禽流感检测方法

禽流感检测方法（精选9篇）

禽流感检测方法 第1篇

1.1病原学检测-病毒的分离与鉴定

将病料以尿囊腔途径接种9～11日龄的SPF鸡胚, 收集死亡鸡胚尿囊液, 将收获的鸡胚尿囊液进行血凝价检测, 当血凝滴度达1︰16以上时, 确定病毒分离为阳性。若初次传代获得的尿囊液未检测到血凝性, 需再盲传两代, 若仍未检测到血凝性则认为病毒分离阴性。将收获的鸡胚尿囊液进行血凝抑制试验, 若被AIV标准阳性血清抑制, 而不被鸡新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒等疾病的标准阳性血清抑制, 则可初步认定分离到的病毒为AIV。

1.2血清学检测

利用抗原与抗体在体外或体内均能发生特异性结合的特性设计的检测抗原或抗体的一系列检测技术, 均称为免疫学检测技术。由于在体外进行反应时, 一般采用含有抗体的血清进行试验, 故称为血清学技术, 它具有特异性强, 敏感性高, 适应面广, 方法简便快速, 制样简单等特点。下面介绍一些常用的AIV血清学检测技术。

1.2.1血凝 (HA) 与血凝抑制 (HI) 试验AIV的囊膜表面具有血凝素 (HA) 能凝集多种动物的红细胞, 这种凝集特性能被特异的血清抑制。HA试验主要用于AIV的常规检测, HI试验可用于AIV的鉴定和血清中AIV抗体浓度的测定。

1.2.2琼脂扩散试验 (AGP) 琼脂凝胶的孔径约85纳米, 允许抗原抗体在凝胶中自由扩散, 形成浓度梯度, 当抗原抗体在比例适当处相遇, 形成抗原抗体复合物后在凝胶中不能再扩散, 从而形成肉眼可见的沉淀线。通常用于检测抗A型流感病毒核蛋白 (NP) 和基质蛋白 (MP) 抗体。

1.2.3免疫荧光 (IF) 技术荧光色素 (常用异硫氰酸荧光素) 与抗体分子结合后, 并不影响抗体蛋白分子的免疫活性, 可与标本中特异性抗原特异性结合, 且这种结合较为牢固, 用缓冲液洗涤时除去游离的荧光素标记抗体后, 用荧光显微镜观察。此技术最早用于鉴定和定位流感病毒感染细胞中特异性的抗原, 主要是NP或MP抗原。检测NP抗原主要出现核内荧光, 检测MP抗原主要出现胞浆荧光, 核内也有部分荧光。

1.2.4酶联免疫吸附试验 (ELISA) 抗原和抗体能与固相载体表面结合并能保持其免疫活性, 抗原或抗体与酶结合后的标记物既能保持抗原或抗体的免疫活性, 又能保持酶的活性, 受检物中的抗原或抗体与固相表面的抗体或抗原发生免疫反应并结合在固相表面, 此抗原抗体复合物又能结合相应的酶标记物, 洗涤除去未结合的酶标记物, 加入酶反应的底物, 底物被酶催化为有色产物, 显色的程度与受检物的抗原或抗体的含量直接相关, 可根据显色的深浅进行定性和定量测定。

1.3分子生物学检测

1.3.1聚合酶链式反应 (PCR) 及反转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR) 是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应, 在体外扩增核酸序列, 一般可扩增至106倍。主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性模仿体内的复制过程, 在附加的一对引物之间诱发聚合反应, 对于RNA病毒, 必须用反转录酶将RNA反转录成cDNA拷贝, 然后再用PCR进行扩增, 该技术称为RT-PCR。用RT-PCR核蛋白反转录引物来鉴定AIV, 用H5和H7亚型AIV的特定引物进行AIV分型鉴定。

1.3.2荧光RT-PCR荧光RT-PCR是20世纪90年代末发展起来的新技术, 将荧光素标记的探针与引物一起在荧光PCR仪中反应, 电脑对整个反应进行实时监测。AI荧光RT-PCR检测试剂盒系列包括AIV通用型及H5、H7、H9亚型AIV检测试剂盒。

1.3.3基于核苷酸序列扩增 (NASBA) 法是以转录为基础的扩增系统, 用来检测RNA病毒, 可以在一种混合物和一个温度下进行连续的扩增。具有如下优点:快速, 整个核苷酸分离、扩增和检测过程只需6小时;灵敏, 不仅能检测出具有感染性的完整的病毒颗粒, 还能检测出非感染性的和错误包装的非感染性的病毒粒子, AIV尿囊液稀释至10-7仍可以检出;高特异性, 不需要常规PCR中的模板变性, 能特异的扩增单链的RNA病毒;无交叉污染:由于NASBA的终产物是RNA, RNA对环境是不稳定的, 交叉污染的可能性极小。

1.4扫描电子显微镜 (SEM) 技术

SEM的电磁线圈起透镜的作用, 电子束经电磁线圈聚焦在覆有薄层重金属膜的样品上, 检测器测量从样品每一点发射或散射出来的电子数量, 用于控制屏幕图像上每一点的强度, 这种显微镜有很大的焦深, 能为三维物体形成鲜明的图像, 其分辨率为3～20纳米, 视仪器而定。流感病毒具有多形性, 在病毒遗传学研究中作为一种遗传标志, 典型A型流感病毒粒子呈球形, 直径80～120纳米, AIV有些毒株主要为球形, 而有些毒株为多形性, 并且大小差别很大。通过SEM可以观察到AIV的形态, 病毒粒子表面纤突的结构以及裂解病毒释放出的内容物, 还可以对病毒在体内的分布、增殖情况与其它病毒形态差别有感性认识。

