推动其他技术的发展, 实现产品工艺上的创新。因此, 基础性是判断一项技术能否成为共性技术的一个非常重要的衡量指标。

3.1.2 通用性。

技术通用性是指技术在不同行业、不同领域以及不同地域通用的程度, 一般来讲, 一项技术如果能在各个行业、各类环境要素、各个地区适用, 则其通用性越强, 应优先选取通用性强的技术。

3.1.3 规范性。

规范性是指技术操作中的规范程度以及大规模推广的可行性。技术规范与否是判断共性技术的重要因素之一。

3.2 技术水平与性能

技术水平是指技术在科技发展过程中所表现出来的一些特性;技术性能是指完成特定功能所具备的能力, 包括产品功能、制造和运行状况在内的一切性能。我们使用先进性、安全性、开发性、技术可靠性来指标衡量技术的水平与性能。

3.2.1 先进性。

先进性是指一种技术相对于其他技术所具有的长处和优势, 诸如更具有独创性, 创新性等。从某种意义上可以说:最终级的竞争是技术先进性的竞争。因此将先进性作为衡量共性技术综合评价的一个指标。

3.2.2 安全性。

安全性是指技术为经济、社会、环境等方面利益服务的程度, 是否有危害国家、社会、环境安全的危险性以及其本身研发、操作、推广等方面是否安全。将安全性作为衡量技术水平的指标之一, 是因为在综合评价技术时, 不应局限于技术本身的特性, 还应考虑技术对外界的影响。

3.2.3 开发性。

开发性是指将科学知识应用于生产或其他社会实践的创造性活动。一种技术越被采用, 它就被用得越多, 对它的了解也就越多, 因此它就被开发和改进, 这反映了技术的网络延伸作用。共性技术具有广阔的适用性和开放性, 其应用范围越广、使用者越多, 技术的共性就越强。

3.2.4 技术可靠性。

技术可靠性是指技术在研发、运行、推广、应用各方面的可靠程度。共性技术是一类技术服务对象众多的技术, 关联层次多、超前性强、难度大, “三重失灵”现象同时存在, 因此技术可靠性与否意义重大, 是一个重要的衡量指标。

3.3 经济效益与社会效益

3.3.1 产业发展需要度。

产业发展需要度是指产业对技术需要的紧迫度以及需要的数量。共性技术涉及范围广, 既包括产业间的共性技术、也包括产业内和特定企业内的共性技术, 从影响来看, 产业间的共性技术为多个产业提供技术平台, 可在不同的产业内扩散, 对产业发展有着相对重要的作用。

3.3.2 科技投入水平。

科技投入水平是指研究开发每个阶段的支出, 按支出类别可以分为:人员费用、设备费用等等。

3.3.3 经济效益。

经济效益包括直接经济效益和间接经济效益。直接经济效益是指在既定年份, 可以归结为科技商业化的新产品和改善了的产品或工艺的销售收入, 即有关科技成果经过商业化转化, 已经整合到新产品、新工艺或现有产品或工艺的销售收入。间接经济效益是科技活动所产生的技术影响所创造的间接利润, 即对那些有益于经济发展的事物的度量。

3.3.4 社会效益。

社会效益是一个综合度量指标, 它是指科技成果和社会指标之间发生在宏观层次上的紧密联系, 即对社会状况的度量, 包括科技对国家的教育、社会以及知识进步等所产生的显著影响。

4 共性技术筛选模型设计

图1给出的模型中, 对于不同的共性技术选定常用指标和选用指标, 构成评价因素集, 并构造筛选指标体系层次结构图。在共性技术筛选指标体系研究的基础上, 根据筛选工作的系统性、科学性、动态性、可操作性和定性分析与定量分析相结合的原则, 选用模糊综合评价方法构建共性技术筛选模型。

4.1 建立筛选专家组

由于共性技术的多样性, 对不同的共性技术需要采用不同的专家组。为了能准确反映专家的意见, 专家组一般由技术领域专家、高层管理人员和用户组成。专家组组成后, 根据实际需要确定评语集。假设对技术进行五级划分, “一级”为技术的共性最高, “五级”为技术的共性最低, 则其评语集为V= (1, 2, 3, 4, 5) = (v1, v2, v3, v4, v5) 。

