趋化作用范文

趋化作用范文（精选7篇）

趋化作用 第1篇

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年SD大鼠30只, 雌性, 体重180~220 g, 由贵阳医学院实验动物中心提供。随机分为三组, 每组10只, 第一组正常对照组, 第二组哮喘模型组, 第三组红霉素干预组。

1.2 主要实验试剂和器材

1.2.1 试剂

卵蛋白 (ovalbumin egg, OVA) 购自美国Sigma公司;氢氧化铝由贵阳医学院免疫实验室提供;白百破疫苗由贵州省防疫中心提供;注射用乳糖酸红霉素:大连美罗大药厂 (产品批号:20040404) 。Eotaxin试剂盒购于大连泛邦生物工程有限公司。

1.2.2 仪器

益鸟牌超声雾化器402型 (上海合力医疗器械厂) ;磁极80-2离心沉淀器 (上海手术器械厂) ;光学显微镜 (Olympus) 。

1.3 实验方法

1.3.1 哮喘模型的构建

参照文献[7]将第二及三组大鼠于第1天和第8天腹腔注射10%OVA 100 mg、氢氧化铝100 mg及白百破疫苗1 m L。第15天开始将大鼠 (每次8~10只) 放入自制的密闭雾化箱内 (60 cm×40 cm×30 cm) , 每天超声雾化吸入1%O VA (OVA 300 mg+NS 30 m L) 30 min, 持续7 d;以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、打喷嚏、抓耳、点头呼吸及站立不稳等表现视为激发成功。第三组动物于每日激发前半小时灌胃予红霉素180mg/ (kg·d) [8] (溶解于1 m L 5%的葡萄糖水中) ;第一组动物用生理盐水代替OVA, 2周后超声雾化吸入生理盐水30 min, 每日雾化吸入前半小时灌胃予5%的葡萄糖水1 m L, 连续7 d。第二组于每日激发前半小时灌胃予5%的葡萄糖水1 m L。处理大鼠前1 h再雾化1次, 处死、取材并作相应测定。

1.3.2 肺组织病理分析

将右肺浸入10%甲醛溶液中固定12~24 h。取右肺中叶组织, 常规石蜡包埋、切片, 用于HE染色、光镜观察。

1.3.3 病理形态学积分方法

根据肺充血、肺水肿、肺出血、支气管黏膜变性、支气管黏膜坏死脱落、支气管肺炎、间质性肺炎、肺组织坏死、肺脓肿、肺纤维化、肺泡上皮增生、肺泡腔内巨噬细胞、血管内皮增生、局灶性肺气肿改变, 按程度“无、轻、中、重”分别计“0、1、2、3分”, 然后累计总分。

1.3.4 血清和BALF的采集以及BALF细胞计数与分类

大鼠末次激发后, 股动脉放血处死。全血3 000 r/min离心10 min, 留取血清保存在-70℃冰箱留作eotaxin的测定。打开胸腔, 结扎右侧肺门, 剥离左肺。用生理盐水灌洗左肺每次3 m L, 共3次, 回收BALF, 回收率为70%以上。取约50μL置于细胞计数板上, 作细胞总数计数, 其余以3 000 r/min离心10 min, 将上清液分装并保存在-70℃冰箱留作eotaxin的测定。离心沉渣涂片, Wright-Giemsa染色油镜下行嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞分类计数。

1.3.5 eotaxin在血清和BALF中的浓度测定

采用双抗夹心ELISA法, 严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学处理

计量数据以均数±标准差 (±s) 表示, 应用SPSS 11.5软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析 (ONE WAY ANOVA) , 方差齐者用最小有意义差异t检验 (LSD-t检验) , 不齐者直接用Dunnett’s T3检验;相关性检验采用Pearson直线相关性分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF细胞总数及分类计数结果

哮喘组BALF中细胞总数、EOS绝对值和EOS占细胞总数的百分比 (EOS%) 均显著高于对照组 (P<0.01, F值分别为87.183、485.331及685.677) ;EM组细胞总数、EOS绝对值和EOS%显著低于哮喘组 (P<0.01) , 但仍高于对照组 (P<0.01) 。哮喘组巨噬细胞比例较对照组显著下降 (P<0.01, F值为112.727) , EM组巨噬细胞比例显著升高 (P<0.01) , 但仍明显低于对照组 (P<0.01) 。哮喘组淋巴细胞及中性粒细胞比例与对照组比较显著升高 (P<0.01, F值分别为75.875及74.208) , EM组显著低于哮喘组 (P<0.01) , 但仍高于对照组 (P<0.01) 。见表1。

2.2 肺组织病理改变

光镜下空白对照组肺组织结构正常, 肺泡腔内有个别炎症细胞渗出, 支气管壁及周围可见极少量炎症细胞。哮喘组肺组织结构轻度破坏, 支气管上皮中度变性、坏死、脱落, 支气管壁明显增厚、支气管壁及周围, 血管周围可见大量炎症细胞浸润, 肺泡腔内有较多的炎症细胞浸润, 肺泡间隔增厚, 组织黏膜充血水肿。红霉素组肺组织结构正常, 肺泡腔及支气管周围的炎症改变较哮喘组明显减轻。见图1。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组和哮喘组比较, P<0.01

A:空白对照组 (HE×100) ;B:哮喘模型组 (HE×100) ;C:红霉素干预组 (HE×100)

2.3 组织病理形态学积分

卵蛋白致哮喘后, 病理形态学积分明显升高, 哮喘模型组与对照组相比, 有显著差异 (P<0.01, F=29.11) 。EM组低于模型组 (P<0.05) , 但仍高于对照组 (P<0.05) 。见表2。

2.4 BALF中eotaxin浓度

哮喘组eotaxin浓度显著高于对照组 (P<0.01) ;EM组eotaxin浓度低于哮喘组 (P<0.05) , 但高于对照组 (P<0.05) 。见表3。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组和哮喘组比较, P<0.05

2.5 BALF中eotaxin水平与EOS数量之间的相关性

将红霉素组和哮喘组大鼠合并计算, BALF中eotaxin浓度与EOS数量之间的相关系数为0.553 (r=0.553) , P<0.05, 说明eotaxin水平与EOS数量之间呈显著正相关。见图2。

2.6 血清中eotaxin浓度

哮喘组eotaxin浓度显著高于对照组 (P<0.01) ;红霉素组eotaxin浓度低于哮喘组 (P<0.05) , 但高于对照组 (P<0.05) 。见表4。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与哮喘组、对照组比较, P<0.05

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与哮喘组、对照组比较, P<0.05

3 讨论

本实验采用了目前国内已经比较成熟的大鼠哮喘动物模型。大鼠的致敏采用低剂量卵白蛋白, 并用氢氧化铝和白百破疫苗作为免疫佐剂行腹腔注射, 2周后超声雾化吸入卵蛋白进行激发, 诱发气道过敏性炎症。建立的大鼠模型具有哮喘发作特有的症状, 如明显的呼吸困难、站立不稳以及口唇发绀等表现;结合实验动物的病理表现显示哮喘动物模型建立成功。

正常情况下, 肺组织内仅有少量EOS存在, 但哮喘时EOS数量显著增加, 表明存在某种选择性调节EOS生成和聚集的分子机制, 这已在动物哮喘模型中用免疫组化方法得到证实[9]。趋化因子是一类由中性粒细胞、单核细胞等多种细胞分泌产生并具有趋化活性的细胞因子[10]。eotaxin是一种高度选择性EOS趋化因子。eotaxin的特异性受体CCR-3主要位于EOS细胞膜, 在其他白细胞较少见[11], 因此, eotaxin对嗜酸粒细胞的趋化具有高度特异性[12]。本实验观察到哮喘大鼠BALF中eotaxin水平显著高于正常对照组, 而且eotaxin水平与EOS计数呈显著正相关。表明eotaxin在哮喘嗜酸细胞性炎症过程中起着重要的作用。血中eotaxin水平亦显著高于正常对照组。因此, 抑制炎性细胞、组织细胞表达eotaxin及阻止eotaxin趋化和激活EOS可能是哮喘防治的一个新措施。

趋化作用 第2篇

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

C57BL/6小鼠 (雌雄各10只, 体重10.25~15.70 g, 平均12.55 g) 由第四军医大学动物实验中心提供, ICAM-1、IRE1、GRP78、MMP9一抗购自江苏碧云天生物技术研究所;鼠抗兔二抗、二甲亚砜 (DMSO) 、胰蛋白酶均购自Sigma公司;DMEM低糖培养液购自美国HycLone公司;小牛血清购自杭州四季青公司;RPMI1640 (美国GIBCO公司) ;细胞裂解液 (碧云天, 上海) ;ELISA试剂盒 (第四军医大学免疫教研室) 。