预防禽流感知识护理方法 第2篇

1、健康的生活方式非常重要。平时应加强体育锻炼，多休息，避免过度劳累，不吸烟，勤洗手；要有均衡的饮食，注意多摄入一些富含维生素C等增强免疫力的食物；注意个人卫生，打喷嚏或咳嗽时掩住口鼻。

2、保持室内清洁。使用可清洗的地垫，避免使用难以清理的地毯，保持地面、天花板、家具及墙壁清洁，确保排水道通畅；保持室内空气流通，应每天开窗换气两次，每次至少10分钟，或使用抽气扇保持空气流通；尽量少去空气不流通的场所。

3、注意饮食卫生。进食禽肉、蛋类要彻底煮熟煮透，食用鸡蛋时蛋壳应用流水清洗，不吃生的或半生的鸡蛋，加工、保存食物时要注意生、熟分开；养成良好的卫生习惯，搞好厨房卫生，不生食禽肉和内脏，解剖活(死)家禽、家畜及其制品后要彻底洗手。

4、应尽量避免与禽类接触，特别是儿童应避免密切接触家禽和野禽。应尽量在正规的市场购买经过检疫的禽类产品；勤洗手，远离家禽的分泌物，接触过禽鸟或禽鸟粪便，要注意用消毒液和清水彻底清洁双手；学校及幼儿园应采取措施，教导儿童不要喂饲野鸽或其他雀鸟；外出旅途中，尽量避免接触禽鸟，如不要前往观鸟园、农场、街市或公园活动，不要喂饲白鸽或野鸟等。

5、注意生活用具的消毒处理。禽流感病毒不耐热，100℃下2分钟即可灭活。对干燥、紫外线照射、汞、氯等常用消毒药都很敏感。

6、不要轻视感冒。禽流感的病症与其他流行性感冒病症相似，如发烧、头痛、咳嗽及喉咙痛等，在某些情况下，会引起并发症，导致患者死亡。因此，若出现打喷嚏、咳嗽等呼吸道感染症状时，要用纸巾、手帕掩盖口鼻，预防感染他人；若出现发热、头痛、鼻塞、咳嗽、全身不适等呼吸道症状时，应戴上口罩，尽快到医院就诊，并务必告诉医生自己发病前是否到过禽流感疫区，是否与病禽类接触等情况，并在医生指导下治疗和用药。

禽流感诊断检测方法综述 第3篇

1 血清学诊断技术

1.1 血凝试验 (HA) 和血凝抑制试验 (HI)

AIV囊膜表面的血凝素能凝集多种动物的红细胞, 这种凝集特性能被特异的血清抑制。血凝 (HA) 试验主要用于AIV的常规检测, 血凝抑制 (HI) 试验可用于AIV的鉴定和血清中AIV抗体浓度的测定。HI试验具有较高的特异性和敏感性, 但在做 (HI) 试验时, 需要先去除血清中的非特异性的凝集因素, 同时需要对抗原进行标准化, 目前WHO一般采用此方法进行全球流感病毒的监测。

1.2 琼脂免疫扩散试验 (AGP)

AGP试验一般用来检AIV的共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有A型流感病毒的核蛋白以及基质蛋白都具有相似的抗原性, 所以针对AIV的AGP试验都是检测这两类抗原的抗体。琼脂扩散试验操作简单, 即可以定性又可以定量。1970年, Beard首次建立了用于禽流感抗原检测的AGP方法。AGP最常用的方法是免疫双扩散 (IDD) 。AGP检测抗核蛋白的抗体, 既可以定量又可以定性, 该方法操作简单, 重复性好, 敏感性强。

1.3 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

ELISA具有较高的敏感性, 既可以检测抗体, 又可以检测抗原。尤其适合于大批样品的血清学调查, 可以标准化而且结果易于分析。在H9禽流感的控制扑灭、检疫中广泛使用。1974年, Jennings等首先用ELISA方法对流感病毒免疫后抗体产生规律进行监测。之后, ELISA诊断方法的研究在国外发展很快。国内外大多采用间接ELISA和竞争ELISA检测鸡群抗体水平。李海燕等利用混和纤维素酯微孔滤膜建立了斑点ELISA, 该方法不仅敏感性和特异性好, 而且结果易于判定, 非常适合现场H9N2亚型AIV抗体的检测及流行病学调查。此后又利用重组NP蛋白建立了间接ELISA, 和免疫金标快速检测试纸条等。其他还有补体结合、神经氨酸酶活性抑制和单辐射溶血试验等。

2 分子生物学诊断技术

2.1 反转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)

近几年来, 随着现代生物技术的发展, 分子生物学技术已被大量应用于禽流感的快速诊断。RT-PCR是目前发展最成熟的分子诊断技术, 是一种体外基因扩增技术, 能在数小时内使DNA呈指数倍增加。可以从基因水平检测AIV的RNA, 可以大大缩短对禽流感病原的检出时间, 为禽流感的早期快速诊断提供了更敏感、更快速的方法。该技术具有高度的敏感性和特异性, 可大大缩短对AIV的检出时间, 不仅克服了病毒分离鉴定试验周期长的缺点, 而且克服了因野外取材混有其他病毒造成的误诊, 为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的检测方法。目前已引起国内外学者的广泛关注。利用RT-PCR方法鉴定H9N2亚型禽流感的是世界动物卫生组织 (OIE) 推荐的方法之一。

