人脐带静脉内皮细胞

人脐带静脉内皮细胞（精选6篇）

人脐带静脉内皮细胞 第1篇

关键词：溶栓颗粒,肿瘤坏死因子-α,人脐静脉内皮细胞,血管内皮生长因子

脑缺血是一种脑循环血流量下降为特征的中枢神经系统疾病, 是当今疾病中主要致残、致死原因之一。近年来研究表明, 内皮细胞不仅是机械性防御结构, 而且是体内最大的“内分泌器官”, 可以生成血管活性物质, 参与血流动力学、血管通透性的调节, 在血栓形成、脂质沉积、细胞黏附等方面均有重要作用。

溶栓颗粒 (枳实、柴胡、地龙、水蛭等组方) 是在临床治疗缺血性中风病的有效方剂。前期研究发现溶栓颗粒对大鼠缺血再灌注损伤有一定保护作用。本研究旨在观察溶栓颗粒对血管内皮细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性Wistar大鼠, 体质量250 g～280 g, 购自青岛市药检所实验动物中心。人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) , 购自北方伟业科技有限公司。DMEM培养液和胎牛血清、胰酶 (1∶250) (美国GIBCO公司) ;Ⅰ型胶原酶、L 谷氨 (美国Gibco公司) 。VEGF免疫组化试剂盒, 购自武汉博士德科技有限公司;肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 购自上海天呈生物信息科技有限公司。溶栓颗粒由枳实、柴胡、地龙、水蛭等组成, 每包14 g (含生药64 g) 由青岛市海慈医疗集团制剂实验室提供。

1.2 含药血清制备

Wistar大鼠20只 (雄性) , 随机分为空白组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药大剂量组。空白组灌胃蒸馏水, 中药大、中、小剂量组分别予0.2 g/L、0.1 g/L、0.05 g/L溶栓颗粒2 mL灌胃, 共灌胃3 d, 于最后1次给药后分别于1 h、1.5 h、2 h无菌条件下腹主动脉取血, 离心分离血清, 不同时间取同一组血清混合后经56 ℃、30 min灭活, 用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌, 置-20 ℃冰箱保存备用。各组含药血清为:正常血清、大剂量中药血清、中剂量中药血清、小剂量中药血清。

1.3 人脐静脉内皮细胞株的培养

HUVEC用含有10%胎牛血清的DMEM培养液, 置孵箱 (37 ℃, 5%CO2) 培养。镜下细胞计数, 待细胞达对数增长期, 实验共分6组, 接种于24孔培养板, 接种密度3×104/mL, 为空白组、模型组、正常血清组、大剂量中药组、中剂量中药组、小剂量中药组。分组后置37 ℃, 5% CO2培养箱孵育, 除空白组外各组加入TNF-α 40 ng/mL孵育 6 h, 用含药血清处理24 h后检测。空白组:HUVEC加 DMEM培养液;模型组:人HUVEC加DMEM培养液加TNF-α孵育。正常血清组:HUVEC加DMEM培养液加TNF-α孵育加正常血清。大剂量中药组:HUVEC加DMEM培养液加TNF-α孵育加大剂量中药血清。中剂量中药组:HUVEC加DMEM培养液加TNF-α孵育加中剂量中药血清。小剂量中药组:HUVEC加DMEM培养液加TNF-α孵育加小剂量中药血清。

1.4 培养细胞VEGF检测

按照免疫组化试剂盒说明进行。培养细胞形态观察采用HE染色, 光镜下观察。

1.5 统计学处理

应用PEMS 3.1统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用方差分析和t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察

模型组、正常血清组HUVEC细胞数量下降, 皱缩、变形, 分裂相细胞明显增加, 细胞形态发生明显变化:血管内皮细胞部分呈明显的长梭形、星形, 似成纤维细胞样改变, 细胞间隙增大。中药大、中、小剂量组细胞密度大于模型组及正常血清组, 分裂相细胞少于模型组及正常血清组。每组各观察10个放大200倍光镜下视野所记录的有丝分裂细胞数。详见表1。

2.2 VEGF蛋白表达

胞浆内棕黄色颗粒的是阳性细胞。空白组HUVEC细胞浆内没有或有少量棕黄色颗粒, 染色很浅。模型组、正常血清组HUVEC有较多细胞胞浆内棕黄色颗粒, 染色较深。大、中、小剂量中药组胞浆含黄色颗粒细胞较少, 染色较浅。表明空白组不表达VEGF蛋白, 模型组、正常血清组及大、中、小剂量中药组有VEGF蛋白表达, 各剂量中药可减少VEGF蛋白表达。各组10×40倍光镜下计数10个视野, 计算阳性细胞数量。详见表2。

3 讨论

近年来研究表明, 内皮细胞不仅是机械性防御结构, 而且是体内最大的“内分泌器官”, 可以生成血管活性物质, 参与血流动力学、血管通透性的调节, 在血栓形成、脂质沉积、细胞黏附等方面均有重要作用。随着对细胞因子网络研究的不断深入, 已证实内皮细胞还具有产生细胞因子的作用, 可通过旁分泌或自分泌形式在其生成的微环境中直接发挥作用, 或进入循环系统, 引起全身效应[1]。

前期研究发现, 溶栓颗粒脑保护作用可能存在以下机制:抑制由白介素-1β (IL-1β) 介导的急性炎症反应;抑制白细胞黏附链条式过程中的IL-1β和细胞黏附分子-1 (ICAM-1) 产生环节, 从而减少白细胞黏附造成的脑组织损伤[2];降低丙二醛 (MDA) 的过量释放、提高超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、增强抗脂质过氧化能力;降低TNF-α的过量释放、减少脑含水量[3];抑制基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 的表达, 从而减少由MMP-9所造成的血脑屏障通透性增加和脑水肿及对脑组织的直接损伤[4]。