1.2 原代成骨细胞的制备和培养

原代成骨细胞的制备将20只3 d龄新生C57BL/6小鼠投入盛有75%乙醇的容器内消毒5~10 min, 取出置于消毒培养皿中。取出颅盖骨, 去除骨膜、血管及周围结缔组织, PBS冲洗。将洗净的颅盖骨剪碎, 置于培养瓶中, 加入0.25%的胰酶预消化5 min, 去除消化液, 加入0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶进行消化20 min, 镜下观察到细胞收缩变圆时弃去消化液, 加入培养液以终止胰蛋白酶的作用。用滴管吹打壁上的细胞, 使其完全脱落并分离。根据实验需要按5×105个/m L接种于培养板或培养瓶中。待细胞融合后, 换用无血清的DMEM培养液培养24 h, 使细胞同步化, 然后即可进行分组实验。

1.3 细胞分组及处理

取对数生长期细胞, 以每孔2×105个/m L接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中, 于37℃、5%CO2培养箱中进行孵育, 24 h内细胞达到80%~90%融合后, 用含体积分数0.01%FBS的DMEM孵育细胞24 h, 使细胞同步化。将接种孔分为以下几组: (1) 正常对照组 (control) :在培养液中孵育原代成骨细胞24 h; (2) 趋化素干预组:给予不同浓度的趋化素 (1×10-7mol/L、l×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 后孵育24 h。

1.4 MTT法检测成骨细胞活力的影响

将原代成骨细胞按5×105个/m L接种于96孔板中, 于37℃、5%CO2下培养24 h后吸出孔内培养液, 分别加入上述不同浓度的Chemerin, 对照组加入等量培养液, 每浓度重复8孔。各组细胞孵育8 h后, 弃去培养液, 加入DMEM培养液 (100μL) 和含0.5%MTT的培养液 (10μL) , 37℃、5%CO2的培养箱内孵育4 h后, 弃培养液, 加入100μL的DMSO原液, 振荡10 min, 待结晶完全溶解后拍照, 酶标仪检测各孔OD值 (λ=492 nm) , 记录结果, 实验重复3次。

1.5 ELISA法检测细胞黏附力、MCP-1、E-selection含量表达

原代成骨细胞以1×106个/m L接种于96孔板, 实验分组同上, 将稀释好的包被抗体加入ELISA板, 100μL/孔, 4℃放置48 h。次日, 弃去孔内溶液, 用洗涤缓冲液洗3次, 每次3 min。各组分别加待检样品100μL/孔, 置37℃孵育1 h。然后洗涤。于各反应孔中, 加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度) 100μL/孔, 37℃孵育0.5~1 h, 洗涤。于各反应孔中加入临时配制的3', 3', 5', 5', -四甲基联苯胺 (TMB) 底物溶液100μL/孔, 37℃下处理10~30 min。在ELISA检测仪上, 调至410 nm处, 以空白对照孔调零后测各孔OD值, 若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍, 即为阳性。

1.6 Western印迹法测定IRE1、GRP78蛋白和ICAM-1含量表达

弃去培养液, 用冷PBS轻轻漂洗一遍后, 随即加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂以裂解细胞。收集各组细胞加入细胞裂解液提取总蛋白, 并用Bradford法测定蛋白质浓度, 补充上样缓冲液使总液量为80μL, 再加100μL溴酚蓝染液煮沸4 min。然后各取10μL样品, SDS-PAGE凝胶进行电泳分离, 半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜, 封闭, 洗膜, 加入1∶600稀释的兔抗大鼠IRE1、GRP78、ICAM-1一抗, 4℃条件下保存过夜, 用洗膜液漂洗后加入1∶1 000稀释的二抗, 摇床1 h, TBST冲洗3遍, 每次5min, 加ECL荧光液显色, 上机检测。用目标条带与内标条带 (β-actin) 的积分吸光度值 (Integrated absorbance, IA) 的比值的百分率表示IRE1、GRP78和ICAM-1的表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析, 所有实验数据均以均数±标准差 (mean±SD) 表示, 采用t检验进行组间比较, P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 MTT法检测成骨细胞活力

各组原代成骨细胞处理后酶标仪检测表明:不同浓度的趋化素干预组 (1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 与对照组比较, 细胞活力未见明显降低, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见图1。

1为对照组;2为1×10-7mol/L浓度趋化素组;3为1×10-6mol/L浓度趋化素组;4为1×10-5mol/L浓度趋化素组;与对照组相比较, P>0.05

2.2 ELISA法检测MCP-1含量表达

与对照组相比, 趋化素干预组随着浓度 (1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 升高, MCP-1的表达升高 (P<0.05) , 且在趋化素浓度为1×10-5mol/L时作用最为明显, 提示趋化素呈浓度依赖性上调成骨细胞MCP-1的表达, 见图2。

2.3 ELISA法检测E-selection含量表达

与对照组相比, 趋化素干预组随着浓度 (1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 升高, 骨细胞E-selection的表达明显升高 (P<0.05) , 且在趋化素浓度为1×10-5mol/L时作用最为明显, 较1×10-7mol/L和1×10-6mol/L浓度趋化素均有统计学差异 (P<0.05) , 见图3。

1为对照组;2为1×10-7mol/L浓度趋化素组;3为1×10-6mol/L浓度趋化素组;4为1×10-5mol/L浓度趋化素组;与对照组相比较, *P<0.05;与1×10-7mol/L浓度趋化素组比较, #P<0.05;与1×10-6mol/L浓度趋化素组比较, &P<0.05

1为对照组;2为1×10-7mol/L浓度趋化素组;3为1×10-6mol/L浓度趋化素组;4为1×10-5mol/L浓度趋化素组;与对照组相比较, *P<0.05;与1×10-7mol/L浓度趋化素组比较, #P<0.05;与1×10-6mol/L浓度趋化素组比较, &P<0.05

2.4 趋化素对原代成骨细胞ICAM-1表达变化的影响

Western blot结果显示:与对照组相比, 趋化素干预组随着浓度 (1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 升高, ICAM-1的表达升高 (P<0.05) , 且在趋化素浓度为1×10-5mol/L时作用最为明显, ICAM-1的表达最高。见图4。

2.5 趋化素对原代成骨细胞IRE1表达变化的影响

与对照组相比, 趋化素干预组在浓度为 (1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 时均升高, IRE1的表达升高 (P<0.05) , 且在趋化素浓度为1×10-5mol/L时作用最为明显, IRE1的表达最高。但当趋化素浓度为1×10-7mol/L和1×10-6mol/L时, IRE1的表达并无统计学差异 (P>0.05) 。见图5。

1为对照组;2为1×10-7mol/L浓度趋化素组;3为1×10-6mol/L浓度趋化素组;4为1×10-5mol/L浓度趋化素组;与对照组相比较, *P<0.05;与1×10-7mol/L浓度趋化素组比较, #P<0.05;与1×10-6mol/L浓度趋化素组比较, &P<0.05

1为对照组;2为1×10-7mol/L浓度趋化素组;3为1×10-6mol/L浓度趋化素组;4为1×10-5mol/L浓度趋化素组;与对照组相比较, *P<0.05;与1×10-7mol/L浓度趋化素组比较, #P<0.05;与1×10-6mol/L浓度趋化素组比较, &P<0.05

2.6 趋化素对原代成骨细胞GRP78表达变化的影响

与对照组相比, 趋化素干预组随着浓度 (1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L) 升高, GRP78的表达升高 (P<0.05) , 且在趋化素浓度为1×10-5mol/L时作用最为明显, GRP78的表达最高。见图6。

1为对照组;2为1×10-7mol/L浓度趋化素组;3为1×10-6mol/L浓度趋化素组;4为1×10-5mol/L浓度趋化素组;与对照组相比较, *P<0.05;与1×10-7mol/L浓度趋化素组比较, #P<0.05;与1×10-6mol/L浓度趋化素组比较, &P<0.05

3 讨论

内质网应激反应 (endoplasmic reticulum stress, ERS) 以及相应的未折叠蛋白反应 (unfolded protein response, UPR) 涉及整个细胞周期, 贯穿于机体的一系列生理、病理过程和多种疾病之中[5,6]。Zhu Y等[7]通过对传代软骨细胞的低糖性损伤处理发现, 与IRE1相关的p38MAPK信号通路能增强软骨炎症时的关节破坏。IREl是ERS和UPR的三条通路之一, 分子量为100 kDa的一种跨膜蛋白, 具有丝氨酸苏氨酸结构域和核糖核酸内切酶结构域[8]。UPR发生时, IREl腔内结构域与GRP78解离, IRE1寡聚化, 引起自身磷酸化从而激活许多与免疫、炎症和调亡相关的蛋白激酶[9]。炎性反应中多种细胞因子可对骨代谢发挥直接或者间接影响[10], 如TNF-α可抑制成骨细胞分化, 并通过Fas-FasL途径促进成骨细胞凋亡, 以及IL-1、IFN-γ抑制成骨细胞的胶原合成[11]。炎性反应介质的变化也可通过核因子κB受体活化体 (receptor activator of nuclear factor-κB, RANK) -核因子κB受体活化体的配体 (receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL) -骨保护素 (osteoprotegerin, OPG) 轴影响骨代谢[12]。