2.2 RT-PCR-ELISA法

Chaharaein等研究了用于快速检测H9N2亚型AIV的RT-PCR-ELISA法, 与标准的病毒分离法以及血清学试验 (血凝试验和血凝抑制试验) 进行比较, 基于H9亚型AIV的RT-PCR-ELISA法对SPF鸡体内H9N2亚型AIV检测敏感性与病毒分离法相比达到100%, RT-PCR-ELISA的敏感性是凝胶电泳法的10倍, 说明RT-PCR-ELISA法对于检测A型流感病毒, 特别是鸡体内H9N2亚型AIV亚型是一个非常简便、敏感的方法。

2.3 胶体金免疫层析技术

20世纪80~90年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展了新型体外诊断技术--胶体金免疫层析技术 (GICA) 。GICA对样品要求不高, 组织液、血清、粪便和尿液等均可十min即可出现结果, 肉眼即可判断;准确可靠, 特异性强, 灵敏度高, 可达到ELISA水平;应用广泛, 成本低, 保存方便, 更有利于临床现场检测使用。

2.4 荧光RT-PCR

荧光RT-PCR技术是20世纪90年代末才发展起来的新技术, 是将荧光素标记的探针与引物一起在荧光PCR仪中反应, 电脑对整个反应进行实时监测, 避免了交叉污染, 与常规RT-PCR方法相比, 其灵敏度和特异性都有所提高, 对PCR产物无需进行后处理, 缩短了检测时间。商品化试剂盒的问世, 使该技术操作起来十分简单、方便。

随着时间的推移会有更简便、更高效、更准确的方法出现, 但是对于疑似高致病性禽流感发病禽群要及时按照国家要求进行上报, 在确诊后进行隔离禽场或禽舍, 严禁将病禽或可疑病禽上市, 病死禽必须深埋或焚烧。只有这样才能真正的控制流感的发生。

参考文献

[1]王重庆.分子免疫学基础[M].北京:北京大学出版社, 1997, 223-225.

预防H7N9禽流感的消毒方法 第4篇

预防人感染H7N9禽流感要采取科学、有效的卫生、消毒处理措施，避免过度消毒，防止造成化学污染。

在接触病禽后或有特殊需要时，应及时消毒。消毒方法首选物理消毒的方法，如煮沸消毒、流通蒸汽消毒等，无法使用物理方法的，可采用化学方法。以下是常见物品的消毒方法：

一.物体表面消毒：可选用清洗、擦拭、喷雾和浸泡的方法。一般选择含氯消毒剂，浓度为200－400毫克/升，作用时间应不少于30分钟。消毒后用清水擦拭，去除残留消毒剂。

二.餐具消毒：消毒接触过生禽肉、禽蛋的用具时，首先需要 自来水将切菜板、刀具、盛放生肉及禽蛋的容器彻底的刷洗、清洗干净，然后选择适当的消毒方法。

(一).煮沸消毒：耐热的用具，最好采用蒸煮的方式进行消毒处理。将食饮具放入蒸锅蒸20分钟（温度为 100℃），或将食饮具全部浸没于水中，煮沸15分钟以上。

(二)化学消毒方法：通常采用含氯消毒剂如“84消毒液”进行消毒，“84消毒液”的稀释倍数掌握在100倍左右，也就是取1份消毒液加入99份水混合稀释。通常的消毒浸泡时间为30分钟左右。也可使用其他可用于食饮具消毒的消毒剂，严格按照说明书使用。采用化学消毒剂浸泡消毒时切记消毒处理后将残留的消毒剂冲洗干净！

禽流感检测方法 第5篇

1 材料与方法

1. 1 病毒和 SPF 鸡胚

马EIV A/马/新疆/3 /2007 ( H3N8) 毒株和A/马/北京/1 /1974 ( H7N7) 毒株、马传染性贫血病毒( EIAV) 辽毒株、马动脉炎病毒( EAV) Bucyrus毒株、1型和4型马疱疹病毒( EHV1和EHV4) ,均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马传染病和慢病毒研究团队保存。9日龄SPF鸡胚,购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1. 2 主要试剂

DL - 2 000 Marker、p MD19 - T Simple载体、Ex Taq DNA聚合酶、感受态细胞DH5α、M - MLV反转录酶,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 胶回收( 小量) 试剂盒、质粒 ( 小量) 提取试剂盒,均购自OMAGE公司; QIAamp Viral RNA提取试剂盒,购自QIAGEN公司; Sso FastTMEva Green supermix预混液,购自Bio - Rad公司。

1. 3 引物的设计与合成

分析Gen Bank上公布的H3N8亚型EIV HA基因序列,选择高度保守的HA基因编码区作为扩增片段。根据EIV A/马/新疆/3 /2007 ( H3N8) 毒株HA基因序列( EU794559. 1) 设计、筛选1对特异性引物[序列为: 上游引物 ( H1) 5' - GCATCTCCAACGACAAGCCATTC - 3',下游引物 ( H2 ) 5' - ACCACCCATCAACCATTCCTTCC - 3']和流感病毒的通用引物Uni - 12( 序列为5' - AGCAAAAGCAGG - 3') 。引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