血管内皮生长因子 (VEGF) 是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂原, 属分泌性糖蛋白, 具有促进内皮细胞增殖、加速新血管形成, 增强血管通透性等作用[5]。血管内皮细胞正常时不表达VEGF, 但在血管内皮细胞被置于缺氧环境时细胞内VEGF明显增加。

炎症因子可一定程度地促进VEGF在内皮细胞中的表达。炎症因子对动脉粥样硬化发生发展的影响是一个多因素调控的复杂过程, 本研究显示TNF-α增加VEGF表达, 可能是动脉粥样硬化发展的机制之一。在TNF-α损伤状态下, 血管内皮细胞生长因子表达增加, 血管内皮细胞的分裂增殖增加, 加快动脉粥样硬化斑块形成, 增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性。这可能是炎性介质诱发动脉粥样硬化形成以及破裂的原因之一。本研究发现, 溶栓颗粒对HUVEC有保护作用, 能够减少TNF-α对内皮细胞的损害。溶栓颗粒的这一作用可能由于减少VEGF的表达而实现。其中, 大剂量和中剂量溶栓颗粒效果较明显, 而小剂量中药组并未显示出明显的降低VEGF表达作用。小剂量中药组以及正常血清组相对于不加入大鼠血清的模型组有减少趋势, 抑制VEGF表达的作用相当, 考虑或许单纯增加血清含量也能减少VEGF表达, 其具体机制有待于进一步研究。

参考文献

[1]Downey GP, Waddell TK, Fukshi ma T.Sue-A-Quan A Current techniques in cell and molecular biology[J].Crit Care, 1995, 10 (3) :136-149.

[2]曹晓岚, 臧运华, 贺青涛, 等.溶栓颗粒对急性缺血再灌注损伤大鼠脑组织IL-1β及ICAM-1的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2006, 4 (3) :219-220.

[3]曹晓岚, 任丽, 臧运华.溶栓颗粒对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用研究[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2005, 3 (1) :37-38.

[4]臧运华, 曹晓岚, 贺青涛, 等.溶栓颗粒对缺血再灌注损伤大鼠IL-1β及MMP-9的影响[J].山东中医杂志, 2006, 25 (6) :409-411.

人脐带静脉内皮细胞 第2篇

1 材料与方法

1.1 标本的采集

实验中所用脐带全部来自于福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖宫产后的新鲜胎儿脐带 (孕妇自愿提供) , M199培养液中4 ℃保存, 2 h内进行分离培养。

1.2 主要材料和试剂

I型胶原酶 (GIBCO) , M199培养基 (GIBCO) , 胎牛血清 (FBS, GIBCO) , 胰蛋白酶 (GIBCO) , PBS (北京中杉) , Trizol试剂盒 (Invitrogen) ;RT-PCR试剂盒 (Fermentas) , M-MLV反转录酶、oligo (dT) 15 (Promega) ;Taq酶 (Takara) , Marker (Ferments) , 引物设计、合成由上海Invitrogen公司完成;SOD、MDA试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ;其他常用试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 麝香保心丸动物血清制备

称取麝香保心丸原粉0.5 g、1 g、2 g充分溶解于5 mL水中, 采用灌胃法连续给药3 d, 1 mL/100 g大鼠, 第4天灌胃给药后4 h断头取血, 3 500 r/min离心10 min, 取上清液, 0.22 μm过滤器过滤, -70 ℃保存备用, 以对照组 (未给药大鼠) 血清为对照血清组, 上述制备血药浓度为体外细胞干预10×血清, 血药浓度分别为0.5 g/L、1 g/L、2 g/L, 分别定为0.5 g药物血清组、1 g药物血清组、2 g药物血清组。

1.3.2 HUVEC细胞培养

无菌条件下取本院产科剖宫产分娩的新生儿脐带约15 cm, 置于预先准备的装有M199培养液的无菌瓶中, 按Jaffe等[3]的方法加以改进, 使用0.1%I型胶原酶消化, 用含20%FBS的M199培养基在37 ℃ CO2培养箱中培养。待细胞长至80%～90%汇合时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代, 取3代～5代细胞进行实验。

1.3.3 溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU) 插入法检测人脐静脉内皮细胞活性

取3代～5代内皮细胞消化接种于96孔培养板中, 104个细胞/孔, 待其生长至70%～80%汇合时更换2%FBS培养基90 μL/well 24 h, 加入含不同浓度麝香保心丸血清10 μL/well, 30 min～45 min后加入H2O2 10 μL (终浓度50 μg/mL) 继续培养24 h, 加入10×BrdU 10 μL/well 37 ℃孵育2 h～3 h, 弃上清, 加固定液30 min, 弃上清, PBS洗涤一次, 加anti-BrdU-POP抗体室温60 min～90 min, 弃上清, PBS洗涤3次, 每次5 min, 加显色底物100 μL/well 10 min～20 min, 加25 μL/well 硫酸 (1M) 450 nm酶标仪检测其OD值, 用OD值大小表示细胞活性。

1.3.4 细胞上清液中MDA、SOD的测定

参照南京建成生物工程公司试剂盒说明, 将各种试剂按要求混合摇匀。取各组细胞的培养液, 加入混合试剂。旋涡混合器混匀, 95 ℃水浴40 min, 取出后流水冷却, 使用分光光度计测各管吸光度值。按照试剂盒说明计算MDA和SOD的含量。

1.3.5 RT-PCR法测定NADPH氧化酶亚基gp91、p22mRNA表达水平

按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA;取各组细胞RNA 1 μg根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA, 再取逆转录产物1 μL进行PCR扩增。 引物序列及扩增条件; GADPH:上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′, 下游:5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′;gp91:上游:5′-ACA AGG TTT ATG ACG ATG AGC CTA-3′, 下游:5′-CAC TGG CAG CAA GAT CAG CA-3′;p22:上游5′-ACC GTC TGC TTG GCC ATT G-3′, 下游5′-TCA ATG GGA GTC CAC TGC TCA C-3′。PCR扩增反应体系:Premix Taq 12.5 μL, cDNA 4 μL, 上下游引物各2 μL (浓度为10 μmoL/L) , 加无核水至终体积25 μL。PCR扩增参数:预变性94 ℃ 2 min, 变性94 ℃ 30 s, 退火55 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 30 s, 35个循环 (GADPH为30个循环) ;72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR反应产物, 加入6×溴酚蓝上样缓冲液1 μL, 混合后, 于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳, 电压为8 V/cm, 电泳45 min～60 min, 使用凝胶成像分析系统进行观察并拍摄电泳图像, 分析产物的IOD值 (即各电泳条带之光密度积分值) , 以GADPH作为内参照, 进行PCR产物的半定量分析, 比值表示其相对含量。