4.2 确定指标权重

为确定指标权重, 需请技术领域专家进行评定, 可采用AHP方法构造判断矩阵并进行一致性检验, 满足要求后对几位专家的判断矩阵进行综合, 得到综合判断矩阵, 其步骤如下:

4.2.1 专家组成员对各层次指标重要程度给出判定。

根据指标体系结构设计调查表, 向专家组中领域专家发放调查表, 请各位专家对该技术筛选指标体系各层次指标间的相互重要程度给出判定。

4.2.2 构造判断矩阵。

AHP用两两比较法构造判断矩阵, 采用1～9比例标度[2]来反映人的判断能力。设A表示目标, U表示筛选指标集, ui表示筛选指标, ui∈U (i=1, 2, , n) 。uij表示ui对uj的相对重要性数值 (j=1, 2, , n) 。在图1的筛选指标体系层次结构图中, n=11。

4.2.3 计算单一准则重要性排序。

采用几何平均法求出矩阵U的最大特征根λmax所对应的特征向量, 并正规化处理, 所求特征向量即为各评价指标重要性排序, 也就是权数分配[2]。其公式为

undefined

式中, i, , j=1, 2, , n, 则W= (W1, W2, , Wn) T即为所求特征向量 (也就是权数分配) 。

4.2.4 一致性检验。

定义:设U为n阶矩阵, uij为U中元素, 若对任意1in, 1jn, 矩阵U的元素具有传递性, 即满足等式:uijujk=uik, 则称U为一致性矩阵。一致性检验采用如下公式[2]

CR=CI/RI (2)

式中, CR称为判断矩阵的随机一致性比率;CI称为判断矩阵的一般一致性指标;RI称为判断矩阵的平均随机一致性指标[2], 由式 ( 3 ) 给出

CI= (λmax-n) / (n-1) (3)

式中, n为判断矩阵的阶数。当CR<0.10时, 即认为判断矩阵具有满意的一致性, 说明权数分配是合理的;否则需调整判断矩阵, 直到达到满意的一致性为止。

计算CR必须先求出λmax

undefined

4.2.5 计算综合权重排序。

由4.2.3算出的是准则层和方案层各指标的权重分配, 而方案层、准则层相对于总目标层的权重分配计算为

undefined

WBj为Bj相对于A的重要性权值, WCij为Cij相对于Bj的重要性权值;当Bj与Cij没有联系时, WCij=0。

4.3 确定指标隶属度

一项技术, 对其进行筛选时, 技术领域专家、高层管理人员 (决策者) 和用户一起根据所确定的评语集对其筛选指标进行评价, 评价结果用隶属度矩阵R表示

R= (rij) ml

在矩阵R中rij表示在第i个筛选指标上, 对它第j等级评定的人数占全部专家组人数的百分比, 即:rij=dij/D, dij表示第i个筛选指标上, 对它作出第j等级评定的人数, D表示全部专家组人数。m为指标数, l为评定等级数。

4.4 计算评价值

在隶属度矩阵R获得后, 计算技术的综合评价向量S。为了在模糊综合评价中, 能适当兼顾各因素, 并保留单因素评价中的全部信息, 采用综合评判的加权平均型M (., +) 模型, 可以获得较好的效果, 即

S=WacR

式中:Wundefined为方案层指标C对目标层目标A的综合权重。为评出技术中的共性高低, 在对应的评语集V= (1, 2, 3, 4, 5) = (v1, v2, v3, v4, v5) 中, 就可以利用下面的共性技术筛选模型:

P=VST (6)

求得评价值。求出的评价值表示被评价技术的等级值, 评价值越低, 说明技术的共性越高, 反之, 说明技术的共性越低, 在筛选共性技术时, 优先选取评价值低的技术, 由此可以实现对共性技术的筛选。

共性技术筛选是一个动态过程, 其指标可能会随着经济技术发展水平、评价时间等的不同而发生变化, 指标及权重的调整是必要的。本文所提出的共性技术筛选指标层次结构图具有一定的代表性, 有利于理解筛选模型的建立和综合评价计算, 有一定的实际意义。