1. 4 病毒的培养

EIV用9日龄SPF鸡胚培养,培养条件为35 ℃ ,湿度为60% ~ 70% 。培养72 h后,置于 - 20 ℃ 预冷1 h,凝固血管。

1. 5 病毒 RNA 的提取及其反转录合成 c DNA

根据QIAamp Viral RNA提取试剂盒说明书进行操作,分别提取EIV、EIAV、EAV的RNA,由于EHV是RNA病毒,对EHV也做相同处理。在20 μL的反转录体系中加入病毒总RNA 8 μL,加入Unit - 12( 20 pmol/μL) ,反转录缓 冲液5 × Buffer 4 μL,2. 5 mmol / L d NTP 4 μL,70 ℃ 水浴5 min; 迅速冰浴5 min; 快速加入200 U / μL M - MLV 0. 5 μL,40 U / μL RNase Inhibitor 0. 5 μL,37 ℃ 水浴1 h; 再放于70 ℃水浴10 min; 立即置冰上冷却,保存,备用。

1. 6重组标准质粒 p MD19 - T Simple - HA 的构建及鉴定

常规PCR反应扩增EIV A/马/新疆/3 /2007( H3N8) 毒株c DNA片段,引物为H1和H2,在50 μL反应体系中加Ex Taq DNA聚合酶0. 5 μL,10 × Ex Taq Buffer( Mg2 +Plus) 5 μL,2. 5 mmol / L d NTP 4 μL,c DNA 5 μL,引物H1和H2各1 μL,用DEPC处理水补足50 μL。反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,59 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共30个循环; 72 ℃ 10 min后,4 ℃ 保存。扩增片段大小为192 bp,用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后进行胶回收,与p MD19 - T Simple载体连接,转化DH5α 感受态细胞,取菌液PCR初步鉴定正确的阳性质粒菌落送往哈尔滨博仕生物技术有限公司测序,测序结果与NCBI上的EIV A/马/新疆/3 /2007( H3N8) 毒株HA基因序列( EU794559. 1)进行比对。

1. 7 标准质粒的实时荧光定量 PCR 检测

模板为已 鉴定好的 标准质粒p MD19 - T Simple - HA,计算其拷贝数,用DEPC处理水将标准质粒稀释成1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 ×103拷贝/μL。在20 μL反应体系中加Eva Green预混液10 μL,H1、H2引物各0. 2 μL,模板2 μL,用DEPC处理水补足20 μL。扩增条件: 95 ℃ 3 min; 95 ℃25 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共40个循环。熔解条件: 95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s。绘制标准质粒扩增曲线、标准曲线以及熔解曲线。

1. 8 实时荧光定量 PCR 方法的评价

1. 8. 1敏感性将稀释成1 × 108、1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102、1 × 101拷贝 /μL浓度梯度的标准质粒,按1. 6中的反应体系和反应条件进行扩增,检测该方法的敏感性。

1. 8. 2特异性以按1. 4方法制备H3N8亚型EIV、H7N7亚型EIV、EIAV、EAV、EHV的c DNA作为模板,按1. 6中的反应体系和反应条件进行扩增,检测该方法的特异性。

1. 8. 3重复性选择高、中、低不同浓度的H3N8亚型EIV的c DNA作为模板,连续3次进行反应,每次各浓度做3个平行管,计算试验内以及试验间Ct的变异系数( CV) ,检测该方法重复性。

2 结果

2. 1 标准质粒 p MD19 - T Simple - HA 鉴定结果

经1% 琼脂糖凝胶电泳分析,目的条带大小为192 bp,与预期结果相符 ( 见图1 ) 。测序结果与HA基因序列( EU794559. 1) 的同源性为100% 。

2. 2 标准曲线

以1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 ×103拷贝/μL的标准质粒作为模板进行扩增,得到扩增曲线( 见图2) 和熔解曲线( 见图3) 。由图3可见,在Tm值为81 ℃出现特异性的熔解峰。然后根据标准质粒拷贝数浓度的对数与Ct值的关系得到标准曲线( 见图4) ,其相关系数为0. 994,扩增效率达到103. 7% ,表达式为Y = - 3. 237 lg X + 39. 54。

2. 3 敏感性

将1 × 108、1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 ×103、1 × 102、1 × 101拷贝/μL的标准质粒p MD19 - TSimple - HA进行扩增,即得到灵敏度检测的扩增曲线,见图5。

M. DL - 2 000 Marker ; 1. 空白对照; 2. p MD19 - T Simple - HA ; 3. EIV c DNA。

结果表明,该方法最低检测限为10拷贝/μL。

2. 4 特异性

将H3N8亚型EIV、H7N7亚型EIV、EIAV、EAV、EHV的c DNA标准质粒分别作为模板进行扩增,即得到特异性扩增曲线,见图6。H3N8亚型EIV和标准质粒有扩增曲线,其他病毒无扩增曲线,该方法具有良好的特异性。

2. 5 重复性

选择高、中、低不同浓度的EIV c DNA分别进行3次重复试验,每次各浓度做3个平行管,得到组内以及组间试验的变异系数,见表1。

由表1可以看出,变异系数均小于10% ,表明该方法具有良好的重复性。

3 讨论

Q. Michelle等[9]采用SYBRGreen Ⅰ染料法建立了荧光定量RT - PCR检测EIV方法,根据EIV M基因设计了1对特异性引物对EIV的DNA进行扩增。SYBRGreen Ⅰ 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料,SYBRGreen Ⅰ只与双链DNA结合才能发出荧光,荧光信号与双链DNA分子数成正比,随着扩增产物增加而增加,荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量,但是其存在荧光背景高,特异性低。戴伶俐等[10]针对H3N8亚型EIV HA基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条Taq Man荧光探针,建立了Taq Man荧光定量PCR方法,但是这个方法操作繁琐,成本较高。Eva Green是最近新出现的绿色荧 光核酸染 料,它有很多 优点: 首先,Eva Green有良好的水解稳定性和热稳定性,大大降低了常规操作中存在的不便; 第二,Eva Green本身没有荧光, 但和ds DNA结合后能发出高亮度的荧光,这种特性使其特别适合于实时定量PCR的应用; 第三,和广泛使用的SYBRGreen Ⅰ 相比,Eva Green对PCR的抑制更小,更不容易产生非特异性扩增; 第四,成本较低。