1.4 统计学处理

所有数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示;采用 SPSS 13.0软件包统计;多组间的比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞增殖的影响

与对照组相比, H2O2组细胞活性明显降低 (P<0.05) 。与H2O2组相比, 麝香保心丸药物血清呈浓度依赖性增加细胞活性。与对照血清组相比, 1 g、2 g药物血清组HUVEC细胞增殖活性明显升高 (P<0.01) 。详见表1。

与对照组比较, 1) P<0.01;与对照血清组比较, 2) P<0.01

2.2 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞上清液MDA水平及SOD活性的影响

与对照组相比, H2O2显著升高HUVEC细胞上清液MDA水平, 明显降低HUVEC细胞上清液SOD活性 (P<0.01) 。与H2O2组相比, 麝香保心丸药物血清呈浓度依赖性提高H2O2诱导HUVEC细胞上清液SOD活性, 降低MDA水平。与对照血清组相比, 1 g、2 g药物血清组SOD活性明显升高, MDA水平下降 (P<0.01) 。详见表2。

与对照组比较, 1) P<0.01;与对照血清组比较, 2) P<0.01

2.3 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞gp91 mRNA表达水平的影响

与对照组相比, H2O2组gp91 mRNA表达无统计学意义。与H2O2组相比, 对照血清组及麝香保心丸药物血清组gp91 mRNA的表达无统计学意义 (P>0.05) 。详见图1、表3。

注:M、1、2、3、4、5、6分别为Marker、对照组、H2O2组、对照血清组、0.5g药物血清组、1 g药物血清组、2 g药物血清组。

注:各组比较, P>0.05。

2.4 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞p22 mRNA表达水平的影响

与对照组相比, H2O2组p22 mRNA表达明显升高, 对照血清组p22 mRNA进一步增加;与对照血清组相比, 0.5 g、1 g药物血清组无明显差异, 而2 g药物血清组p22 mRNA的表达显著降低 (P<0.05) 。详见图2和表4。

注:M、1、2、3、4、5、6分别为Marker、对照组、H2O2组、对照血清组、0.5 g药物血清组、1 g药物血清组、 2 g药物血清组。

3 讨论

Harman于1956年最早提出了氧自由基 (ROS) 的基本理论[4], 1969年McCord和Fridovich发现了能将ROS清除的SOD[5], 随后以氧化应激为核心的自由基理论一直是生物医学界研究的热点。氧化应激参与血管内皮细胞病理生理变化过程的各个环节, 血管内皮细胞氧化应激损伤也是动脉粥样硬化病变的基础[6]。已有研究证实, 动脉粥样硬化的危险因素如高血脂、高血糖等均能引起血管内皮氧化应激损伤[1,2]。血管内皮细胞受到氧化应激损伤后可表现为细胞活性降低, 增殖受到抑制。细胞内相应的自由基类如MDA明显增多, 过多的自由基类物质可导致机体的损伤。而SOD能消除人体内多余的自由基, 从而保护细胞不受毒性氧自由基损伤。在生理状态下, 氧化与抗氧化处于平衡状态, 当危险因素水平升高时, 可出现氧化抗氧化失衡, 氧化应激损伤, 抗氧化能力下降, 引发动脉粥样硬化的发生发展。本研究结果发现H2O2引起内皮细胞氧化应激损伤, 麝香保心丸能抑制H2O2诱导的内皮细胞氧化应激, 并提高细胞增殖活性。

麝香保心丸由麝香、人参提取物、苏合香、牛黄、蟾酥、肉桂、冰片等中药组成, 长期以来作为一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的有效药物, 临床上已得到广泛应用。它能有效缓解心绞痛症状、明显改善缺血性心电图的表现, 治疗心肌缺血效果显著[7]。麝香保心丸也能通过保护血管内皮、抑制炎症等途径促进血管新生[8]。本研究采用H2O2制作血管内皮细胞氧化应激损伤模型, 来研究麝香保心丸对于内皮细胞氧化应激损伤的影响及其机制。结果发现, 麝香保心丸药物血清呈浓度依赖性减轻H2O2引起的内皮细胞损伤。

内皮细胞中的活性氧来源于线粒体电子传递链、一氧化氮合酶 (NOS) 、NADPH氧化酶等多种途径。多项研究证实NADPH氧化酶是生理条件下产生ROS最主要的来源[9]。NADPH 氧化酶首先在吞噬细胞中被发现, 其催化亚基gp91phox (NOX2) 和调节亚基p22phox在细胞膜上形成异二聚体 (即黄素细胞色素b558) , 一些主要位于胞浆的分子 (p47phox, p67phox及Rac蛋白) 也可对其进行调节[10,11]。内皮细胞损伤是心血管性疾病的关键环节。同型半胱氨酸 (Hcy) 调控NADPH氧化酶活性而引起ROS水平升高的直接作用是使NO舒血管作用丧失, 导致内皮功能障碍。在血管内皮细胞中, 发现高浓度的Hcy可以刺激NADPH氧化酶的活化和p22phox 表达的升高[12]。在本实验中H2O2能引起NADPH氧化酶p22 mRNA表达增加, 对照血清组p22 mRNA表达进一步增加;与对照血清组相比, 麝香保心丸0.5 g、1 g药物血清组无明显差别, 而麝香保心丸2 g药物血清组p22 mRNA的表达显著降低。H2O2与麝香保心丸血清对于内皮细胞NADPH氧化酶亚基gp91 mRNA的表达无明显影响, 提示H2O2对内皮细胞引起的氧化应激损伤可能是通过影响调节亚基p22而非催化亚基gp91的活性, 进而引起ROS生成增多以及一系列相关的作用。然而本实验与临床仍有不少距离, 尚需做动物模型实验以作进一步探讨。