趋化素 (Chemerin) 是在2007年首次确定的脂肪因子[13], 它既可以通过自分泌途径作用于自身组织, 也可经旁分泌途径募集炎性反应细胞至脂肪组织, 这种双重身份可能使它在炎性反应中扮演重要的角色[14]。人体Chemerin的最主要的受体为ChemR23 (chemokine like receptor1, CMKLR1) , Chemerin-ChemR23系统可趋化单核细胞源性巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞, 向炎性反应部位聚集, 进而加剧炎症反应的发展[15], 另一方面ChemerinChemR23系统可能与免疫炎症因子间存在反馈调节, 促进炎症相关疾病的发生发展。

实验中首先采用不同浓度的Chemerin作用于原代成骨细胞后发现, 加入Chemerin后, 细胞活力未受影响, 随着Chemerin浓度升高, 与正常对照组相比, Chemerin呈浓度依赖性上调MCP-1、E-selection、ICAM-1等炎症因子 (P<0.05) , 同时呈浓度依赖性上调ERS相关指标IRE1、GRP78的表达 (P<0.05) , 说明Chemerin对成骨细胞的影响可能和内质网应激反应产生的炎症反应相关, 且在1×10-5mol/L组Chemerin作用最为显著。

趋化因子及其受体与系统性红斑狼疮 第3篇

1 趋化因子及其受体

趋化因子是一类小分子碱性蛋白, 由70～125个氨基酸组成, 分子量6～14kD不等。迄今为止至少已发现50余种趋化因子, 根据其N端半胱氨酸残基的位置和数目可将趋化因子分为4个亚族:C、CC、CXC和CX3C。CC, CXC和CX3C趋化因子有4个保守的半胱氨酸, CC趋化因子前2位半胱氨酸近邻, 而CXC和CX3C趋化因子前2个半胱氨酸间分别间隔1个和3个其它氨基酸。C趋化因子只有2个半胱氨酸, 相当于前三者第2和第4个半胱氨酸的位置。大多数的趋化因子属于CC和CXC两族, 前者有28个成员, 后者包括16个成员趋化因子, 只有XCL1, 2 (Lymphotactinα, β) 和CX3CL1 (fractalkine) 分别是目前所知的C和CX3C类的趋化因子。

趋化因子通过与细胞表面的特异性受体结合发挥相应的生物学作用。趋化因子受体属G蛋白偶联受体, 具有7个跨膜片断, 主要表达于骨髓来源的各白细胞亚群, 同时也表达于上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞等类型的细胞上。趋化因子受体根据其结合的配体不同也分为4个亚家族:C趋化因子受体 (XCR) , CC趋化因子受体 (CCR) , CXC趋化因子受体 (CXCR) 和CX3C趋化因子受体 (CX3CR) 。目前已至少克隆18种趋化因子受体, 其中1种XCR, 10种CCR, 6种CXCR及1种CX3CR。有些趋化因子特异性地与一种受体结合, 例如CXCL12/SDF-1仅与CXCR4结合;而有些趋化因子可以与几种受体结合, 例如CCL5/RANTES可以与CCR1、CCR3和CCR5结合;同样有时一种受体能与数种趋化因子结合, 例如, CCR3可以结合CCL5、CCL7、CCL8、CCL24及CCL26等多种趋化因子, 这种结果使得一种趋化因子可以趋化表达不同趋化因子受体的免疫细胞定向迁移, 而一种免疫细胞也可以为多种趋化因子所招募。有趣的是, 一个细胞在相同的刺激下可同时产生多种不同的趋化因子, 例如单核巨噬细胞在细菌脂多糖的刺激下可产生MCPs、MIPs、RANTES (CC) 、fractalkine (CX3CL1) 和多种CXC族趋化因子分子[1,2,3]。

趋化因子首先作为趋化性介质被发现, 但随着对趋化因子研究的深入, 现在已经认识到趋化因子不但对白细胞具有趋化作用, 而且在免疫细胞和器官的发育、免疫应答过程、炎症反应、病原体感染、创伤修复及肿瘤形成和转移等方面发挥广泛的生理和病理作用[1,2,4]。由于其广泛的细胞来源和生物学效应, 趋化因子在多种炎性和自身免疫性疾病的发生和发展中起着重要的作用。

2 趋化因子及其受体与系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮 (SLE) 是一种可累及多系统、多器官的自身免疫性疾病, 有研究已证实基因和环境因素对疾病的发生有着重要作用, 免疫学异常导致疾病进展和复发。

2.1 趋化因子及其受体基因多态性与SLE发病

基因多态性是指基因组序列上的变异, 通常指基因内含子或调节序列区域碱基的改变, 这一改变一般不影响蛋白质的表型, 但对蛋白质的表达可能存在上调或下调的作用。趋化因子及其受体的基因多态性对本基因控制的趋化因子或受体的产生具有增强或减弱的作用。在SLE发病中有重要作用的趋化因子及受体基因多态性也相应地与SLE疾病易感性或严重性相关。

Lima G等[5]学者发现CCL2/MCP-1 (monocyte chemoattratant protein-1) 基因多态性与SLE遗传易感性相关联, 并且与特异性临床症状、实验室结果相关。Tucci M等[6]学者也发现CCL2/MCP-1启动基因的多态性可诱发狼疮肾炎。CCL5/RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) -28位C/G或G/G基因型较C/C基因型明显增加了儿童SLE的发病[7], CCL5/RANTES启动区-403G/G和-28位C/C的同时存在与SLE的发病相关联, -403G等位基因可能与肾损害相关联[8]。而CCR2和CCR5的基因多态性尽管轻微地促成狼疮肾炎的发生, 但似乎与SLE的易感性无关[9]。CCL7/MCP-3基因的变异极少出现并且与SLE发病无关[10]。

2.2 趋化因子及其受体与SLE的免疫学异常

在自身免疫性疾病中由于淋巴细胞丧失了对自身组织 (抗原) 的耐受性, 以至于淋巴细胞对自身组织出现免疫反应并导致组织的损伤, 其发病机制可能与淋巴细胞的异常活化有关, 自身抗体的形成和免疫复合物的沉积最终导致了组织和器官损伤。T和B淋巴细胞在SLE发生、进展的不同阶段发挥着多种作用[11], 而且B细胞的凋亡可加速SLE的发病[12], 而趋化因子及其受体可参与T、B细胞功能的调节[13], 并且可以通过调控免疫细胞的迁移、分化以维持组织细胞正常免疫功能的平衡。

SLE患者外周血CD4+T细胞Th1/Th2比值可以很好地提示SLE的组织病理学改变[14]。我国学者王晓栋等把SLE组分为Th1/Th2降低组和Th1/Th2升高组, , 发现在临床表现上, Th1/Th2降低组的面部红斑、血管炎发生率明显升高。日本一研究组也发现, Ⅳ型狼疮性肾炎患者中Th1/Th2比值是升高的, 主要以Th1升高为主。这说明不同系统累及的SLE患者其免疫系统紊乱的机制不同, 存在Th1/Th2平衡紊乱的情况有差异[15]。已知一些趋化因子与Th1/Th2平衡相关, 如CCL5/RANTES与Th1细胞免疫应答相关, 而CCL2/MCP-1与Th2细胞相关。它们在SLE患者体内的变化可以间接了解Th1/Th2平衡的状况。在SLE动物模型和患者中CCL5/RANTES和CCL2/MCP-1均有增高, 并参与狼疮肾炎的病理改变。趋化因子受体的表达水平决定趋化因子作用的发挥, 但目前尚未见专门研究趋化因子受体表达异常对Th1/Th2平衡的报道[16]。同时, 亦有研究证实Th1/Th2趋化因子与SLE疾病活动性呈明显的正相关[17]。细胞毒性T细胞 (CTL) 在SLE皮肤损害中发挥重要作用, 而CTL细胞表面可表达CXCL10/IP10的受体CXCR3。CXCL10/IP10与其受体的结合可定向招募细胞毒性T细胞进入靶器官最终造成皮肤损害[18]。Lee HY等学者亦发现CCR4+的调节性T细胞也可能参与SLE致病作用[19]。

B淋巴细胞不仅是抗体分泌细胞的前体细胞, 还具有分泌细胞因子调节抗原提呈细胞和T细胞, 参与次级淋巴器官的发育和生发中心形成等功能。B细胞生物学异常可导致SLE的发生[20]。根据B细胞表面CD5的表达与否, 可将B细胞分为B1细胞和B2细胞两个亚群, 前者可表达CD5。Ishikawa S等[21]学者在动物模型中观察到CXCL13/BLC (B lymphocyte chemoattractant) 在胸腺和肾脏等靶器官中的异位性高表达。CXCL13/BLC的异位表达导致髓样树突状细胞 (myeloid DCs) 在靶器官的浸润。在动物模型中亦观察到外周血DCs增加并分化为产CXCL13/BLC的DCs, 同时B1细胞表达的CXCR5水平增高且较B2细胞优先地向CXCL13/BLC迁移, B1细胞不归巢入腹膜腔而优先地招募入靶器官导致狼疮肾炎的发展。B1细胞亦拥有强大的抗原提呈活性并活化自身反应性CD4+T细胞, 并在狼疮发生发展过程中产生大量的自身抗体。