笔者针对H3N8亚型EIV HA基因高度保守序列建立了Eva Green实时荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法具有特异性好、敏感性高、重复性强等优点; 因此,Eva Green实时荧光定量PCR方法有望成为新的马流感病原诊断方法。

摘要：为了特异性地检测H3N8亚型马流感病毒,试验根据H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA基因特异保守序列设计1对引物,建立了检测H3N8亚型EIV的Eva Green实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价。结果表明:该方法能特异性地扩增H3N8亚型EIV,而对H7N7亚型EIV、马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马疱疹病毒均无特异性反应;最低检测限度能达到10拷贝/μL;并且该方法具有良好的重复性。说明Eva Green这种新型荧光染料可以敏感有效地检测EIV,可用于马流感的诊断。

禽流感检测技术的研究进展 第6篇

1887年, 意大利首次发现禽流感, 是世界动物卫生组织规定的A类传染病, 中国也已将此病纳入一类传染病[1]。禽流感是由禽流感病毒 (AIV) 引起的一种禽类传染病, 鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽均可感染, 发病情况差别较大, 有的出现急性死亡, 有的无症状带毒。根据病毒核蛋白与基质蛋白的抗原性及其基因特性的不同, 流感病毒可分为A、B、C型。禽流感病毒属于A型流感病毒, 可感染人、马和猪及其他哺乳动物, 家禽和野生禽类, 禽流感一旦暴发往往给养禽业带来毁灭性的打击, 并且严重威胁人类健康。因此, 建立一种快速、高效的检测方法是预防禽流感的重要途径。

二、禽流感流行病学概括

高致病性禽流感主要病毒亚型为H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N1、H7N3、H7N4和H7N7。其中HPA的主要特征是突然死亡和高死亡率, 可以导致感染禽类的大量死亡。1983年美国泽西州、弗吉尼亚州和宾夕法尼亚州暴发禽流感, 共计1250万只家禽被捕杀;1995年墨西哥发现的低致病性H5N2亚型流行株突变成高致病力毒株, 波及12个州, 共淘汰1800万只鸡, 封锁3200万只鸡, 1.3亿只鸡被紧急接种疫苗;2003年荷兰暴发了H7N7亚型的高致病性禽流感, 大约有3000多万只禽类被捕杀;2003年底至2004年初, 越南、泰国、韩国和中国等10多个国家相继暴发H5N1禽流感, 在几个月的时间里, 共有一亿多禽类死于此种疾病或是被捕杀。

1997年我国香港地区相继有18人感染H5N1病毒, 其中6人死亡, 此次感染人的病毒与香港鸡场暴发的HPAIV密切相关。2003年我国香港再次发生H5N1直接感染人事件, 感染2例, 1例死亡。2003年荷兰Gelderland省暴发高致病性禽流感H7N7, 此次AIV暴发中确认的83例, 感染者大多数是兽医和农场工作人员。从1例死于急性呼吸窘迫症的患者体内分离到H7N7病毒, 未发现其他呼吸道病原。特别是2003年12月以来, 越南、韩国和日本等亚洲国家先后暴发了大规模H5N1高致病性禽流感, 在整个流行期间, 越南共有22人确诊感染了H5N1高致病性禽流感, 其中15人死亡, 泰国12人感染, 其中8人死亡, 在越南还出现了人与人之间传染禽流感的疑似病例。2007年, 印度尼西亚再一次暴发了H5N1高致病性禽流感感染人事件, 死亡人数高达64人。AIV作为是否可有引起人类流感大暴发及其对人类健康的潜在威胁[2]是值得研究的热点问题。

三、禽流感检测技术

1. 病毒的分离鉴定

在无菌条件下采集病料, 常规处理后接种9~10日龄的鸡胚, 收取尿囊液, 测定其血凝活性, 若结果是阴性则继续盲传2~3代。如有血凝活性, 则应通过血凝抑制试验来确定分离的病毒是禽流感病毒、新城疫病毒还是禽腺病毒, 如果抗禽流感的血清能抑制血凝现象的话, 那样就证明有禽流感病毒存在。病毒分离鉴定法对禽流感的诊断准确性高, 但操作程序繁琐, 耗时费力, 因此在临床诊断上一般不采取这种方法。

2. 免疫学诊断技术

(1) 琼脂扩散实验。其原理是利用可溶性抗原与抗体特异性结合, 在琼脂中扩散形成浓度梯度来检测AIV群特异性血清抗体的一种试验方法。禽流感琼脂扩散试验简单易行, 既可定性又可定量, 但总体而言此法在检测禽流感抗体水平上的敏感度、准确度较低, 易出现假阳性。

(2) 神经氨酸酶抑制实验 (NIT) 。NIT主要用于禽流感病毒的亚型鉴定, 其依据A型流感病毒的表面抗原特性, 特别是神经氨酸酶的特性来鉴定流感病毒。

(3) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 。用酶标记抗原或抗体, 通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法。本法具有特异、快速、敏感、微量的特点, 因此, 本法也常用于大批样品和血清学检疫。目前, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所已经建立了一系列ELISA方法, 如建立了禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术、禽流感间接ELISA诊断试剂盒、禽流感DotELISA方法等。