摘要：目的 麝香保心丸对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 增殖活性、氧化因子丙二醛 (MDA) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 氧化酶亚基gp91、p22 mRNA表达的影响。方法 体外胶原酶消化法培养人脐静脉内皮细胞;溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU) 插入法测定细胞增殖活性;RT-PCR法测定NADPH氧化酶亚基gp91、p22 mRNA的表达;比色法检测细胞上清液MDA、SOD含量。结果 与对照组相比, H2O2组细胞增殖活性明显降低 (P<0.01) 。与对照组相比, 1 g麝香保心丸药物血清组细胞增殖活性明显增高 (P<0.01) ;与对照组相比, H2O2组人脐静脉内皮细胞上清液MDA含量显著升高, SOD活性明显降低 (P<0.01) , 而麝香保心丸药物血清呈浓度依赖性抑制H2O2诱导HUVEC细胞上清液MDA水平升高及SOD活性降低, 1 g药物血清组上清液MDA含量显著低于H2O2组 (P<0.01) , SOD活性明显高于H2O2组 (P<0.05) ;RT-PCR结果显示:与对照组相比, H2O2组p22 mRNA表达水平明显升高, 对照血清组p22 mRNA表达进一步增加;与对照血清组相比, 麝香保心丸1 g、2 g药物血清组p22 mRNA的表达显著降低;麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞NADPH氧化酶gp91 mRNA表达无显著影响。结论 麝香保心丸保护血管内皮细胞可能与抑制H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激有关。

人脐带静脉内皮细胞 第3篇

1 材料和方法

1.1 药品、试剂

复方通络胶囊(1.5 g生药/ml),南京市中医院提供;丹参注射液,正大青春宝药业有限公司,批号:0502181;RPMI 1640培养基,Gibco产品;完全DMEM培养基,Gibco产品;二甲基亚砜(DM-SO),上海凌峰化学试剂有限公司;新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司,批号:051120;胰蛋白酶(1∶250),Amresco分装;连二亚硫酸钠(Na2S2O4),上海化学试剂采购站经销,批号:90878;ET RIA KIT,解放军总医院科技开发中心放免所,批号:06120;NOS试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20050311;NO试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20050302。

1.2 实验细胞

HUVECs细胞,购于中科院上海细胞库。

1.3 HUVECs的培养及氧化损伤模型的建立

HUVECs按常规方法复苏后接种于40 ml培养瓶中,培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液,37℃、95%O2、5%CO2条件下培养,待细胞长满瓶底后,倒掉培养液,用PBS轻轻荡洗2次,加入0.25%胰蛋白酶37℃消化2～3 min,用新生牛血清终止消化,吸管轻轻吹打数次,使细胞完全分散,倒置显微镜下观察、计数,将细胞浓度调整为1×108个/L的细胞悬液,接种于细胞培养板上(96孔、24孔)同样条件下继续培养,待细胞长满单层融合后,弃去上清,以含0.5%血清的培养液培养24 h,使其同步化生长。HUVECs同步化生长后,换用无血清的RPMI 1640培养液,除正常对照组外加入终浓度为1 mmol/L的Na2S2O420μl作用2 h,吸去培养液,用D-Hank液洗2次,然后加入无血清的DMEM 200μl,继续培养24 h。

1.4 对缺氧复氧损伤所致HUVECs释放ET、NO和NOS活性的影响

各组HUVECs经缺氧处理后,收集培养液,用放射免疫学的方法测定ET,参照南京建成生物工程公司NO、NOS检测试剂盒说明检测NO、NOS。

1.5 实验分组

正常对照组:加入无血清的RPMI 1640培养液3 ml,正常条件下培养32 h;模型组:加入无血清的RPMI 1640培养液3 ml,缺氧24 h,复氧8 h;各给药组预先加入不同浓度的药物预孵1 h,然后按模型组处理。丹参注射液组:丹参注射液(终浓度为3.0 g/L),复氧8 h;复方通络胶囊Ⅰ组:复方通络胶囊终浓度为1×10-4g/L,复氧8 h;复方通络胶囊Ⅱ组:复方通络胶囊终浓度为1×10-3g/L,复氧8 h;复方通络胶囊Ⅲ组:复方通络胶囊终浓度为1×10-2g/L,复氧8 h。

1.6 统计学方法

数据以均数±标准差(±s)表示,结果进行组间比较,用t检验。

2 结果

经过缺氧-复氧处理后,HUVECs释放的ET显著增加,而NOS活性和NO的释放明显减少,复方通络胶囊中、高剂量组能抑制缺氧-复氧诱导的ET释放,提高NOS的活性,促进NO的释放(P<0.05,P<0.01)。结果见表1。

与假手术组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较,﹡P<0.05,﹡﹡P<0.01

3 讨论

正常血管内皮主要功能是抑制血管平滑肌收缩、细胞增生、血小板聚集、白细胞黏附和血栓形成等。内皮细胞可产生和分泌几十种生物活性物质,包括NO、ET等[1]。

ET是近几年新发现的一类由内皮细胞合成分泌的生物活性肽,具有强烈的收缩血管和升高血压的作用,是目前已知最强的血管收缩物质。ET不仅存在于内皮细胞中,也广泛存在于神经、血管平滑肌及巨噬细胞等组织中。测定ET的水平可作为评价内皮细胞功能的参考指标之一[1]。缺血性卒中发生后,血浆和脑脊液中的ET水平均升高[2,3,4]。ET可作用于脑血管致局部脑血管强烈收缩,还可通过对神经组织的直接损害而参与脑梗死的发生及发展。此外ET还与脑梗死患者病情轻重及梗死面积密切相关[5]。