2.3 趋化因子及其受体与SLE的器官损害

系统性红斑狼疮可有多系统、多器官的损害, 有内脏 (肾脏、中枢神经系统) 受累者预后欠佳。SLE多系统病变的共同病理特征为炎症细胞, 特别是单核细胞和淋巴细胞在受累组织或器官的浸润。趋化因子及其受体在此过程中发挥着重要作用。

肾脏是SLE常见的受累器官, 几乎所有的SLE患者均有肾脏累及。动物实验已经证实趋化因子特别是CCL2/MCP-1促成了系统性红斑狼疮狼疮肾炎的肾脏损伤, 在SLE狼疮肾炎的鼠模型中, 编码MCP-1的基因缺失和药理学作用阻断MCP-1都会减轻肾小球和间质的炎症、减少肾脏损伤[22];并且趋化因子受体CCR2缺乏的实验鼠肾脏疾病减少, 生存时间延长[23]。Rovin BH[24]等学者在研究中已证实培养的人系膜细胞在炎性细胞因子的刺激下可产生特异性的单核细胞趋化物即MCP-1, 提示系膜细胞产生的CCL2/MCP-1可定向趋化单核细胞、淋巴细胞等进入肾小球。更多的实验也已证实多种趋化因子及其受体在SLE肾小球、小管间质性损害中发挥着重要作用[25,26,27,28], 狼疮肾炎患者尿中的趋化因子及其mRNA可有明显增高, 并且与肾脏损伤的严重性相关联[29,30,31]。

中枢神经系统病变是SLE严重并发症, 但其临床表现多样, 并且确诊中枢神经系统受累的检查敏感性和特异性均不高。有学者通过对神经精神性狼疮的脑脊液进行分析, 发现CCL2/MCP-1、CX3CL1水平较无神经精神性狼疮的SLE患者明显增高, 并且神经精神性狼疮治疗前后CCL2/MCP-1水平亦有显著性差异[32,33]。Fragoso-Loyo H等[34]学者的研究也发现在神经精神性狼疮患者的脑脊液中C X C L8/I L-8、C X C L10/I P 1 0、C C L5/R A N T E S、CCL2/MCP-1、CXCL9/MIG也明显增高。提示趋化因子可能也参与了中枢神经系统的病变。

大多数SLE患者亦会出现皮肤粘膜损害, 由于趋化因子及其受体在SLE发病及病情进展中的多重作用, 不可避免参与了皮肤粘膜病变[18,35,36]。但不同的趋化因子及其受体异常可出现SLE患者不同的临床表现[37]。

2.4 趋化因子及其受体与SLE病情的关系

SLE病程迁延, 以反复的急性发作和病情缓解交替为特点。趋化因子及其受体亦参与了SLE疾病的活跃性和严重性改变[17,36]。血、尿或脑脊液中趋化因子及其受体表达水平或趋化因子mRNA可作为判断SLE疾病活跃性和严重性的可靠指标[17,29,30,31,33,36]。

3 展望

如前所述, 由于趋化因子及其受体参与SLE病程各个方面, 并且与SLE病情严重性、活跃性均存在密切的关联, 并且可根据趋化因子及受体的不同类型, 初步判断肾脏等受损的病理类型。SLE经典的药物治疗是糖皮质激素和免疫抑制剂, 虽然积极的治疗有效地改善了脏器病变和预后, 但是也因此带来了感染、不育、恶性肿瘤等不良反应。趋化因子及其受体在SLE发病机制和病程中的多样化作用, 为我们选择其作为生物制剂进行干预治疗带来了一线曙光。动物实验研究已经取得了一定进展[38,39,40], 但能否应用于人尚未可知。应用趋化因子及其受体进行生物治疗任重而道远, 将成为未来研究的方向。

摘要：趋化因子 (chemokine) 是一类结构相似的小分子细胞因子, 在多种炎性和自身免疫性疾病中发挥重要作用。系统性红斑狼疮 (SLE) 是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。趋化因子及其受体基因多态性影响SLE发病, 而它们的表达与SLE免疫学异常, 以及器官受累、疾病严重性和活动性程度密切相关。

趋化作用 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集齐齐哈尔医学院附属医院2000~2008年卵巢癌组织及卵巢癌盆腔腹膜转移灶实施根治手术标本45例,上皮性良性肿瘤组17例,卵巢良性疾病组织20例。术前均未接受化疗,患者平均年龄54岁(35~72岁),临床资料完整,石蜡标本保存。

1.2 实验方法

免疫组化检测RANTES蛋白每例标本切取4μm厚切片,试剂RANTES为鼠单克隆抗体,免疫组化试剂购自福州迈新生物技术公司,具体按常规SP法操作。免疫组化染色性反应应为黄至棕黄色颗粒,RANTES定位细胞浆,以细胞数>10%为阳性标准,阳性强度分级:细胞数10%~25%为(+),25%~50%为(++),>50%为(+++)。

原位杂交法检测RANTES mRNA,按原位杂交法的要求对RANTES阳性的病例标本进行固定和石蜡包埋,切片至4~6μm。石蜡切片经常规脱蜡至水,过氧化物酶和胃蛋白酶处理后,加入预杂交液,40℃湿盒内预杂交3 h,吸除预杂交液,加含有探针杂交液,42℃湿盒内过夜,加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶37℃湿盒内各15 min,DAB显色,中性树胶封片。同时设空白对照组(不含探针)和阴性对照组(预先用RNA酶消化40 min)。阳性杂交结果可见胞浆着色呈棕紫蓝色颗粒。按照阳性细胞比例≤10%为1分,10%~50%为2分,>50%为3分;按染色强弱:阴性为0分;淡黄(蓝)色染色为1分;中度黄(蓝)色染色为2分,棕黄(紫蓝)色染色为3分。

1.3 统计学处理

应用SPSS 10.0统计分析软件处理所有数据,χ2检验比较率的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RANTES蛋白在不同卵巢组织中的表达

卵巢癌组织中RANTES蛋白的阳性表达位于癌细胞的细胞质中,呈弥漫棕黄色颗粒,它们在淋巴结转移组中的表达同非淋巴结转移组中的表达相比,差异均有统计学意义,在正常卵巢组织中多呈阴性表达(表1)。

2.2 RANTES mRNA在不同卵巢组织中的表达

卵巢癌组织中RANTES mRNA的阳性表达位于癌细胞的细胞质中,呈弥漫棕黄色颗粒,在正常卵巢组织中呈阴性表达;它们在淋巴结转移组中的表达同非淋巴结转移组中的表达相比,差异均有统计学意义(表1)。

2.3 卵巢癌中RANTES的表达与临床病理特征的关系

在≥60岁和<60岁卵巢癌患者中RANTES蛋白和mR NA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。不同临床分期的RANTES蛋白和mRNA的表达不同,晚期卵巢癌中RANTES蛋白和mRNA阳性表达率明显增高。Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

3 讨论

已证明很多因素参与肿瘤的侵袭和转移,但不同组织来源的肿瘤细胞迁移到特定部位的分子机制还不清楚。趋化因子是一组结构相关的小分子,具有调节各种类型的白细胞迁移、吸引具有特定趋化因子受体的炎症细胞浸润到炎症部位参与炎症反应的特点。在肿瘤细胞定向迁移的过程中,趋化因子通过与肿瘤细胞表面相应的受体相互作用,能诱导肿瘤细胞骨架重排,促使肿瘤细胞紧密黏附于淋巴管内皮细胞,最终实现定向性迁移[3,4]。RANTES是一种由68个氨基酸组成的小蛋白,属于快速增长CC类趋化因子家族,是趋化T细胞和单个核细胞的CC类趋化性细胞因子,也是一种肿瘤细胞表达的主要趋化性细胞因子,并与卵巢癌、子宫内膜异位症等疾病进展有关[5]。在肿瘤部位,RANTES通过募集并活化单个核细胞和肿瘤细胞导致MMP表达,RANTES促进血管生长可能与增加MMP9表达进而促进肿瘤转移发生有关。RANTES在乳腺癌、宫颈癌中可作为预后的评价指标[6]。卵巢癌患者血清中RANTES的异常升高与肿瘤的分期有关,随着恶性程度的增加,血清RANTES含量增高[7]。Zhou等[8]研究发现,卵巢和子宫内膜基质细胞也同样表达RANTES。本研究通过免疫组化方法,检测到卵巢癌中有RANTES蛋白强阳性表达,其阳性表达率为80%,而在正常卵巢组织中无表达或表达较弱。研究发现,很多趋化因子可能参与了生理性、病理性淋巴管的形成和调节,并参与了肿瘤细胞的移动、归巢和转移的控制[9]。淋巴管的内皮细胞通过分泌趋化因子趋化肿瘤细胞,进而促进肿瘤细胞的淋巴转移[10]。本研究表明,在卵巢癌淋巴结转移灶中RANTES也有强的阳性表达(85.71%),并且RANTES在伴有淋巴结转移病例中的表达显著高于无淋巴结转移者。同时,在分析RANTES表达与临床病理的关系时发现,RANTES的表达与肿瘤病理分级、TNM分期密切相关,而患病年龄无显著差异。进一步通过原位杂交的方法检测卵巢癌中RANTES mRNA的表达情况,结果显示原位杂交与免疫组化结果基本一致,这一结果进一步支持了免疫组化的检测结果。