(4) 病毒中和试验。病毒中和试验只有在抗体与病毒粒子上表面抗原相一致, 特别是和吸附到宿主细胞上的病毒一致时, 才能取得满意结果。其敏感性、特异性、检出率相当高, 但操作繁琐, 费时耗力, 由于特异性高, 所以很多新的检测方法都以这个方法作为标准来衡量。

(5) 血凝 (HA) 试验和血凝抑制 (HI) 试验。HA和H试验是诊断AIV和血清样品检疫中最常用的方法之一。由于家禽血清中存在着一些非特异性血凝抑制因子, 在HI试验中常会造成一定数量的假阳性, 因此进行HI试验前, 血清样品除了需灭活外, 还应该用高碘酸钠除去非特异性血凝抑制因子。

3. 分子生物学检测

聚合酶链反应 (PCR) 、反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 、核酸探针和荧光PCR技术是应用分子生物学技术, 以禽流感病毒RNA为检测目标所建立的一种快速检测诊断技术, 已成功的应用于禽流感病毒的基因检测和分子流行病学调查。我国最新建立的禽流感病毒荧光RT-PCR诊断试剂盒已获得新兽药证书。除了上述已在常规实验室普遍应用的检测方法外, 核酸依赖扩增技术 (NASBA) 以及基因芯片等基因诊断技术也在禽流感检测中发挥作用。

四、结语

控制禽流感需要采取多方面的措施, 包括疫苗接种, 严格的生物安全措施以及建立快速、高效、特异性高的诊断方法。尽管各国科研工作者已经建立了多种诊断禽流感病毒的方法, 但是目前尚无一套固定成熟的防治方法。

参考文献

[1]甘孟侯.禽流感[M].3版.北京:中国农业出版社, 2010:122-141.

禽流感检测方法 第7篇

1 材料

1.1 免疫鸡群

选择存栏5 000只以上的蛋鸡场为试验鸡场。试验鸡群选择20日龄以内未免疫的禽流感母源抗体为23以下的健康雏鸡群。

1.2 疫苗

随机抽取招标采购各厂家生产的禽流感灭活疫苗, 其中H5N1 (Re-1) 灭活疫苗代号为A, H5N28株灭活疫苗代号分别为B、C、D、E、F、H、G。

1.3 诊断液

哈尔滨兽医研究所生产的禽流感H5抗原, 批号20050120;禽流感H5阳性血清, 批号为20050120。

1.4 试验器材

为GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术HI方法所需器材。

2 方法

2.1 疫苗

由辽宁省重大动物疫病应急中心随机抽样提供给试验鸡场。每个鸡场禽流感免疫使用同一厂家生产的禽流感灭活苗。各试验群采用同一免疫方案, 首次免疫14日龄, 首免后21 d进行加强免疫, 第3次免疫于开产前进行。

2.2 免疫剂量

首次免疫剂量为0.3 ml/只, 第2次免疫剂量为0.5 ml/只, 第3次免疫剂量为0.5 ml/只。

2.3 免疫方法

采用皮下注射。

2.4 样品采集及采集时间

按规定采血, 分离血清, 检测免疫抗体。每次采血无论鸡群大小, 一律在鸡舍4角采30只鸡血样。首免、二免采样均于免疫后21 d进行, 第3次采样根据情况确定。

2.5 抗体检测方法

抗体检测用GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术HI方法。

2.6 抗体合格标准

检测用同一批号抗原, 由同一化验员检测。免疫抗体达≥4Log2为合格。

3 结果

禽流感灭活疫苗免疫检测结果见表1。

4 讨论与小结

4.1

本试验结果证明, 禽流感灭活疫苗H5N1 (Re-1株) 的免疫效果明显好于H5N28株灭活疫苗。A样品H5N1 (Re-1株) 一次免疫后的抗体滴度≥26的达72.7%, H5N28株灭活疫苗的7个样品中, 一次免疫后免疫抗体滴度≥26的只有B样品达到78.2%, 其余样品抗体滴度≥26的均在8.8%以下。

4.2

从试验结果可看出, C、D、E、F、G、H等样品均为H5N28株灭活疫苗, 其一次免疫和二次免疫的间隔时间均为26 d, 经过二次免疫后, 各样品的抗体滴度≥26的数量均由8.8%以下提高到74%~90%的高水平。可见, 灭活疫苗的加强免疫对提升免疫效果有极为重要的意义。

4.3

样品B、C、D、E、F、G、H均为H5N28灭活疫苗, B样品首次免疫后抗体滴度≥26的达到78.2%, 二次免疫后抗体滴度≥26的为51.6%, 抗体滴度≥26的数量下降了26.6%, 而样品C、D、E、F、G、H首次免疫后抗体滴度≥26的均在8.8%以下, 二次免疫后样品C、D、E、F、G、H抗体滴度≥26的数量均上升到74%~90%的高水平。样品B与样品C、D、E、F、G、H的不同点除了不是同一鸡群外, 最大的差异是样品B首次免疫与二次免疫间隔时间为42 d, 样品C、D、E、F、G、H首次免疫与二次免疫间隔时间均为26 d。试验结果说明, 灭活疫苗的第2次加强免疫与首次免疫的间隔时间, 对免疫效果有很重要的影响。加强免疫与首次免疫间隔时间15~21 d为最佳, 间隔时间过长相当于单次免疫效果。目前, 很多养殖户禽流感灭活疫苗首次免疫与加强免疫的时间间隔在1个月以上甚至达3个月之多, 这种做法会明显地降低免疫效果。