评价指标建立后, 运用模糊综合评价方法, 共性技术评价中的难点之一是判断矩阵的构造, 判断矩阵是由有经验的决策者和技术领域专家给定。但是由于人的判断上存在误差, 特别在复杂的情况下, 判断矩阵有可能不一致, 故需进行调整, 进行一致性检验。判断矩阵一致性调整的方法很多, 但人为误差仍然存在。对于关系到国家或地区经济发展水平的重大共性关键技术, 需要定期或不定期滚动评价, 并且要求评价结果能够有效地反映其真值。

参考文献

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陆丰油田新型泡沫体系的筛选与评价 第5篇

泡沫驱油技术利用空气加起泡剂经气液接触后在外力的作用下产生泡沫, 创造性地将空气驱和泡沫驱两种提高采收率方式有机地结合起来, 对提高油藏采收率则具有重要的意义[2]。泡沫驱用泡沫剂作为调剖剂, 空气作为驱油剂, 本着“边调边驱”的原则, 具有调剖和驱油的双重功能, 克服了空气驱“气窜”的缺点, 既能提高油层的波及系数, 又能提高其驱油效率, 增加可采储量。该技术把空气作为泡沫和气驱的一种气体资源, 来源充分, 取之不尽, 并且综合成本低, 具有较强的实际应用价值[3,4,5]。

本文主要对泡沫中的泡沫体系进行了筛选, 筛选出适合于陆丰油田地层温度, 压力和矿化度条件下的起泡体系, 并在地层温度, 压力和矿化度条件下对体系的起泡性和泡沫稳定性进行了评价, 并且通过物理模拟实验对体系的驱油效率进行了评价。

1 泡沫体系的筛选

在地层温度90℃, 矿化度20×104mg/L的条件下, 使用Waring Blender法分别对多种阴离子, 阳离子, 阴非离子和非离子型的表面活性剂的起泡性和析液半衰期进行评价, 然后筛选出性能较好的几种, 用模拟地层水配置成溶液通过抗老化实验再次进行筛选。

1.1 起泡剂的优选

阴离子型的表面活性剂含有解离后产生阴离子的基团如羧酸基-COOH、碘酸基-SO3H等;阳离子型含有解离后产生阳离子的基团如季铵基等。两性离子型同时含有以上两类基团;非离子型不含可解离基团。

由实验可以看出, 阴离子的表活剂普遍存在着抗盐性较差的弱点, 而考虑到阳离子型的表面活性剂虽然具有良好的抗盐性, 但是地层的吸附量较大, 因此选择了三种阴非离子型的表面活性剂CY-1, NB 95和CHS来进行下一步的实验[6,7]。

1.2 抗老化实验

在地层温度90℃和120℃, 矿化度20×104mg/L条件下, 分别对浓度为0.2%的CHS, CY-1和NB 95三种表面活性剂进行了二十天的抗老化实验, 筛选出起泡性和稳定性最好的起泡体系。实验结果如图3和图4。

由图3、图4数据可以看出, 在90℃的地层温度条件下, 随着老化时间的增加, 三种起泡体系的起泡体积并未受到太大的影响, 而对于半衰期, NB 95在一定程度上有所下降, 但是下降的幅度不大, 相反CY-1和CHS的下降幅度相对较大。

在地层温度问120℃的条件下, CY-1基本完全丧失了起泡能力, 因此只对NB 95和CHS进行了评价。由图5和图6可以看出, 不论是起泡体积和半衰期, NB 95的起泡性和稳定性都明显要好于CHS。因此选择NB 95作为起泡体系来进行后续的实验。

2 泡沫体系性能的评价

2.1 可视化实验

可视化实验是在此前模拟地层温度和矿化度的条件的前提下, 再加入地层压力的影响对起泡体系的起泡性和稳定性进行直观的观测。实验设备图7~图9。

(1) 温度:选取90℃和120℃两个油藏温度进行实验;

(2) 矿化度:20×104mg/L;