NO是在NOS作用下,催化L-精氨酸(L-Arg)脱胍基而产生的,是血管内皮释放的重要的舒血管因子。NO在中枢神经系统疾病进程中既有潜在的脑保护又有神经毒性的作用。NO本身是一种自由基,可以造成膜脂质过氧化,并且NO反应能够生成毒性更大的超氧自由基产生细胞毒性作用[6]。NOS是NO合成的限速酶,是调节NO的重要环节[7]。缺氧处理后细胞培养液中NO含量明显下降,同时NOS活性也降低,复氧后NO分泌并未恢复,反而更加减少,同时NOS活性受到明显抑制[8]。有研究表明,脑梗死急性期血浆NO水平明显下降,至t恢复期仍未升至正常水平,并且血浆NO随动脉粥样硬化程度增加而减少[9]。

体外培养血管内皮细胞缺氧-复氧损伤模型可模拟缺血再灌注损伤,探索缺血再灌注损伤发病机制[10,11]。本实验通过建立缺氧模型,测定培养液中ET、NO、NOS水平,探讨复方通络颗粒对人脐静脉内皮细胞缺氧-复氧损伤的保护作用。实验结果显示,经过缺氧复氧处理后,HUVECs释放的ET显著增加,而NOS活性和NO的释放明显减少,与多数文献报道一致。而复方通络胶囊中、高剂量组能抑制缺氧-复氧诱导的ET释放,提高NOS的活性,促进NO的释放,可能对内皮细胞有保护作用,并且有益于缺血性卒中的治疗。

摘要：目的:观察复方通络胶囊对缺氧-复氧所致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的作用机制。方法:体外培养HUVECs,建立缺氧-复氧模型,收集培养液,测定内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平。结果:复方通络胶囊中、高剂量组能抑制缺氧-复氧诱导的ET释放,提高NOS的活性,促进NO的释放(P<0.05,P<0.01)。结论:复方通络胶囊通过抑制ET释放,提高NOS的活性,促进NO的释放,对人脐静脉内皮细胞缺氧-复氧损伤有明显的保护作用。

人脐血内皮祖细胞的体外培养 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hv-qapue,密度1.077 g/mL,天津市灏洋生物制品有限公司);EGM-2培养基(Lonza,美国);胎牛血清(Hyclone,美国);血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)均为美国Peprotech公司产品;纤维连接蛋白(FN,Sigma,美国);兔抗人CD133单克隆抗体(Santacruz,美国);鼠抗人CD34(epitomics,美国);FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2(VEGFR-2)(KDR)抗体,PCY标记鼠抗人CD133(Becman Coulter,美国)。X-60倒置相差显微镜(Nikon,日本);AX70荧光显微镜及图像采集仪(Olympus,日本);流式细胞仪(Becman Coulter,美国)。

1.2 方法

1.2.1 脐血内皮祖细胞的分离无菌条件下取正常剖宫产胎盘

中的脐带血50 mL(均签署知情同意书并获我院伦理委员会同意)。脐血中加入肝素(20 U/mL)抗凝,室温静置30～60 min。尽量吸取上清液到含有5 mL PBS缓冲液的试管中混匀;每个10 mL管中加入淋巴细胞分离液2 mL,然后加入混匀的脐血上清液4 mL;将试管放入水平离心机,2 000 r/min离心20 min;吸取呈乳白色的第2层细胞(单核细胞层)加入到含4 mL PBS液中混匀,1 200 r/min离心10 min;弃上清液,加入3 mL PBS液,混匀沉淀,1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入适量的培养基(EGM-2+20%胎牛血清+50 ng/mL VEGF+20 ng/mL bFG F+20 ng/mL IGF-1)吹打混匀。

1.2.2 脐血内皮祖细胞的培养

分离的单核细胞以1×105/cm2接种于纤维连接蛋白包被的12.5 mL培养瓶中;37℃、5%CO2、饱和湿度中培养;第3天半量换液,此后每2～3 d全量换液1次。

1.2.3 血管内皮祖细胞的鉴定

(1)形态学观察:前2 d静置培养细胞,从第3天开始观察。(2)免疫细胞化学染色:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成细胞涂片,采用SABC法,对细胞涂片的CD34进行免疫细胞化学染色,DAB显色,PBS液代替一抗作阴性对照,以细胞质出现棕黄色颗粒为CD34阳性细胞。(3)免疫荧光染色:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成细胞涂片,细胞经4%多聚甲醛固定,10%BSA封闭后,加入兔抗人CD133单克隆抗体(1∶100),阴性对照只加血清,37℃孵育60 min,PBS洗涤,加入FITC标记的荧光素二抗(1∶50),37℃孵育30 min,PBS洗涤,干燥,封片,荧光显微镜观察,显示绿色荧光的细胞为CD133阳性细胞。(4)流式细胞检测:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成1×106/L细胞悬液,分别加入FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2(VEGFR-2)(KDR)抗体,PCY标记鼠抗人CD133抗体各20μL避光室温反应30 min,然后上机检测,分析KDR和CD133共表达情况。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

在培养第3天可见约40%贴壁细胞为梭型;第4～5天贴壁细胞出现细胞集落,周围细胞以集落为中心,呈发芽式向外生长,周围为呈放射状分布的梭形细胞(图1);8～10 d出现“铺路石样”形似鹅卵石的单层细胞(图2)。

2.2 免疫细胞化学染色

CD34免疫组化染色显示(89.67±2.05)%培养7 d细胞为阳性。

2.3 免疫荧光染色

CD133免疫荧光染色显示(67.2±2.12)%培养7 d细胞为阳性。

2.4 流式细胞检测

流式细胞分析培养7 d细胞KDR和CD133的表达率共达87.8%。

3 讨论

有研究认为血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)对内皮祖细胞有调控作用,能促进内皮祖细胞的体外生长[8,9]。这些生长因子用于培养内皮祖细胞的使用剂量和使用的种类,各个实验室各不相同,本实验采用3种生长因子进行体外内皮祖细胞的培养:VEGF使用浓度为50 ng/mL,bFGF为20 ng/mL,IGF-1为20 ng/mL。