本研究结果表明,RANTES在卵巢癌组织的高表达与卵巢癌的发展、侵袭和淋巴结转移有关,提示RANTES的表达在卵巢癌侵袭和淋巴结转移中发挥重要作用,RANTES有可能成为卵巢癌治疗的新靶点。

摘要：目的:探讨卵巢癌组织中趋化因子(RANTES)蛋白与mRNA的表达水平及临床意义。方法:采用免疫组化法和原位杂交技术检测卵巢癌组织中RANTES蛋白和mRNA表达,分析其与卵巢癌生物学特征之间的关系。结果:RANTES蛋白在卵巢癌及转移灶中的阳性率明显高于卵巢良性肿瘤,两组差异有统计学意义(P<0.05)。RANTES mRNA在卵巢癌及卵巢良性肿瘤中的阳性率分别为75.55%和11.76%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。RANTES蛋白与mRNA表达与癌的组织学分级及TNM分期有关(P<0.05)。结论:RANTES蛋白在卵巢癌中有阳性表达,其表达水平与卵巢癌侵袭发展和淋巴结转移有关。

关键词：卵巢癌,RANTES,原位杂交,免疫组织化学

参考文献

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[9]Murphy PM.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis[J].N Engl J Med,2001,345(11):833-835.

趋化作用 第5篇

1 MCP-1的命名

MCP-1最早研究来源于1983年Cochran等[3]报道的小鼠基因JE, 该基因从经血小板衍生因子刺激的成纤维细胞中克隆, 编码的蛋白质具有趋化白细胞功能。1989年, Yoshimura等[4]在神经胶质瘤细胞系U-105MG筛到一cDNA克隆, 其核苷酸和氨基酸序列与JE同源, 遂命名为MCP-1。

2 MCP-1分子结构及受体

MCP-1前体是一种由99个氨基酸组成的蛋白单链。成熟的MCP-1呈碱性, 由76个氨基酸组成, 含四个半胱氨酸 (Cys) , 分别在11、12、36、52号位上, 并在11位与36位以及12位与52位之间形成两个链内二硫键, 14位是潜在的N-糖基化位点。人MCP-1的基因定位于第17号染色体, 含有3个外显子, 2个内含子。

一般情况下, 趋化因子大致可分为两大功能区:趋化功能区和受体结合区。趋化功能区多位于N端, 可激活受体、引起下游信号转导、导致趋化效应, MCP-1趋化活性取决于N端多肽链。而受体结合区参与受体结合。MCP-1的结合受体包括:趋化因子受体 (Chemokine receptor, CCR) 1、CCR2、CCR4、CCR5等, 其中CCR2是其主要受体。它是一类G蛋白偶联受体, 由长短不一的肽链连接7个富含疏水氨基酸的α螺旋的跨膜片段组成, 氨基端在外, 羧基端在内。MCP-1与CCR2结合后激活趋化因子受体, 后者通过细胞膜上G蛋白偶联的磷酸肌醇等信号转导途径产生一系列反应。

3 MCP-1与AS

MCP-1可由体内多种细胞分泌, 包括平滑肌细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞等, 它能趋化多种炎性细胞向病变部位聚集, 并对多种炎症因子的刺激作出应答[5], 从而直接或间接地参与了AS的形成[6]。Martinovic等[7]对263例志愿者研究证明, 血浆MCP-1水平升高增加了冠状动脉粥样硬化的发病风险。研究MCP-1的作用机制, 有助于了解动脉粥样硬化的形成机制, 探讨治疗途径。

3.1 MCP-1与单核/巨噬细胞

在AS的早期, 单核/巨噬细胞在特异性趋化因子刺激下, 大量吞噬脂质, 形成泡沫细胞。MCP-1是此过程最可能的诱发信号, 它通过和CCR2结合使单核细胞进入血管内膜, 活化成巨噬细胞并摄取发生修饰的脂蛋白形成单核细胞源泡沫细胞, 导致AS的形成。MCP-1影响着单核细胞从黏附迁移到泡沫化的全过程。

3.2 MCP-1与内皮细胞

内皮细胞是预防AS的初始防线, 目前认为AS的始发因素包括内皮细胞损伤。炎症刺激、氧化应激及较高水平的低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 堆积等众多因素均可以引起内皮细胞损伤。内皮细胞损伤时, 大量脂质迁移到大动脉内膜下, MCP-1可促使巨噬细胞、中性粒细胞聚集在动脉壁引起炎症反应, 巨噬细胞吞噬脂质构成泡沫细胞, 血管平滑肌细胞增殖、移动, 引起动脉粥样硬化, 导致斑块形成。

3.3 MCP-1与平滑肌细胞

平滑肌细胞增生和迁移形成平滑肌性泡沫细胞是AS较晚期病变。MCP-1除趋化单核细胞外, 对平滑肌细胞也有趋化增殖作用, 并诱导组织因子表达, 促进局部血栓形成[8]。MCP-1在血管平滑肌细胞激活2个不同的信号传导通路:释放促炎性细胞因子白细胞介素IL-6和IL-1导致细胞增殖;激活核因子NF-κB和AP-1, 通过转录因子活化血管平滑肌细胞。

3.4 MCP-1与黏附因子

黏附因子是参与细胞间、细胞与细胞外基质间黏附的一系列大分子, 其中细胞间黏附因子-1 (ICVM-1) 和血管细胞黏附因子-1 (VCAM-1) 在AS的形成过程中具有重要的作用。ICVM-1和其受体结合构成单核-内皮细胞黏附的基础, MCP-1可促使内皮上黏附的单核细胞进入血管内膜, 进一步形成泡沫细胞。而VCAM-1可以使单核细胞迁移入内皮下层, 转化为巨噬细胞, 摄取脂质转化为泡沫细胞, 并向淋巴细胞提供抗原, 触发局部免疫反应, 同时释放多种细胞因子, 促进平滑肌细胞转化和增殖, 形成纤维斑块[9,10]。随着病程的发展, VCAM-1介导更多的细胞进入斑块, 促使斑块的发展, 同时影响斑块的稳定性。Waleh等[11]证明活化的内皮细胞表达ICVM-1增加, 单核细胞通过ICVM-1和内皮细胞结合, 黏附的单核细胞可表达MCP-1等多种因子, 这些细胞因子可促进平滑肌细胞表达VCAM-1, VCAM-1与其受体结合进一步促使单核细胞的黏附, MCP-1和黏附因子互相作用促进AS的进展。

3.5 MCP-1与其他细胞因子

MCP-1和CCR2结合后, 可激活丝裂素活化激酶级联反应, 在使血液中的单核细胞迁入内膜下, 活化为巨噬细胞, 吞噬脂质形成泡沫细胞的同时, 也促进了其他细胞因子[如肿瘤坏死因子 (TNF-α) 、白介素 (IL) -1、IL-6等]的产生增多、基质金属蛋白酶等活化[12], 导致斑块不稳定, 造成急性心脑血管事件的发生。Kaikita等[13]在实验性心肌梗死中发现缺乏MCP-1受体CCR2的动物模型表现出了在梗死区域单核细胞浸润减轻, TNF-α、基质金属蛋白酶表达减少, 这也从另一个角度证实了MCP-1对其他细胞因子的影响。

MCP-1在脑血管病的发生发展中亦发挥重要作用。Garlichs等[14]研究测定17例短暂性脑缺血发作 (TIA) 及60例脑梗死患者血清MCP-1, 并与对照组比较, 两组患者MCP-1均升高。Arakelyan等[15]对40例脑梗死患者血清MCP-1进行检测, 结果脑梗死患者血MCP-1水平显著高于健康对照组。Reynolds等[16]检测了223例急性脑卒中患者及214名正常人血浆50余种蛋白标志物, 结果发现5种蛋白质的特异性、敏感性较高, 对脑梗死、脑出血的诊断有价值, 其中包括MCP-1。