(3) 起泡剂:由实验室配置NB 95气泡体系, 选取质量浓度0.2%;

(4) 压力:选取5, 10, 15, 20 MPa四个压力进行实验。

在压力较小的情况下, NB 95能够保持较为良好的起泡性, 随着压力的升高, 泡沫的体积在一定程度上有下降, 而单个泡沫的体积却在增大。这可能是因为当压力升高时, 一些小泡沫由于内外压力的不平衡导致许多小泡沫破裂从而形成较大的泡沫, 而由于体系拥有较好的泡沫稳定性, 因此较大的泡沫能够在较高的压力环境中保持稳定。

当把压力增加到15 MPa和20 MPa的时候, 可以看到, NB 95仍然能够保持很好的起泡性能。配合体系注入地层时产生的剪切作用, NB 95能够很好在地层里保持良好的起泡性和泡沫稳定性。

2.2 长期抗老化实验

在矿化度为20×104mg/L的条件下, 降浓度为0.15%, 0.2%和0.25%的NB 95分别放入90℃和120℃的环境中长达84天, 分别测试N 95体系的起泡性和泡沫稳定性。实验结果如图12和图13。

从图12、图13数据可以看出:在90℃和矿化度20×104mg/L的条件环境下, 0.15%、0.2%和0.25%的NB 95均能保持良好半衰期和气泡体积。由此可见NB 95具有良好的抗温抗盐性能。但是, 浓度为0.2%和0.25%的体系的半衰期波动幅度较大, 这可能是因为少量的体系与溶液中的离子发生了反应, 形成了沉淀, 从而影响了体系生成泡沫的稳定性。

当温度为120℃的时候, 我们可以看到, 体系的起泡性和稳定性就有了很大幅度的变化, 在第70~77天的时候, 各个浓度的体系, 无论是起泡体积和半衰期都呈现出跳水式的变化, 体系几乎没有任何气泡效果, 见图14和图15, 而半衰期基本都只能以秒来计算。值得注意的是, 当抗老化实验进行到第35天的时候, 在120℃环境下的样品的开始出现沉淀, 体系变为黄色, 并且随着浓度的增加, 颜色逐渐变深, 见图16。这是因为, 溶液中的表面活性剂与各种离子发生了反应, 形成了黄色沉淀, 导致表面活性剂的活性的失效。但相比之下, 浓度为0.25%的体系的性能较好, 因此可以考虑选择提高体系浓度来增加体系的抗老化性[7]。

在对体系的起泡性和泡沫稳定性进行评价后发现, 90℃环境下的样品的起泡性和泡沫稳定性并没有太大的变化, 相反对于120℃环境下的样品, 体系浓度为0.15%和0.2%的样品已经不再具有起泡性, 但是浓度为0.25%的样品在具有良好的起泡性的同时, 也依然具有了很强的泡沫稳定性, 见图17和图18。因此可以总结出, 在地层温度为90℃, 矿化度为20×104mg/L的地层环境中, 可以将起泡体系的浓度定为0.2%, 但是如果温度高达120℃, 则需要将体系的浓度调整为0.25%。

3 泡沫驱油模拟实验

针对陆丰油田选定某一区块原油进行注泡沫实验, 通过设计正交实验从而得到不同气液比对原油采收率的影响。

3.1 实验条件

(1) 温度:选取90℃和120℃两个油藏温度进行实验;

(2) 水样:根据现场地层资料, 模拟陆丰油田某区块地层水, 矿化度:20×104mg/L;

(3) 油样:现场提取陆丰油田某区块油样一个;

(4) 起泡剂:由实验室配置NB 95气泡体系, 选取质量浓度0.2%;

(5) 气液比:选取1∶1、2∶1、3∶1三个气液比进行实验;