4.4

样品C和样品E二次免疫后7个月检测抗体滴度≥26的分别为12.5%和1.8%, 说明蛋鸡群产蛋前禽流感灭活疫苗只进行二次免疫, 在产蛋高峰期, 鸡群对禽流感不具抵抗力。

4.5

样品A H5N1 (Re-1) 三次免疫后4个月检测抗体滴度100%高达28~211, 根据抗体消长规律推测, 正常情况下, H5N1 (Re-1) 三次免后具有6个月的保护力, 这对养殖户具有重要参考价值。蛋鸡开产前按程序进行三次免疫是必要的, 也是科学的。

4.6

本试验在2005年黑山禽流感疫情发生前已经完成, 锦州的某些养殖户采用H5N28株灭活疫苗经过二次免疫的鸡群, 在有效保护期内的鸡群经历黑山禽流感疫情得到了有效保护, 从另一侧面说明禽流感灭活疫苗按程序进行科学规范地免疫是可以抵抗野毒攻击的。

摘要：本试验用H5N1 (Re-1株) 灭活疫苗和H5N28株灭活疫苗对蛋鸡群进行免疫效果跟踪检测, 结果表明H5N28株灭活疫苗首次免疫后21d, 只有1个样品抗体合格率达到93.75%, 其余样品抗体合格率均在59%以下。H5N1 (Re-1株) 灭活疫苗首次免疫后21d, 抗体合格率93%, 首次免疫后21d抗体滴度≥26的达72.7%, 二次免疫后21d抗体滴度≥26的达93.3%, 三次免疫后4个月抗体滴度100%达到28～211, 本试验对指导养鸡户的禽流感免疫具有重要价值。

禽流感检测方法 第8篇

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集昆明、玉溪、大理等地州98个养殖场出现不同程度呼吸道症状鸡群的喉气管、脾脏和肺脏98份(每份样品包括发病鸡场的病死鸡3~5只的上述组织样品混合物)。

1.2 样品处理

取上述样品组织剪碎,按照1∶10比例加入无菌生理盐水,研磨匀浆后反复冻融3次,3 000 r/min离心10 min;取上清液,备用。

1.3 核酸提取

按照RNA/DNA isolation Kit试剂盒说明书,使用Mag MAXTMExpress系统的1836-V2程序分别提取组织上清液、H9病毒(阳性对照)、健康鸡组织上清液(阴性对照)的总RNA,加RNA酶抑制剂,-80℃保存,备用。

1.4 H9亚型检测

参照参考文献[6]中的方法合成H9亚型禽流感检测引物,引物序列:H9A 5'-TGTAAGTAARTAY-GCATTTGG-3'和H9B 5'-CTCGCTGAATTCAT-GRTYAA-3',扩增大小为316 bp的H9基因。

1.5 H9基因扩增

参照参考文献[7]中的方法合成H9亚型禽流感HA基因测序引物,引物序列:H9F 5'-CACCATG-GAAACAATATATCACTAMT-3'和H9R 5'-CTATATACAAATGTTGCRYCT-3',扩增大小为1 687 bp的H9基因。

1.6 特异性分析及克隆

取PCR检测的阳性样品,用H9测序引物扩增代表性毒株,产物纯化,克隆T载体。

1.7 重组质粒构建和鉴定

取10μL克隆反应物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布Amp抗性平板过夜,挑取孤立的白色菌落,采用PCR方法鉴定阳性菌落。对增殖培养后的阳性菌落提取质粒,再经PCR方法鉴定重组质粒,-20℃保存,备用。

1.8 序列分析

将阳性重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。采用DNAMAN Version 5.2.2软件进行序列比对和系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 云南省家禽H9亚型禽流感检测

从云南省不同地州的98个养殖场出现不同程度呼吸道症状的鸡群中分别采集喉气管、脾脏和肺脏等,进行H9亚型禽流感检测,结果28个养鸡场出现H9亚型禽流感核酸阳性,阳性率为28.6%,检测情况见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.阳性对照;2.阴性对照(正常鸡组织悬液);3.检测样品。

2.2 HA基因扩增及重组质粒的构建

对检测得到的2株H9亚型禽流感病毒(分别命名为ACKYNSL01、ACKYNSL12)扩增HA全基因,获得大小为1 687 bp的片段,与预期结果吻合,扩增结果见图2。HA基因克隆反应物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板培养,随机选取3个孤立菌落进行PCR鉴定,阳性菌落增殖培养后提取重组质粒,质粒鉴定结果见图3。

M.DL-2 000 Marker;1~2.HA基因扩增产物。

M.DL-2 000 Marker;1.RV-M/H9R引物;2.H9F/M13-47引物;3.N2F/T7R引物。

2.3 序列分析及比对

自Gen Bank数据库中下载国内外已知的H9亚型禽流感的HA基因,采用DNAMAN Version 5.2.2软件进行序列比对和系统发育分析。结果表明,分离获得的2株云南省H9亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.5%和98.7%,均属于欧亚分支ACKBJ194分支(分支Ⅲ);与广东ACKGDCYH122011毒株之间的核苷酸同源性为97.6%,与广西ACKGXQCR102011毒株之间的核苷酸同源性为97.9%~98.1%,与ADKHY43997(分支Ⅰ)的核苷酸同源性为82.5%~82.7%,与AQUAILHKG197(分支Ⅱ)的核苷酸同源性为85.8%~86.6%,与疫苗株ACKSD696的核苷酸同源性为90.1%~90.3%,见图4;与广东ACKGD-CYH122011、广西ACKGXQCR102011毒株之间的氨基酸同源性均为97.5%~98.0%,与ADKHY43997(分支Ⅰ)毒株之间的氨基酸同源性为87.0%~87.7%,与AQUAILHKG197(分支Ⅱ)毒株之间的氨基酸同源性为88.8%~89.7%,与疫苗株ACKSD696之间的氨基酸同源性为91.7%~92.4%,见图5。2株云南省H9亚型禽流感病毒HA基因编码蛋白裂解位点氨基酸序列均为RSSR↓GLF,具有低致病性禽流感病毒分子特征。

