低氧诱导范文

低氧诱导范文（精选5篇）

低氧诱导 第1篇

1 IHF-1的结构和生物学功能

20世纪90年代初,Semenza和Wang用1%O2处理人类肝癌细胞株Hep3B细胞,发现细胞内EPO m RNA表达明显增高,经低氧处理过的细胞中发现,促红细胞生成素(EPO)基因上有一核苷酸序列可以与特异性蛋白质结合,该特异性蛋白质被命名为HIF-1[1]。

1.1 HIF-1 的结构

HIF-1由HIF-1α、HIF-1β两个亚基组成,是一种异二聚体结合DNA的蛋白质因子。α亚基分子量为120KD,包含b HLH结构域,PAS结构域和羧基末端的反式活化结构域,三者共同构成了转录因子DNA结合域。HIF-1α是氧调节蛋白,共包含826个氨基酸。其C端包含两个反式活化结构域N-TAD和C-TAD,被抑制结构域(inhibition domain, ID)分开,ID能降低N-TAD和C-TAD活性,在非缺氧细胞中这一作用更加突出。β亚基的分子量为91-94KD。两个亚基均为螺旋环螺旋(basic-helix-loop-helix/Per-Arnt-Simdomain,b HLH/PAS)家族的成员。反式活化结构域只有在HIF-1α与β形成异二聚体时才起作用[2]。

1.2 HIF-1 的主要生物学功能

HIF-1是一种转录因子,和低氧反应基因(hypoxia reactiongene, HRG)的低氧反应元件(hypoxia reaction element, HRE)上的结合位点结合,促进转录表达靶基因,使机体适应低氧环境,介导低氧反应。低氧时在心、肝、肺、脑等组织细胞中被大量表达。现发现的低 氧反应基 因有4 0多种 , 主要有 :血管内皮 生长因子(VEGF)、EPO、糖酵解酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-1、α1B肾上腺素能受体、诱导型NOS(i NOS)、转铁蛋白、血红素氧化酶-1、血栓素合酶、内皮素-1(ET-1)、尿激酶型的纤溶酶原活化素受体基因、肾上腺髓质素、环氧合酶-2(COX)等[3]。HIF-1的生物学功能主要有:促进糖代谢和氧运输、促进细胞分裂增殖和血管新生、促进铁代谢和参与诱导细胞凋亡等[3]。

2 HIF-1作用通路和活性调节机制

2.1 HIF-1 作用通路

HIF-1α通过一个氧化还原反应的信号通路来调节低氧活性,其调节机制涉及蛋白合成的增加、稳定性的升高和蛋白质降解的减少等。HIF-1α受到至少2条信号通路的调控:第1条通路的激活信号包括肿瘤抑制基因的缺失、生长因子(如上皮生长因子)的变化、肽的原癌基因的突变等因素,激活肌醇磷酸3-激酶(PI3K)和(m TOR)依赖的信号通路,引起HIF-lα的增加。有研究报道: PI3K途径必须在其他通路激活PI3K转录活性的共同作用下才能增加细胞核内HIF-1的含量。HIF-lα蛋白的合成增加有利于PI3K/Akt/FRAP通路的激活。第2条通路的激活信号为Co CI2和缺氧,包括抑制PHDs家族对HIF-lα的修饰。此外,HIF-lα被ET-I诱导激活后引起HIF-1的增多,从而激活HIF-1。

2.2 HIF-1 活性调节机制

细胞内氧浓度是调节HIF-1的蛋白转录活性和稳定性的主要因素,正常细胞内HIF-1含量很少,在低氧条件下,其HIF-1含量显著增加,这可能是因为在常氧条件下HIF-1迅速降解。HIF-1对细胞中氧浓度的变化比较敏感,在组织缺氧时可以迅速做出m RNA表达上的相应变化。HIF-1α蛋白稳定性受氧浓度调节的分子机制:常氧状态时,HIF-1α在脯氨酰羟化酶-1,2,3的作用下羟基化了402和564位的脯氨酸残基,林希病肿瘤因子(PVHL)与被羟化的HIF-1α结合,生成E3泛素-蛋白连接酶复合体,该复合体作用于HIF-1α的识别部位,才导致蛋白酶体降解HIF-1α。由于氧气增多抑制脯氨酸羟化酶的活性,故整个反应过程受氧浓度的影响较大。低氧时HIF-1α不能被羟化,因而不能与PVHL结合,从而使HIF-1α降解明显减少[5]。氧浓度对HIF-1α转录活性的调控机理:常氧条件下,由于羟化酶作用于HIF-1α,其天门冬氨酸残基被羟化,导致C-TAD与CBP、p300的结合被抑制,从而HIF-1α的转录活性也被抑制;低氧条件下,羟化酶活性被抑制,反馈性增强HIF-1α的转录活性。HIF-1α的反式活化结构域(TAD)要激活转录,必须与转录共活化因子CBP、p300等相互作用才行。另外,铁螯合剂和氯化钴可使HIF-1α与PVHL分离,从而诱导HIF-1α的表达,增强HIF-1转录活化功能;胰岛素、内皮生长因子、IGF-1、IGF2、血小板衍生生长因子、凝血酶及血管紧张肽等也能增强HIF-1转录活性。