(6) 渗透率:选择100 m D, 200 m D和300 m D三个渗透率进行实验。

3.2 驱油数据分析

由图19可以看出, 随着气液比的增加, 原油的采收率呈上升趋势, 但是变化不明显, 这是因为从上表可以看出, 这是因为岩心较为均质, 因此其水驱采收率已经达到了比较好的程度, 因此通过泡沫驱油提高采收率幅度不够大, 当渗透率为100 m D的时候, 气液比2∶1时的驱油效率最小;渗透率为200 m D的时候, 气液比为1∶1时的驱油效率最小;渗透率为300 m D的时候, 气液比为1∶1时的驱油效率最小;由此可以看出, 气液比对采收率的影响不是十分的明显。而从图中还可以看出, 随着渗透率的增加, 原油的采收率呈下降的趋势, 这是因为随着渗透率的增加, 注入岩心中的气体和体系较难形成稳定的泡沫, 有效地起到封堵作用, 因此不能有效地改善油水剖面, 从而导致提高采收率的幅度不够高。而渗透率300 m D的时候, 由图19可以看出, 三种气液比的原油采收率的值基本相近, 因为可以看出, 随着渗透率的增加, 气液比对原油的提高采收率程度的影响是呈下降的趋势[8,9,10]。

4 结论

(1) 对多种表面活性剂的起泡性和泡沫稳定性进行评估, 筛选出一种抗温抗盐的表面活性剂NB 95。

(2) 使用可视化模型对NB 95在陆丰油田地层温度矿化度和压力条件下的气泡情况进行观察, 实验结果证明在温度为90℃, 矿化度为20×104mg/L, 压力为4~20 MPa的条件下依然具有良好的起泡性。

(3) 对不同浓度的NB 95体系在地层温度矿化度压力条件下进行了老化实验。实验证明浓度为0.15%, 0.2%和0.25%的NB 95体系在90天后依然具有良好的起泡性和泡沫稳定性。

(4) 针对不同气液比的情况下对陆丰油田油藏条件下进行了泡沫的物理模拟实验。实验可以看出:岩心在水驱之后, 泡沫可以有效的使后续的注入水发生一定的程度的转向, 较大程度的提高驱油效率。提高幅度分别为17.5%和22.7%, 封堵效果明显。但是不同气液比对驱替效率的影响是不同的。

摘要：针对陆丰油田的油藏特征, 筛选出适合于陆丰油田地层温度, 压力和矿化度条件下的起泡体系, 并在温度为90℃和120℃, 压力为520 MPa, 和矿化度为20×104mg/L的条件下对体系的起泡性和泡沫稳定性进行了评价, 并通过可视化模具, 对高温高压环境下泡沫的生成情况进行了直观的观察, 通过物理模拟实验, 在不同注入量的条件下, 对体系的驱油效率进行了评价。

关键词：泡沫,表面活性剂,高温高盐,可视化

参考文献

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[9]刁素.高温高盐泡沫体系及其性能研究[D].成都:西南石油大学硕士论文, 2006.

筛选反应体系 第6篇

绝大多数的肿瘤患者死于肿瘤转移[1]。肿瘤转移是一个多因素、多分子参与、多步骤的复杂过程,发现新的调控分子和信号转导途径,阐明肿瘤转移的分子机制,对于药物研发,进而提高患者生存率和改善患者生活质量具有重要意义。

RNAi作为基因沉默有效且容易量化的方法,能够提供各个基因与其功能缺失表型之间直接的因果联系,可以直接发现人类基因功能。以大规模RNAi基因沉默技术为核心的高通量筛选已经成为寻找新的调控分子重要手段[2,3,4]。

xCelligence RTCA是新型的实时细胞分析系统,其中RTCA-DP主要用于检测及分析监测细胞迁移和侵润过程。该系统配套的CIM-Plate-16与TranswellTM结构相似,但是其聚碳脂膜背面嵌入了微金电极阵列,用以构建实时、连续、定量跟踪细胞形态和数目改变的细胞阻抗测试传感器,细胞穿过聚碳脂膜后在其背面的微电极表面贴壁生长,可引起贴壁电极界面阻抗的改变,获得细胞指数变化曲线图,能够客观的反映细胞的迁移能力的[5]。

这里将xCelligence RTCA新技术和RNAi技术相结合,选择高转移性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为靶细胞,以实验室前期确证能促进乳腺癌转移的Gankyrin[6]作为靶分子,采用传统的TranswellTM体外迁移实验作为平行对照,初步确定了这种实时无标记RNAi筛选技术体系用于肿瘤细胞迁移筛选可行性和可靠性,该体系的应用有助于发现肿瘤转移信号通路中新的调控分子,揭示肿瘤转移的分子机制,还将为肿瘤转移的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和siRNA