3 讨论

呼吸道疾病已成为危害我国养禽业的主要疾病之一,也是广大养殖户最为关心的问题,主要表现为喷嚏、呼噜、气喘、甩鼻等呼吸道症状。以呼吸道症状为主的疾病包括新城疫、禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、支原体等。对云南省不同地州的98个养殖场出现不同程度的呼吸道症状鸡群进行H9亚型禽流感检测,其中28个养鸡场出现H9亚型禽流感核酸阳性,阳性率为28.6%,说明云南省H9亚型禽流感在家禽呼吸道疾病感染中所占比重比较大。

H9亚型禽流感病毒在我国广泛存在,是影响家禽养殖业的主要病原之一。Y.J.Guo等[8]将H9亚型禽流感病毒分为北美和欧亚两大分支,而欧亚分支又进一步分为3个亚分支,分别为类Ck BJ1/94、类Qa HKG1/97和类Ck Kor323/96亚分支。系统进化分析结果表明,2014年云南省地方流行毒株ACK-YNSL01和ACKYNSL12与类Ck BJ1/94亚分支代表株亲缘关系较近,与其他两个亚分支代表株亲缘关系较远,说明云南省地方流行毒株仍为欧亚分支的类Ck BJ1/94亚分支,HA基因裂解位点氨基酸序列为RSSR↓GL,不存在多个连续碱性氨基酸插入,具有低致病性病毒分子特征,这与胡媛媛等[9]、卢建红等[10]和李建伟等[11]的研究结果一致。

呼吸道疾病的防控应该针对不同的发病原因,采取相应的综合防控措施。H9亚型禽流感病毒病的防控,除了根据养殖场检测结果有针对性地进行疫苗免疫外;同时还要加强饲养管理,减少冷应激,加强通风,确保舍内空气质量良好,同时降低饲养密度。由于禽流感病毒变异的速度快,因此应该对养殖场禽流感病毒变异进行持续监测,为禽流感防控及疫苗毒株更新提供试验依据。

参考文献

[1]OLSEN B,MUNSTER V J,WALLENSTEN A,et al.Global patterns of Influenza A virus in wild birds[J].Science,2006,312(5772):384-388.

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[3]GUAN Y,SHORTIDGE K F,KRAUS S,et al.Molecularcharacterization of H9N2 Influenza viruses:were they the donors of the“internal”genes of H5N1 viruses in Hong Kong?[J].PNSA,1999,96(16):9363-9367.

[4]KAGEYARMA T,FUJISAKI S,TAKASHITA E,et al.Genetic analysis of novel avian A(H7N9)Influenza viruses isolated from patients In China,February to April 2013[J].Euro Surveill,2013,18(15):20453.

[5]QI W B,ZHOU X,SHI W,et al.Genesis of the novel human-infecting Influenza A(H10N8)virus and potential genetic diversity of the virus in poultry,China[J].Euro Surveill,2014,19(25):20841.

[6]张应国,宋建领,胡媛媛,等.禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立[J].中国兽医科技,2005,35(8):600-604.

[7]宋建领,叶丛华,田建国,等.云南2008~2009年H9N2亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因序列分析[J].畜牧与兽医,2011,43(3):48-53.

[8]GUO Y J,KRAUSS S,SENNE D A,et al.Characterization of the Pathogenicity of members of the newly established H9N2 Influenza virus lineages in Asia[J].Virology,2000,267(2):279-288.

[9]胡媛媛,张文东,宋建领,等.2013年云南省禽流感病毒H9N2亚型监测及其血凝素基因序列分析[J].中国预防兽医学报,2015,37(1):10-14.

[10]卢建红,刘秀梵,邵卫星,等.H9N2亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析[J].微生物学报,2003,43(4):434-441.

美国发明针对流感的基因检测法 第9篇

据美国媒体报道, 大多数流感诊断方法都是在流感症状出现后通过找到病毒或免疫系统产生的抗体来确诊。新方法则通过在尚未发病的人身上辨别与免疫有关的基因的状态来确诊。

参与研究的杜克大学研究人员杰弗里金斯伯格说, 这一检测法旨在发现负责免疫反应的基因的激活状态, 因为这种状态可反映人体的感染情况。新方法只需检测10微升指血。尽管这种方法还不能区分病毒种类, 但它已能辨别细菌感染与病毒感染。

金斯伯格说, 这种方法可作为急诊室或普通医生的有效诊疗手段, 它不仅能帮助医生更快捷准确地诊断出患病情况, 还能提供重要信息, “帮助我们了解病毒传播途径, 有助于我们更好地应对流行病”。

据报道, 利用新技术, 研究人员的诊断准确率达到了95%。他们正在测试这一方法是否适用于甲型H1N1流感患者。 (科学时报)

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美国找到二氧化碳捕捉新方法

近期, 美国劳伦斯-利弗莫尔国家实验室的研究人员利用离子液体作为二氧化碳吸收剂, 开发出一种更清洁、稳定和高效的捕获二氧化碳新方法。该研究成果刊登在最新一期的《Chem Sus Chem》杂志上。