HRG上的HIF-1低氧反应元件:HRG在HIF-1上的结合位点大多数位于5'启动子(如GLU、VEGF等),HIF-1介导低氧反应是采用以HRG的低氧反应元件的结合点与HIF-1相结合的方式。

3 HIF-1对低氧训练的调控

3.1 HIF-1 对低氧训练的调控概况

运动员抗 缺氧的能 力与有氧 代谢能力 关系密切 。低氧诱导HIF-1表达升高。低氧训练通过合理控制低氧浓度和时间,利用缺氧刺激运动员,目的提高运动员的低氧适应能力和运动成绩。常用的低氧训练有:高原训练、模拟高原训练、高住低练和间歇性低氧训练等。有研究认为:急性低氧使HIF-1表达增加,是机体应激所致;慢性低氧引起的HIF-1表达升高幅度下降是机体适应低氧的结果,可能是HRG的负反馈调节所致。随着氧浓度的下降,特别当氧浓度降到6%以下时,HIF-1提高增速。HIF-1对组织氧浓度的改变非常敏感。HIF-1α的表达在开始和结束都比较快,其半衰期在常氧下一般不超过5 min。HIF-1α的表达变化如此的迅速,据此对机体进行间歇性低氧或急性低氧刺激下以提高机体的低氧适应提供了依据性[2]。

HIF-1是体内感受氧浓度的关键调节因子,下调相关低氧反应基因的转录表达。低氧训练在基因水平上造成HIF-1m RNA上调,结果肌肉线粒体和毛细血管的密度增大,肌红蛋白、VEGF和糖酵解水平升高,促进EPO水平的上升以及血液运输氧能力的增加,有利于运动能力的提高。

3.2 HIF-1 对 EPO 及氧运输的影响

低氧训练使机体血清中的EPO浓度升高,介导EPO基因表达的关键因子是HIF-1。通过EPO的调控,HIF-1间接调节氧气的运输,对运动时机体的携氧能力有很大影响。HIF-1与EPO结合,通过反式激活作用激活EPO基因的转录,造成血液中Hb浓度的上升。EPO生成后释放入血,在骨髓中促使干细胞分化为原始红细胞,加快原始红细胞增殖和分化,使红细胞快速成熟和Hb合成增加,加速骨髓内的网织红细胞和红细胞释放入血液,血液中氧含量上升。有研究认为HIF-1通过对靶基因的低氧反应元件的作用来调控相关基因的表达,参与了红细胞生成、缺血/缺氧后细胞凋亡和增殖等过程,引起细胞一系列缺氧反应,从而保持机体氧浓度的稳定[5]。

在低氧条件下,HIF-1的转录被激活,诱导EPO的基因转录表达增多从而提高了血红蛋白在缺氧条件下的携氧能力;HIF-1还通过诱导如诱导型一氧化氮合酶(i NOS)等扩血管因子的表达来提高组织运输和利用氧的能力。

3.3 HIF-1 对 VEGF 的影响

VEGF基因对低氧感觉敏锐。低氧条件下,HIF-1诱导VEGF基因转录,促使组织毛细血管增生,这样既改善了骨骼肌和心肌的氧气和营养供应,又提高了机体的有氧代谢能力[6]。VEGF具有很强的促进血管内皮细胞分裂的功能,是血管生成的主要调节因子。低氧环境下毛细血管的增生,是机体的一种保护性反应。VEGF是HIF-1的一个靶基因,低氧刺激后,HIF-1通过转录和转录后水平的改变,促进VEGFm RNA的转录活化并提高其稳定性,使VEGF受体FLK1/KDR的表达上调,最终增加毛细血管的新生。当HIF-1的表达缺乏时,VEGF的m RNA水平明显降低。

有研究指出,VEGFm RNA的表达与HIF-1αm RNA的表达在低氧时一致,表明在低氧刺激下HIF-1表达的上升能激活VEGF的转录并且提高VEGFm RNA的稳定性。VEGF基因的表达上调并使血管的新生增加,有助于供给组织氧和营养,提高体能。