AS是心脑血管意外事件的共同的病理基础, MCP-1在AS过程中发挥着重要作用。Hartung等[17]实验得出MCP-1可作为一种非侵入性手段检测斑块炎症范围, 可能推测斑块稳定性。Arefieva等[18]研究提示MCP-1水平与冠脉粥样斑块稳定性有一定相关性, 并在冠心病炎症发生和发展过程中起重要作用。美国达拉斯心脏研究发现, 亚临床冠状动脉粥样硬化的MCP-1水平也增高, 即使对传统危险因子和CRP进行校正后, MCP-1水平仍具有统计学意义[19]。Hoogeveen等[20]研究血浆MCP-1水平与外周动脉疾病或冠状动脉粥样硬化性心脏病之间关系时发现, MCP-1随AS程度增加而增加。因此, 有学者认为血浆中MCP-1水平的高低是评价AS治疗效果的一个重要指标[21]。

4 中医药防治AS

在对AS发病机制研究不断深入的过程中, 人们也加紧了对AS的防治探索, 大量动物实验表明, 抗MCP-1的基因治疗、CCR2拮抗剂的使用都具有良好疗效, 并且中医药在下调MCP-1以防治AS方面具有多层次、多方位、多靶点的优势, 潜力巨大。

中医学中无“动脉硬化”“粥样斑块”“动脉粥样硬化”等词, 根据AS的临床表现, 多涉及“胸痹”“中风”“真心痛”“眩晕”“头痛”“健忘”“痴呆”“脱疽”等病证范畴。中医学认为本病是本虚标实之证, 是脏腑功能失调的结果, 痰浊蕴聚、热瘀互结是其重要的发病机制之一。因而临床上多采用活血、化瘀、祛浊、化痰、通络、清热、益气、补虚等方法来治疗本病。

4.1 单味中药

万磊等[22]研究发现丹参可下调MCP-1蛋白表达。许涛等[23]实验发现丹参可以使血管内皮细胞和平滑肌细胞中的MCP-1mRNA及蛋白的表达水平下调, 从而减少炎性细胞在血管内皮细胞以及平滑肌细胞中聚集。朱慧民等[24]采用Clowes方法建立兔颈总动脉球囊损伤模型, 给予赤芍原位杂交染色及逆转录聚合酶链反应检测增殖血管内膜的MCP-1mRNA水平。实验结果表明赤芍可使MCP-1mRNA表达下调, 通过抑制炎症反应激活进而防止球囊损伤后的内膜增殖。何国厚等[25]通过实验证实小檗碱可以降低VCAM-1和MCP-1的表达, 预防家兔颈动脉粥样硬化。陈施艳等[26]发现脑缺血后缺血脑组织中MCP-1表达增多, 而小檗碱可降低缺血脑组织中MCP-1的表达, 提示小檗碱可通过抑制MCP-1等炎症因子来减轻脑缺血组织的炎症反应, 进而保护缺因神经元。刘镘利等[27]研究发现姜黄素可以通过抑制炎症因子MCP-1的表达调节血管内皮细胞的炎症反应, 从而发挥保护血管内皮细胞, 防止动脉粥样硬化的作用。

4.2 中药复方

顾耘[28]采用人脐静脉内皮细胞原代培养, 加氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL) 共同孵育造成血管内皮细胞损伤模型, 用中药血清药理学方法将软脉煎药物血清作用于细胞模型, 用ELISA法测MCP-1, 结果发现软脉煎能显著地降低升高MCP-1水平, 效果与辛伐他汀相当, 推测软脉煎防治AS的作用与降低MCP-1水平有关。唐丹丽等[29]研究发现运用温阳益心法可以使主动脉组织中NF-κB活化和MCP-1表达降低, 能有效地抑制单核细胞向内皮黏附及迁移, 从而防止AS的形成。胡圣等[30]应用HE染色观察胸主动脉的AS程度, 并应用RT-PCR检测MCP-1基因表达情况, 发现应用脑心通后MCP-1mRNA表达明显降低, 提示脑心通具有抑制MCP-1的表达、抗AS的作用。刘粉叶等[31]将40只新西兰兔随机分为正常组、模型组、益肾活血胶囊小剂量组、益肾活血胶囊大剂量组及西药 (叶酸、维生素B6、维生素B12) 组, 分别给予相应的药物治疗, 并HE染色观察血管形态学变化、实时定量PCR检测动脉壁MCP-1基因表达、Western Blot分析核因子-κB抑制因子α (IκBα) 蛋白含量。结果发现益肾活血胶囊可抑制血管内膜增厚, 下调腹主动脉MCP-1基因表达, 且大剂量组疗效明显优于小剂量组。说明益肾活血胶囊可以下调MCP-1基因表达, 延缓动脉粥样硬化的进程。迟寿军[32]用高热量饲料加以链脲佐菌素腹腔注射的方法复制大鼠糖尿病模型, 并用ELISA法与Western Blot法检测大鼠血清及组织蛋白中MCP-1含量变化情况, 结果显示MCP-1表达显著下调, 说明平糖煎对MCP-1表达具有良好的调节作用。何东初等[33]通过实验发现糖脉平能减少MCP-1mRNA的表达, 减轻血管内皮局部炎症反应, 阻断和降低动脉硬化的形成。

5 展望

趋化作用 第6篇

我国传统医学对肿瘤治疗有悠久历史。近年来, 其功能多、药效持久、提高免疫力的优势逐渐为人们所重视。有些中药本身就具有杀肿瘤细胞的作用,如白花蛇舌草、获术。蟾蜍灵存在于蟾蜍耳后腺分泌的白色浆液中,是药蟾酥的的毒性成分之一,因具有解毒、强心、止痛的药理作用,被临床广泛应用。 近年来临床观察提示,含有蟾蜍毒素的中药制剂对肺癌、肝癌、白血病等具有显著的抑制作用。但其对食管癌的作用机制研究甚少。

细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regu lated protein kinases,ERK)是丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK) 超家族中的一员,通过瀑布样的三级酶促级联反应,即Ras→ Raf→MEK→ERK将细胞外刺激转导至细胞核内, 从而参与并调节细胞生长、发育及分裂。多数研究发现,ERK信号通路的异常在恶性肿瘤的发生和肿瘤侵袭转移过程中起重要作用。Raf-1是Ras/Raf/ MEK/ERK信号途径中的重要一员,磷酸化并活化Raf1可进一步活化MEK,MEK又可磷酸化并活化ERK,ERK继续磷酸化不同的胞浆及胞核蛋白,最终将生物信号传导至细胞核。通路中任何一个基因出现异常,都可能导致ERK的异常活化,这与肿瘤的生长、转移、预后及治疗密切相关。

本实验通过研究蟾蜍灵对食管癌细胞株的迁移、趋化运动和ERK上游Raf蛋白激酶表达及活化水平的影响,进一步探讨蟾蜍灵在ERK通路中抗肿瘤作用机制,为食管癌的治疗方案提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料

食管鳞状细胞癌TE13细胞株由河北省四院肿瘤研究所惠赠。细胞常规培养,实验组为含有10、25、 50和100 nmol/L蟾蜍灵培养液的细胞。对照组为无药物培养液的细胞。

1.2试剂

胎牛血清购自杭州四季青公司,胰蛋白酶购自美国Sigma公司,青霉素、链霉素购自华北制药,蟾蜍灵购自上海源叶生物科技有限公司,RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司,噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)、 二甲基亚 砜 (dimethyl sulfoxide,DMSO) 购自碧云天生物技术研究所,兔抗Raf-1多克隆抗体、兔抗磷酸化Raf-1 (p-Raf-1)多克隆抗体购自北京博奥森生物有限公司,辣根过氧化物酶标记羊抗兔Ig G、聚偏氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜购自美国Santa Cruz公司,预染蛋白分子量marker、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)、甘氨酸(glycine,Gly)、Tween 20、丙烯酰胺、过硫酸铵购自上海生工生物工程有限公司, DAB显色试剂盒、通用性二抗购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养与传代食管鳞状细胞癌TE13细胞在含有10%胎牛血清的细胞培养瓶中,置于5%二氧化碳CO2,37℃培养箱内培养,传代1次 /2~3 d。

1.3.2 MTT法检测取对数生长期细胞接种于96孔板,温箱中孵育。待细胞铺满孔板后,分别加入0、 10、25、50、100、200、400和800 nmol/L的蟾蜍灵。使用无药培养液(无细胞)为对照组,每种浓度均设3个复孔。加入MTT 10μl(终浓度为0.5 mg/ml),放入培养 箱中培养4 h。 离心之后 , 加入DMSO 100μl,37℃振荡10 min。在492 nm波长下,用酶联免疫检测仪检测每孔样本的吸光度(optical density, OD)。每个样本设3个孔,重复4次,取平均值定为最终结果。计算增殖抑制率、半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值、药物最大无毒浓 度和半数 中毒剂量 (median toxic dose, TD50)。TD50(%)=(蟾蜍灵组OD值 / 对照组OD值)×100%,>50%的药物浓度即TD50。