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231由本实验室保存。Control siRNA(20 nmal)和Gankyrin siRNA(20 nmal)由Invitrogen公司合成。

1.1.2 主要试剂和仪器

Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)购自Invitrogen公司。胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司。聚碳脂膜Transwell小室(6.5 mm直径, 8 μm孔径)购自Corning Costar公司。Lipofectamine RNAi Max 购自Invitrogen公司。Western Blot电泳成套设备购自Bio-Rad公司。PVDF膜购自GE Healthcare公司。Anti-Gankyrin抗体购自Santa Cruz Biotech公司,anti-β-Actin 抗体购自Cell Signaling Technology 公司。辣根过氧化酶标记二抗购自Jakson公司。ECL显影试剂购于威格拉斯公司。xCELLigence 实时细胞分析系统(Real-Time Cell Analysis System, RTCA)和CIM-Plate-16由杭州艾森生物有限公司提供。

1.2 细胞培养与siRNA转染

MDA-MB-231乳腺癌细胞用DMEM完全培养基(DMEM+10% FBS+0.1% 青/链霉素),置于37 ℃,5% CO2的培养箱中培养。siRNA 转染前24 h将MDA-MB-231细胞接种于6孔板,约40%的细胞密度。随机选三个孔作为干涉对照组,另外三个孔作为干涉Gankyrin组。每孔转入相应siRNA 2 μL,RNAi Max按1∶500稀释使用,转染方法参照RNAi Max说明书。

1.3 Transwell体外迁移实验

(1)转染后36

h,将6孔板中的培养基更换为含0.5%FBS的DMEM培养基。12 h后,干涉对照组和干涉Gankyrin组各随机选两个孔,消化细胞,用FBS的DMEM培养基重悬,进行细胞计数,Control siRNA组和Gankyrin siRNA组分别配制密度为40 000 cells/100 μL和60 000 cells/100 μL的细胞悬液。

(2)取4个Transwell小室放入24孔板中,上下室分别加100

μL和500 μL无FBS的DMEM培养基,放入培养箱中平衡1 h。接种细胞前,逐一取出TranswellTM小室,将下室培养基更换为500 μL DMEM完全培养基,放回原来位置。取1.3(1)中制备好的细胞悬液100 μL,缓缓加入对应Transwell小室的上室中,置于37 ℃,5% CO2的培养箱中培养。16 h后,取出小室,PBS洗两次,用棉签小心擦去聚碳酯膜上侧的细胞,4%多聚甲醛固定10 min,0.5%结晶紫溶液染色5 min。激光扫描共聚焦显微镜下观察,随机挑选四个视野计数并统计。

1.4 xCelligence RTCA细胞迁移实验

(1)在CIM-Plate16下室各孔中加入DMEM完全培养基165 μL,借助夹具将上室和下室组装为一体,在上室中加入30 μL无FBS的 DMEM培养基,放入37 ℃,5% CO2的培养箱中平衡1 h。将平衡好的CIM-Plate16置于RTCA DP Analyzer上,进行基线检测后取回。

(2)将1.3(1)中制备好的细胞悬液再次混匀,按照实验设计(见图1),在上室各孔中加入相应的细胞悬液100 μL,每组设4个平行对照孔。加好细胞悬液的CIM-Plate16在超净台中室温放置30 min,置于培养箱中的RTCA Station上,开始监测细胞迁移过程,每15 min检测一次,共监测24 h。