体外分离内皮祖细胞的方法主要有免疫磁珠、流式细胞术和密度梯度离心法,前两种虽然可获得高纯度的细胞,但其回收内皮祖细胞的量少且操作复杂,费用昂贵。通过预试验我们对采取经过静置30～60 min的抗凝脐血上清液(血浆)和采用抗凝脐血与PBS缓冲液1∶1稀释后的血液分别用密度梯度离心法获得的单个核细胞通过显微镜观察比较,发现用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞中的红细胞含量远远少于用PBS缓冲液与脐血1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞中的红细胞含量,且用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养发现细胞贴壁情况比用PBS缓冲液与脐血1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养的贴壁情况要好。因此,本实验采用密度梯度离心法从静置30～60 min的抗凝脐血上清液(血浆)中获得单个核细胞用于内皮祖细胞的体外培养。

内皮祖细胞的培养方法主要有:一种方法是将获得的单个核细胞接种到预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,24 h后将未贴壁的细胞重新接种到新的铺有纤维连接蛋白的培养板中继续培养[1];另一种方法是将单个核细胞接种到培养板中,培养4 d后弃掉未贴壁的细胞,留下的贴壁细胞继续培养[10];还有一种是把单个核细胞接种到铺有Ⅰ型胶原的培养板中,然后弃掉未贴壁的细胞,贴壁细胞继续培养[11]。纤维连接蛋白可促进细胞的黏附,并且与VEGF协同可提高内皮祖细胞的迁移和分化[12],因此本实验采用的内皮祖细胞培养方法是将获得的单个核细胞接种到铺有纤维连接蛋白的培养瓶中,静置培养3 d后弃去未贴壁的细胞,贴壁细胞继续培养。

内皮祖细胞的的鉴定观点不一。有人把表达CD34和KDR的认为EPCs[1];有些学者认为CD34、CD133、KDR是EPCs特征性标志[13];也有学者把EPCs分为两类,早期EPCs(CD34+、CD133+、KDR+),晚期EPCs(CD34+、CD133-、KDR+)[14,15,16]。

人脐带静脉内皮细胞 第5篇

关键词：马兜铃酸,内皮细胞,细胞凋亡

马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy,AAN)是一种由于服用含有马兜铃酸(aristolochic acid,AA)成分的药物所致的肾小管间质疾病[1,2]。至今,对其发病机制的认识尚未完全清楚。近年研究发现,在AAN中存在肾脏局部血管内皮损伤[3,4,5]。内皮细胞凋亡作为内皮损伤的主要形式,在血管病变的发生﹑发展过程中起着关键作用。为此,我们以体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilica vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,探讨AA能否引起血管内皮细胞凋亡及其可能机制,以进一步阐明AAN的发病机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

马兜铃酸钠盐(sigma公司);hoechst 33258试剂盒(碧云天生物公司);AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒(晶美生物公司);兔抗人bcl-2和bax多克隆抗体(美国ABZOOM公司);caspase-3活性试剂盒(美国BD公司);流式细胞仪(美国BD公司);分光光度检测仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

HUVECs细胞培养于DMEM培养基中,其中含10%胎牛血清、青霉素和链霉素(100μ/m L)。细胞于37℃、5%二氧化碳和饱和湿度条件下培养。3～5代细胞用于实验。

1.2.2 实验分组

AA组:AA的终浓度分别为5、

10、20 mg/L;另设正常对照组:不加任何处理因素。各组细胞培养24 h后,进行检测。

1.2.3 hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态学改变

将细胞按实验分组处理后,吸弃各孔中上清,PBS洗2次,加入4%多聚甲醛溶液0.5 m L,4℃固定10 min,弃去固定液,PBS洗2次,再加入Hoeehst33258荧光染液0.5 m L,室温孵育10 min,PBS洗2～3次,封片,荧光显微镜下观察。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

收集各组细胞,PBS缓冲液洗2次。加入100μL结合缓冲液重悬细胞,加入AnnexinⅤ-FITC 5μL和PI染液10μL,孵育15 min,再加入400μL结合缓冲液,轻轻混匀,上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot法检测bcl-2和bax蛋白的表达

用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。取100μg样品,进行SDS-PAGE凝胶电泳。将蛋白转移至硝酸纤维素膜,然后以5%脱脂奶粉室温封闭2h,加入一抗bcl-2和bax(1∶500),4℃孵育过夜,次日加入HRP标记的二抗(1∶2 000),室温孵育2h,加入ECL显色液进行显色,曝光。用Scion Image分析软件对目的条带进行灰度值分析。以目的蛋白的吸光度值与β-actin的吸光度值之比表示目的蛋白的相对量。

1.2.6 比色法测定caspase-3的活性

分别收集各组细胞,PBS洗2次,离心10 min,去除上清。收集细胞中加入50μL细胞裂解液,冰上裂解60 min。4℃离心1 min。各组取同样蛋白量,分别加50μL 2Reaction Buffer/DTT Mix。加入5μL caspse-3substrate(Ac-DEVC-pNA),37℃4 h。分光光度计测定其吸光值。结果以各组吸光值与正常对照组吸光值之比表示。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 13.0软件包进行分析。计量资料以均数±标准差表示,各组间数据的比较采用方差分析。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 AA对内皮细胞核形态学的影响

正常细胞染色质均匀,发出均匀蓝色荧光。细胞发生凋亡时,染色质固缩,细胞核致密深染,或呈碎块状,染色质边集,细胞内可见亮蓝色强荧光。结果显示:正常对照组少见凋亡细胞。伴随AA浓度的增加,凋亡细胞逐渐增加(见图1)。