1.3.3细胞划痕实验将高压灭菌后的载玻片置于6孔板内,调整细胞浓度为每孔2×104个,常规培养待细胞长到约90%时,用20μl移液器枪头比着灭菌后的直尺做“一”字划痕,PBS冲洗。每孔加入含1 ml含10%牛清的RPMI 1640培养基培养,然后分别加入浓度为0、10、25、50和100 nmol/L的蟾蜍灵存储液。温箱中常规培养24 h后,甲醛溶液固定6孔板内的细胞20 min,进行HE染色,在显微镜下观察细胞的迁移。

1.3.4 Boyden小室实验将载玻片置于6孔板内, 调整细胞浓度为每孔2×104个,加入不同溶度的蟾蜍灵(0、10、25、50和100 nmol/L),培养后取600μl分别接种于6孔板的改良Boyden小室内,常规孵育24 h后,甲醛固定20 min,进行HE染色。400倍光镜下分别取上、下、左、右、中心5个视野,对滤膜下室面进行细胞计数,取均数,重复5次。

1.3.5免疫组织化学检测取对数生长的细胞,以2×104个 /ml接种于载玻片的6孔板中,温箱中培养。 当6孔板内培养的细胞生长至80%~90%融合状态时,换用无牛清的RPMI 1640培养基,常规培养12 h。 加入不同溶度(0、10、25、50和100 nmol/L)的蟾蜍灵, 继续培养2 h。取出载玻片滴加Raf-1及p-Raf-1一抗,室温孵育4 h。滴加生物素化二抗,滴加DAB,显微镜下控制DAB显色,400倍光镜下观察结果,每张切片随机观察5个视野,阴性对照用PBS替代一抗, 共记数100个细胞,计算阳性细胞百分率。

1.3.6 Western blot检测用细胞裂解液裂解各组细胞,50μg/ 孔取样本,经电泳分离后电转移至PVDF膜上。将PVDF膜浸入5%脱脂奶封闭3 h,加一抗4℃ 孵育过夜,二抗室温置摇床平缓摇动2 h。TBS洗膜1次,5 min后DAB显色。通过Alphaease凝胶成像系统分析产物,对各个条带的灰度值进行测量,结果以目的条带的IDV与相对应的 β-action扩增条带的IDV比值表示。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用方差分析,计数资料用 χ2检验、非参数的秩和检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MTT法检测比较

0、10、25、50、100、200、400和800 nmol/L蟾蜍灵干预24 h后,平均OD值分别为0.991、0.869、 0.735、0.561、0.499、0.371、0.265和0.258,TE13细胞的增殖抑制率随蟾蜍灵浓度的增加而逐渐升高(见图1)。IC50为107.20 nmol/L,TD50为100.00 nmol/L。

2.2不同溶度蟾蜍灵对TE13细胞株迁移能力的影响

划痕后加入血清,细胞迁移能力显著加强。加入蟾蜍灵后,细胞迁移受到抑制,表明蟾蜍灵对TE13细胞株的迁移能力有影响,其迁移能力随着蟾蜍灵浓度的增加而降低。见图2。

2.3不同浓度蟾蜍灵对TE13细胞株趋化能力的影响

Boyden小室实验可以通过检测癌细胞穿透滤膜的能力,间接反映癌细胞的侵袭能力。0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵处理后的食管癌细胞穿过滤膜细胞数分别为 (164.23±3.15)、(160.75±5.46)、 (131.84±4.12)、(83.39±2.41)和(54.36±3.19)。结果显示,蟾蜍灵组(25、50和100 nmol/L)穿过滤膜细胞数与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。说明蟾蜍灵对食管癌细胞的趋化能力有抑制作用。25、 50和100 nmol/L蟾蜍灵组的穿过滤膜细胞数比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。说明蟾蜍灵在抑制TE13细胞株的趋化能力上存在着一定的剂量依赖关系。

2.4不同浓度蟾蜍灵对TE13细胞Raf-1、p-Raf-1蛋白表达的影响

Western blot结果表明,0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵作用后,TE13细胞中Raf-1蛋白的表达量分别为(0.74±0.06)、(0.75±0.04)、(0.75±0.04)、 (0.75±0.04)和(0.75±0.06),蟾蜍灵组Raf-1蛋白的表达量与对照组比较差异无统计学意义(P >0.05)。 0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵作用后,TE13细胞中p-Raf-1蛋白的表达量分别为 (0.75±0.01)、 (0.73±0.06)、(0.68±0.16)、(0.46±0.08)和(0.36± 0.02),蟾蜍灵组(25、50和100 nmol/L)p-Raf-1蛋白的表达量与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。 25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组p-Raf-1的表达量与对照组比较明显减少(P <0.05)(见图3、4)。

2.5通过免疫组织化学检测TE13细胞Raf-1、pRaf-1蛋白表达的影响

镜下观察免疫组织化学检测结果,Raf-1、pRaf-1蛋白阳性表达于TE13细胞的胞浆,呈棕黄色颗粒。0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵处理细胞后,Raf-1的阳性率分别为80.31%、80.23%、80.16%、 80.05%和80.01%,蟾蜍灵组和对照组的阳性细胞数及棕黄色颗粒数未见明显减少,差异无统计学意义 (P >0.05);p-Raf-1的阳性率分别为80.23%、78.67%、 52.22%、49.28%和47.59%,25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组与对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。 25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组的p-Raf-1阳性细胞数及棕黄色颗粒数与对照组比较明显减少(P <0.05)。

3讨论

Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途径[1], Raf-1介导Ras/Raf/MEK/ERK通路活化,促进细胞形态的改变及细胞运动能力、迁移能力的增加[2]。多数研究表明,Raf-1蛋白在肿瘤形成及细胞迁移过程中起重要作用[3,4]。LEICHT等[5]研究表明,Raf-1在多种肿瘤的早期存在异常激活,如小细胞肺癌[6]、白血病[7]、肝癌等[8]。恶性肿瘤中的新生血管是促使肿瘤生长迅速和转移的另一重要条件,新生血管的数量与肿瘤细胞生长和转移速度呈正相关,Raf-1激活ERK1/2在调节内皮细胞渗透性的过程中起重要作用[9]。国外研究发现,抑制肝细胞癌中Raf-1的活化可以影响肿瘤的生长和血管的形成[10]。近年来研究表明,蟾蜍灵可以通过多种信号转导途径抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、放射增敏等作用。WATABE[11]和KUROSAWA等[12]认为,蟾蜍灵可以诱导细胞凋亡,蟾蜍灵处理U937细胞6 h后,MAPK活性显著增加,Ras、Raf-1和MAPKK1先于MAPK瞬间激活。蟾蜍灵抑制肿瘤的发生、发展涉及多个分子生物学机制。翟笑枫等[13]研究显示,蟾蜍灵对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长具有抑制作用,进一步研究发现蟾蜍灵可抑制血管生成,从而抑制肿瘤的生长和转移。蟾蜍灵抑制肿瘤发生、发展的机制是相互联系的。有研究证实,蟾蜍灵可以抑制肝癌细胞迁移[14]。本研究采用划痕实验,比较不同浓度蟾蜍灵对食管癌TE13细胞迁移运动的影响。 结果显示,在划痕实验24 h后,对照组TE13细胞的愈合面积比蟾蜍灵组多,由此推断蟾蜍灵具有抑制食管癌TE13细胞迁移的趋势,并在一定药物浓度内存在剂量依赖关系。采用Boyden小室实验进一步研究蟾蜍灵对食管癌TE13细胞株趋化能力的抑制作用。实验结果表明,食管癌TE13细胞穿过滤膜的细胞数随药物浓度的增加而减少,这说明蟾蜍灵可以抑制TE13细胞的趋化能力,并在一定药物浓度内存在剂量依赖关系。以上实验说明蟾蜍灵可能通过抑制食管癌TE13细胞的运动而抑制其转移,但具体的相关机制并不清楚。

趋化作用 第7篇

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取中南大学湘雅医院2009 年1 月-2012 年12 月住院行膀胱癌根治+ 盆腔淋巴结清扫术的115 例BTCC组织,均经病理证实。其中男62 例,女53 例;年龄40~78 岁,平均61.5 岁。所有患者术前均行泌尿系及盆腔CT扫描。膀胱肿瘤组织病理学分级采用WHO分级法:Ⅰ级14 例,Ⅱ级42 例,Ⅲ级59 例。临床分期采用UICC-TNM分期法:T1期7例,T2期26 例,T3期58 例,T4期24 例。

1.2 方法

将收集的115 例膀胱移行细胞癌组织石蜡标本采用免疫组织化学染色法检测CCR7 的表达情况。分析术前CT判断淋巴结转移情况,并记录手术清扫的阳性淋巴结位置及数目。淋巴结清扫范围如下:78 例标准盆腔淋巴结清扫(上界为双侧髂总动脉分叉,下界为Cooper韧带、股管人口处,外侧界至生殖股神经,内侧界达膀胱壁,包括双侧髂内、髂外以及闭孔淋巴结)。37 例因术前和术中评估疑淋巴结转移可能,故行扩大淋巴结清扫(包括双侧盆腔髂血管周围淋巴结、双侧髂总血管周围淋巴结、骶前淋巴结、腹主动脉和下腔静脉周围淋巴结)。