1:Control siRNA 2:Gankyrin siRNA

1.5 Western Blot检测干涉效果

在完成1.3(1)后,Control siRNA组和 Gankyrin siRNA组在6孔板中各剩一个孔的细胞。将6孔板置于冰上,弃掉培养基,PBS洗两遍,加入100 μL M2 Lysis Buffer,冰上裂解15 min,10 000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清5 μL进行蛋白质浓度定量。分别取等量的两组样品加入相应等体积的2loading buffer中,沸水浴10 min使蛋白变性,样品冷却到室温后,加到12% SDS-PAGE 胶加样孔内,并加入标准分子量蛋白Marker;上层浓缩胶恒压80 V,下层分离胶恒压120 V;PVDF膜进行蛋白质转印,恒流250 mA,2 h;5%的脱脂奶粉封闭1 h;Gankyrin抗体4 ℃孵育过夜,β-Actin抗体室温孵育1 h,相应二抗室温孵育1 h;ECL 显色,经过显影和定影后观察目的蛋白质条带。

1.6 统计学分析

应用SPSS 13. 0 软件处理数据,数据以均数±标准差表示,采用t检验进行统计学分析,以p<0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 Ganyrin瞬时干涉效果检测

将干涉Gankyrin组和干涉Control组的MDA-MB-231细胞分别裂解并定量,以β-Actin做为内参,进行Western Blot分析,可见转染Gankyrin siRNA 的MDA-MB-231细胞,其Gankyrin的表达水平明显低于对照组,Gankyrin瞬时干涉有效,结果见图2。

2.2 Transwell体外迁移实验

Transwell结果表明,若上室中接种60 000个细胞,在MDA-MB-231乳腺癌细胞中敲低Gankyrin,其穿入下室的细胞数(101.5±14.8)明显少于对照组(157.0±15.6),差别有统计学意义(p<0.05);若上室接种40 000个细胞,干涉Gankyrin组的MDA-MB-231细胞穿入下室的细胞数(79.0±7.9)与干涉Control组(116.0±15.8)相比,有显著差异(p<0.05)。结果见图3。

2.3 xCelligence RTCA DP细胞迁移实验

在CIM-Plate16上室接种两种密度的细胞,敲低Gankyrin的MDA-MB-231乳腺癌细胞在xCelligence RTCA DP上测得的标准化细胞指数(Normolized Cell Index,CI)均显著低于相应密度的Control siRNA组,说明干涉Gankyrin后MDA-MB-231细胞的迁移能力降低,与同期平行对照Transwell实验结果一致。高密度组(60 000cells /100 μL)Gankyin siRNA和Control siRNA MDA-MB-231细胞的CI值明显高于低密度组(40 000cells /100 μL)的相应细胞,说明高密度组穿过聚碳酯膜发生迁移的细胞数目高于低密度组细胞。

3 讨论

传统测定细胞体外迁移能力的方法主要有两种: 一种是划痕法, 一种是TranswellTM法。此前有研究将RNAi技术与划痕法结合来开展细胞迁移筛选工作[7],但是划痕法的缺点是无法模拟细胞三维穿越周围组织,而且没有较好定量测定方法。若将TranswellTM方法用于细胞迁移的筛选,有以下不足:操作繁复,工作量大,无法实现高通量;采用终点检测法,实验终点时间不好选择;染色后计数,主观偏倚较大。

本研究将实时无标记的xCELLigence细胞分析系统和RNA干扰技术结合,旨在建立一套可靠可行的肿瘤细胞迁移筛选技术体系。早期研究显示,电阻监测可以无浸润、连续监测细胞动态变化过程[8], 比如细胞的黏附、延展,细胞微移动与迁移,以及细胞骨架重组造成的形态学改变等。xCelligence RTCA系统利用电阻抗的变化,对细胞迁移和侵袭过程进行无标记的长期动态监测,其优势在于解决了传统细胞体外迁移实验方法终点检测等局限性,可以获得传统的终点实验所无法得知的中间数据;同时也避免了结果定量时的主观偏倚。 综上所述,本项研究初步建立了实时无标记的肿瘤细胞迁移筛选平台,该平台进一步完善后,将利用实验室前期购置的epMotion 5070自动化移液工作站和由Thermo ScientificDharmacon公司进行序列设计与合成siRNA文库来开展大规模的肿瘤细胞迁移筛选工作。这项系统性工作的开展将有助于发现肿瘤转移信号通路中新的调控分子,揭示肿瘤转移的分子机制,还将为肿瘤转移的治疗提供新的理论依据。

参考文献

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