2.2 AA对内皮细胞凋亡率的影响

正常对照组内皮细胞的凋亡率为(6.64±0.78)%;而随着AA浓度的增加,细胞凋亡率出现不同程度的增加,细胞凋亡率分别为(11.79±1.29)%(5 mg/L组),(27.79±2.56)%(10 mg/L组),(32.33±3.82)%(20 mg/L组),与正常对照组相比,差异有显著性(P<0.05,P<0.01)(见图2)。

1)与正常对照组比较,P<0.05;2)与正常对照组比较,P<0.01;A:正常对照组;B:AA 5 mg/L组;C:AA 10 mg/L组;D:AA 20 mg/L组

2.3 AA对内皮细胞凋亡蛋白bcl-2表达的影响

正常情况下,HUVECs细胞存在少量bcl-2蛋白的表达。与正常对照组比较,AA可使内皮细胞内bcl-2蛋白表达减少,P<0.05,P<0.01(见图3)。

1)与正常对照组比较,P<0.05;2)与正常对照组比较,P<0.01;A:正常对照组;B:AA 5mg/L组;C:AA 10mg/L组;D:AA 20mg/L组

2.4 AA对内皮细胞凋亡蛋白bax表达的影响

正常对照组HUVECs细胞内有极少量bax蛋白的表达。与正常对照组相比,AA组细胞内bax蛋白的表达增加,P<0.05,P<0.01。与AA10mg/L浓度组比较,AA20 mg/L时细胞内bax蛋白的表达却降低(见图4)。

1)与正常对照组比较,P<0.05;2)与正常对照组比较,P<0.01;A:正常对照组;B:AA 5 mg/L组;C:AA 10 mg/L组;D:AA 20 mg/L组

2.5 AA对内皮细胞caspase-3活性的影响

正常对照组细胞内caspase-3活性为(1.000±0.037)。与正常对照组相比,AA可使细胞内cas pase-3活性增加,P<0.05,P<0.01。细胞经AA20mg/L浓度处理24 h后,细胞内caspase-3活性与AA10 mg/L浓度组比较反而降低(见图5)。

1)与正常对照组比较,P<0.05,2)与正常对照组比较,P<0.01;A:正常对照组;B:AA 5 mg/L组;C:AA 10 mg/L组;D:AA 20 mg/L组

3 结论

近10年来,由含AA成分的中草药引起的肾脏损害受到国内外学者们的广泛关注,并进行了许多相关研究。近年研究发现,肾间质微血管病变在AAN发生发展起重要地位[6,7,8]。内皮细胞损伤是微血管病变发生发展的始动环节。然而内皮细胞的过度凋亡却是内皮细胞功能失调的始动环节[9,10]。内皮细胞凋亡可削弱细胞间连接,破坏血管内皮单层致密结构,引起血管屏障功能障碍;内皮细胞凋亡可促进单核/巨噬细胞向内皮下迁移,使血管平滑肌细胞直接暴露于各种炎性刺激因子的环境中,刺激血管平滑肌细胞增殖及内膜下迁移;凋亡的血管内皮细胞可改变血管内皮的抗凝特性,使血管内皮进入促凝状态,从而诱发了血管病变的发生。

Hoechst 33258是结合DNA的双苯并咪唑类荧光染料,被激发后可产生蓝色荧光。正常细胞hoechst 33258染色后呈淡蓝色荧光。凋亡细胞因细胞膜通透性增强,进入凋亡细胞中的hoechst 33258荧光染料比正常细胞增多;另外,凋亡细胞的染色体DNA结构发生了改变,hoechst 33258能更有效地与DNA结合,这些因素都会使凋亡细胞较正常细胞荧光强度明显增高。本实验中,HUVECs细胞经不同浓度AA处理24 h后,随着AA浓度增加,呈亮蓝色强荧光的凋亡细胞也随之增加,说明AA可诱导HU-VECs细胞发生凋亡。

在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与PS有高度亲和力,故常以Annexin V为探针,利用流式细胞仪检测细胞发生凋亡的情况。本实验显示,经不同浓度AA分别作用于HUVECs细胞24 h后,内皮细胞凋亡率呈浓度依赖方式增加,进一步说明AA可诱导内皮细胞发生凋亡。

人脐带静脉内皮细胞 第6篇

1材料与方法

1.1材料

3根脐带采自健康足月剖宫产的新生儿 ( 经家属签字同意,新生儿性别为1男2女) 。细胞因子检测试剂盒( 欣博盛生物科技有限公司) ,酶标仪( 上海科华生物工程 股份有限 公司) ,荧光定量PCR仪、Fast SYBR Green Master mix( Applied Biosystem公司) ,标记抗体、流式细胞仪( Beckman Coulter公司) ,细胞恒温培养箱( Thermo公司) ,显微设备( Olympus公司) ,核型分析系统( Leica公司) 。

1.2hUC-MSCs的分离培养

将脐带冲洗干净后剥离羊膜上皮,将脐带胶质剪碎,加入30 mlⅡ型胶原酶消化6 h,100目筛网过滤收集细胞。室温下以1 200 r·min- 1离心10 min后弃上清。无血清培养基重悬细胞,在37 ℃恒温培养箱内培养6 ~ 7 d后全量换液,弃掉未贴壁细胞。消化后在细胞瓶内接种1 × 106个细胞,应用无血清培养基培养, 以后每隔3 ~ 4 d换液1次。

1.3细胞形态观察和流式细胞术检测

待细胞生长到融合度为80% 左右时对细胞形态进行观察并拍照。PBS冲洗2次后用0. 25% 胰酶消化3 min,离心弃上清液,再用PBS将细胞浓度调整到1 × 106ml- 1,分别加入CD19- FITC、CD34- FITC、 CD11b-PE、CD35-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、 CD105-PE、HLA-DR-PE,25 ℃ 避光孵育30 min,PBS冲洗3次后利用流式细胞仪检测。