免疫组织化学采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连结SP(中山金桥生物公司,编号SP-9000)一步法进行,兔抗人CCR7 多克隆抗体(美国Abcam公司,编号ab32527)1∶200 稀释作为一抗,PBS代替一抗作为阴性对照,已知乳腺癌组织切片染色作为阳性对照,按试剂盒说明书相关步骤操作,具体如下:1石蜡切片:收集的石蜡标本4μm连续切片,于65℃烤箱中烘烤30 min;2脱蜡水化:二甲苯I与二甲苯II依次脱蜡20 min,梯度酒精水化(100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min),PBS冲洗5 min×3 次;3抗原热修复:将切片放入0.01 M枸椽酸缓冲液(p H 6.0)中95℃加热15 min,自然冷却至40℃,PBS冲洗5 min×3 次;4灭活内源性过氧化物酶: 加入适量的3%过氧化氢,室温孵育20 min, PBS冲洗5 min×3 次;5加入正常山羊血清工作液封闭,室温孵育10 min,弃去多余液体;6滴加稀释后的兔抗人CCR7 多克隆抗体,40℃孵育过夜,PBS冲洗5 min×3 次;7滴加生物素标记羊抗兔Ig G,室温孵育40 min,PBS冲洗5 min×3 次;8滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,室温孵育40 min,PBS冲洗5 min×3 次;9DAB显色,显微镜下控制反应时间,自来水洗终止显色过程;10苏木素复染,自来水冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;11显微镜下观察。

1.3 结果判定

免疫组织化学结果由2 位独立的病理医生(无相关样本临床资料的信息)分析,出现结果不一致时重新判片,直至达成一致意见。在高倍镜下随机观察3 个视野,计数细胞总数,观察结果采用二维半定量方法进行,即综合考虑肿瘤细胞的染色阳性率和染色强度。染色阳性率的评分标准为:0 分,无染色阳性细胞;1 分,<10% 染色阳性细胞;2 分,10%~50%染色阳性细胞;3 分,>50%染色阳性细胞。染色强度评分标准:0 分,无着色;1 分,轻度着色(略强于阴性对照);2 分,中度着色(1~3 分);3 分,重度着色(相当于或强于阳性对照)。将两者评分相加后作为评定标准:0~1 为Ⅰ,2 为Ⅱ,3~4 为Ⅲ,4~6 为Ⅳ。

所有患者术前均行泌尿系及盆腔64 位多层螺旋CT(德国西门子Somatom)扫描。扫描层厚为5 mm。115 例患者的CT片均通过电子系统调阅,并由2 位独立的泌尿外科医师和放射科医生完成,阅片评估前均不知晓患者淋巴结的病理结果。盆腔淋巴结>10 mm作为阳性转移淋巴结的评判标准。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行数据处理,计数资料用 χ2检验,等级资料用秩和检验(Mann-WhitneyU test),单因素分析用四格表计数分析,多因素分析用二分类Logistic回归分析,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BTCC组织中CCR7 的表达与淋巴结转移的关系

115 例BTCC患者中,术后病理证实淋巴结癌转移阳性者为42 例,淋巴结阴性者为73 例。淋巴结阳性组中,CCR7 的表达Ⅰ级0 例,Ⅱ级5 例,Ⅲ级14例,Ⅳ级23 例。而淋巴结阴性组中,CCR7 的表达Ⅰ级15 例,Ⅱ级36 例,Ⅲ级22 例,IV级为0 例。两组间差异有统计学意义(P <0.05),CCR7 的表达与淋巴结转移相关。见表1。

2.2 BTCC组织中CCR7 的表达是淋巴结转移的独立影响因子

单因素分析显示,在115 例BTCC患者中,年龄、性别、肿瘤分期、分级、肿瘤大小、发病次数等6个临床参数,仅肿瘤分期、分级与CCR7 蛋白表达的阳性率之间差异有统计学意义(P <0.05),其他3 项临床参数与CCR7 蛋白的表达并未发现明显的相关性(P >0.05)。多因素分析显示,仅CCR7 蛋白表达为淋巴结转移发生的独立影响因子(P <0.001,O^R=2.93),CCR7 蛋白高表达组发生淋巴结转移的风险约为低表达组的3 倍。见表2。

2.3 CCR7 联合CT诊断BTCC淋巴结转移可提高CT诊断的敏感性

将CCR7 的表达分为2 组,Ⅰ、Ⅱ为低表达组阴性(-),Ⅲ、Ⅳ为高表达组阳性(+)。CCR7 和淋巴结转移均(+)的有37 例,CCR7(+)而淋巴结转移(-)的有22 例,CCR7(-)和淋巴结转移均(-)的有51 例,CCR7(-)而淋巴结转移(+)的有5 例。CCR7 单独评估淋巴结转移的敏感性、特异性和精确度分别为88.1%、69.9%及76.5%。115 例患者中,CT诊断淋巴结阳性的有37 例,阳性率为32.2%(37/115)。其中,CT评估与淋巴结均(+)的有22 例,CT(+)而淋巴结转移(-)的有15 例,CT与淋巴结均(-)的有58 例,CT(-)而淋巴结转移(+)的有20 例。CT单独评估淋巴结转移的敏感性、特异性和精确度分别为52.4%、79.5%及69.6%。当CCR7 联合CT诊断淋巴结转移时,敏感性、特异性和精确度分别为92.3%、83.6%及70.0%(100/115),见表3。

3 讨论

膀胱癌是最见的泌尿系统肿瘤,其发病率和死亡率均较高。据统计,2012 年美国新发膀胱癌患者73 510 例,病死人数达14 880 例[6]。膀胱癌具有反复复发、局部浸润以及远处转移的生物学特征,如何监测以及抑制膀胱癌转移,是目前膀胱癌研究的重点之一。研究表明,淋巴结转移是影响膀胱癌预后的重要因素,出现淋巴结转移的膀胱癌患者往往预后不佳[7]。

趋化因子及其受体家族在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要作用。趋化因子受体7 既往认为是孤儿受体,近期研究发现其配体为CCL12 和CCL19。目前发现在许多癌组织中,如乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌等均有较高表达[8]。并且高表达的CCR7 是影响这些肿瘤淋巴结转移的一项独立影响因素[9]。YATES等[10]发现膀胱癌细胞中的CCR7 表达促进癌细胞的增殖和侵袭的信号转导通路。国内学者侯恺林等[11]也发现,CCR7 蛋白高表达与膀胱移行细胞癌的恶性程度及预后相关。本研究发现,淋巴结阳性组与阴性组的CCR7 表达差异存在统计学意义(P <0.05),证实CCR7 的表达与盆腔淋巴结转移相关。对淋巴结转移的单因素分析显示,肿瘤病理分级、临床分期及CCR7 蛋白表达是淋巴结转移的影响因素。进一步多因素回归分析显示,CCR7 的表达是膀胱癌淋巴结转移的一项独立影响因子(P <0.05,O^R=2.93),CCR7 蛋白高表达组发生淋巴结转移的风险约为低表达组的3 倍。由此推测可能是CCR7 蛋白的高表达对肿瘤的分期与分级产生一定的影响,从而进一步影响淋巴结的阳性率。

CT扫描是诊断膀胱癌和评估分期的重要手段,然而其敏感性并不令人满意。FICARRA等[12]研究发现,45 例淋巴结阳性的膀胱癌患者,术前CT只诊断出了19 例,敏感性为42.25%。一般认为CT显示,直径至少>0.5 cm的淋巴结才考虑是阳性转移淋巴结可能。本研究中,CT单独评估淋巴结转移的敏感性、特异性和精确度分别为52.4%、79.5%及69.6%,说明CT诊断淋巴结转移的局限性,如何提高其诊断的敏感性尤为重要。CCR7 单独诊断淋巴结转移时,敏感性、特异性和精确度分别为88.1%、69.9%及76.5%。CCR7 诊断的敏感性高于CT,但特异性偏低。当CCR7 联合CT诊断淋巴结转移时,敏感性、特异性和精确度分别为92.3%、83.6%及70.0%。因此,CCR7 联合CT诊断膀胱癌淋巴结转移可提高其敏感性,弥补CT的不足。

CCR7 是膀胱癌淋巴结转移的独立影响因子,是预测淋巴结转移的可靠指标。CCR7 联合CT诊断淋巴结转移能提高CT诊断的敏感性,则可对盆腔淋巴结的清扫范围提供更详细的评估,同时对患者术后的化疗也可能有一定的参考价值。

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[11]侯恺林,张连华,薄隽杰,等.趋化因子受体7在膀胱癌组织中的表达及其临床意义[J].中华泌尿外科杂志,2011,32(1):42-46.