1.4核型分析

细胞处于对数期时,在瓶内滴加秋水仙素至终浓度为0. 04 mg·L- 1,继续培养3. 5 h,胰酶消化,收集所有细胞。PBS冲洗3次后加入5 ml浓度为0. 075% 的KCl低渗液,37 ℃水浴15 min,以1 500 r·min- 1离心8 min后弃上清。在细胞中滴加2 ml固定液,37 ℃ 水浴3 min,离心弃上清,重复1次,第2次固定用8 ml固定液,共30 min。重悬细胞后在每块玻片上滴加细胞悬液,自然风干后用吉姆萨染液染色10 min,用电子显微镜观察分析。

1.5基因表达分析

利用Primer premier 5. 0软件设计P16、P21、P53、 TERT、K-ras、CCNE和Nanog 7个基因的相对荧光定量引物( 表1) 。细胞培养至融合度为80% 左右时行胰酶消化收集细胞。PBS冲洗3次后以TRIzol处理提取RNA,RT-PCR合成c DNA第一条链。以其为模板进行PCR扩增。扩增实验结束后对结果进行分析。

1.6细胞因子检测

胰酶消化后以5 000 r·min- 1离心5 min,收集细胞培养上清液。按照ELISA检测试剂盒说明书进行细胞因子的定量检测。

2结果

2.1hUC-MSCs传代后形态学和流式细胞术鉴定

接种原代细胞24 h后细胞开始贴壁,传代至第7代后细胞生长速度开始明显减慢。细胞形态呈长梭形,无明显变化( 见图1) 。

本研究中细胞表面标记物CD11b、CD19、CD34、 CD45和HLA-DR含量在1% 以下,为低表达,CD73、 CD90和CD105表达量为99% 以上,为高表达。流式细胞术鉴定结果发现,代次之间表达量基本无变化( 见图2) 。流式细胞术鉴定细胞周期得知,在传代过程中,处于G2期和S期的细胞百分比基本保持稳定( 见图3) 。

2.2hUC-MSCs染色体核型分析

对1、3、5、7、10和20代细胞的染色体核型分析显示,细胞在传代过程中细胞核型无明显缺失、易位和倒位等变化( 见图4) 。

2.3相关基因表达分析

对h UC-MSCs的P16、P21、P53、CCNE、Nanog、 TERT和K-ras 7个基因表达量进行了相对荧光定量检测,以原代细胞表达量为单位1,检测结果发现P16基因有上调趋势,P21基因在第7代以后略有下降, P53、CCNE、Nanog、TERT和K-ras 5个基因呈下降趋势( 见图5) 。

2.4hUC-MSCs细胞因子检测

对细胞培 养基中的b FGF、NGF、EGF、LIF、 VEGF165和HGF细胞因子进行了检测,以原代细胞表达量为标准,实验结果显示传代过程中细胞因子基本保持稳定。

3讨论

本研究对体外培养的1、3、5、7、10、13、17、20代h UC-MSCs从细胞形态、染色体核型、细胞周期、表面标记物表达以及相关基因和细胞因子几个方面进行了相关研究。结果显示,传代过程中细胞形态呈长梭形, 传代过程中无明显变化。流式细胞术鉴定结果显示: h UC-MSCs 1、3、5、7、10、13、17和20代细胞之间表面标记物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR表达量基本无变化。此结果符合间充质干细胞判定标准[9]。 h UC-MSCs 1、3、5、7、10和20代细胞的染色体核型分析显示,传代过程中细胞核型无缺失、易位和倒位等变化,说明h UC-MSCs在体外传代至20代染色体核型稳定。

本研究对h UC-MSCs 1、3、5、7、10和20代细胞的相关基因表达量检测结果显示: P16基因的表达量在传代过程中较原代细胞有所上调; P21基因的表达量在前7代中也有上调趋势,7代以后略有下降; TERT、 Nanog、P53、CCNE和K-ras基因表达均有所下降。这些基因的表达量变化较小,与原代相比大多数变化在2倍以内。众所周知,P16基因和P21基因是细胞增殖的负调控基因,K-ras基因和CCNE基因为细胞增殖的正调控基因。本实验结果提示,h UC-MSCs随传代次数增加,细胞衰老程度有所增加,细胞增殖能力可能有所减弱,其亚全能性也可能有所减弱。因此,就细胞增殖分化相关基因的表达来看,h UC-MSCs在体外传代过程中,随着传代次数的增加,细胞的遗传特性略有改变,但其变化量较小,对h UC-MSCs临床应用的安全性影响不大。

对h UC-MSCs培养时所分泌的细胞因子及生长因子的检测结果发现,在细胞传代过程并未影响它的分泌能力,6种细胞因子均基本保持稳定,说明细胞在增殖分化方面的调节因子及免疫调节因子等均保持稳定。

综上所述,h UC-MSCs在传代至20代的过程中, 细胞形态、细胞周期基本无变化; 细胞染色体核型保持稳定,无明显缺失、易位和倒位等变化; 遗传特性方面, 细胞表面标记物和细胞因子表达稳定; 细胞增殖调控相关基因表达略有差异。可见,h UC-MSCs在体外传代至20代过程中,其生物学特性基本稳定,遗传特性在前10代仅有轻微改变,因此,我们认为10代以内脐带间充质干细胞的应用较为安全。

摘要：目的:研究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外传代过程中生物学特性及遗传特性的变化,为hUC-MSCs临床应用的安全性提供理论依据。方法:观察无血清培养基培养的1、3、5、7、10、13、17和20代hUC-MSCs的细胞形态,对细胞周期、表面标记物、染色体核型进行分析,并对相关基因和细胞因子作定量分析。结果:hUC-MSCs传代至第7代后细胞生长速度开始明显减慢;细胞形态无明显变化,呈长梭形。细胞周期分析发现,处于G2期和S期的细胞百分比保持稳定;染色体核型无明显缺失、易位和倒位等变化。待测基因表达量略有差异,各代细胞培养基中分泌的细胞因子保持稳定。结论:利用无血清培养基培养的hUCMSCs在体外培养10代以内基本安全。