3.4 HIF-1 对糖代谢的影响

在低氧条件下,机体主要通过无氧糖酵解产生ATP供能的。在糖酵解过程中果糖磷酸激酶、甘油磷酸酸酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、醛缩酶和醇酶等酶都受到HIF-1的影响,合成增多,加速糖酵解的进行,通过糖酵解供能以满足机体对能量的需求。糖酵解供能使乳酸产生增加,致使细胞内正常的PH值下降,而HIF-1的目的基因跨膜碳酸酐酶被激活,将二碳化合物和质子转化为CO2,调节p H值,产生的CO2由血液运送到肺部排出体外。

同时,在摄取葡萄糖过程中,HIF-1也激活调控葡萄糖转运蛋白载体-1(GLU-1)和葡萄糖转运蛋白载体-3(GLU-3)的基因表达。有研究报道,肺泡上皮细胞的GLUT-1在低氧诱导下活性明显升高,且与氧气浓度和低氧持续时间呈正相关。氧气浓度越低,低氧持续时间越长,GLUT-1活性升高越显著。恢复常氧后,GLUT1活性迅速下降[7]。

在低氧条件下GLUT表达的增加和活性的增强,使糖代谢的速率维持在较高水平。通过HIF-1调节糖酵解,使运动员在缺氧条件下能量得到及时补充,提高其耐缺氧能力和运动能力。

4 结语

综上所述,HIF-1对运动能力的影响是积极的。在低氧下运动,HIF-1提高了EPO、VEGF基因的表达并且加速了糖酵解的进行,提高了运动员的运动能力。低氧环境下,通过对运动员HIF-1变化的分析和对HIF-1相关基因表达影响的研究,探讨低氧刺激下HIF-1的作用,为进一步揭示低氧训练提高运动成绩的机理提供理论依据。

摘要：该文通过对低氧诱导因子-1(HIF-1)1的活性调节机制、结构和生物学功能等的综述,重点分析了HIF-1在低氧训练中的表达。HIF-1转录调控低氧反应基因,从基因水平介导了对低氧的反应,是低氧诱导的核转录因子。低氧训练在分子基因水平上造成HIF-1m RNA上调,通过调控EPO水平以促进机体利用氧的能力,诸如肌红蛋白增多、VEGF表达上调和糖酵解速率升高,肌肉线粒体数量增多和毛细血管的密度增大,进而提高机体在缺氧状况下的运动能力。HIF-1调控诸多低氧反应基因的转录表达,是机体感受氧浓度变化的关键因素。

低氧诱导 第2篇

关键词：缺氧诱导因子-1α,肿瘤生成,结构,调控

低氧诱导因子(HIF)于20世纪50年代首次被放射肿瘤学家所描述,如今各方面研究已表明低HIF-1α已作为重要的分子介导因子参与肿瘤生成的各步骤。本文针对其结构、表达调控机制,及其在肿瘤形成过程中各方面的作用给出阐述。

1 HIF-1α的结构

低氧诱导因子(HIF)是PER-ARNT(arylhydrocarbon receptor nuclear translocator)-SIM(PAS)家族的成员,是由稳定表达的HIF-β及3种氧调HIF-α亚基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)构成的异二聚体。它们作为介导哺乳动物和人类细胞低氧反应的核转录因子,通过调节多个下游基因的表达来调控氧气的运输和细胞对低氧环境的适应。HIF-1作为HIF家族的第一个成员,是目前被认为最重要且研究最透彻的一种。HIF-1是由分子量为120 kDa的功能性α亚单位(HIF-1α)和分子量为91～94 kDa的结构性β亚单位(HIF-1β)组成的异源二聚体。HIF-1α是一个含有826个氨基酸的氧调节多聚肽,它包含四个结构域:一个在与DNA结合和二聚化中起作用的bHLH域,一个具有二聚化和靶基因特异性作用的PAS结构域A和B,一个与泛素-蛋白酶体降解通路有关的氧气依赖型降解域(ODDD)和两个转录激活结构域:N末端转录激活结构域(N-TAD)(与ODDD部分重合)和C末端转录激活结构域(C-TAD)。其余的调节区还包括:氮端、碳端的核定位信号域(NLS-N和NLS-C),脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸富集蛋白稳定结构域(PSTD)和转录抑制区域(ID)[1]。

2 HIF-1α的表达调控

十多年前,Semenza和同事证实了HIF基因与epo基因相连并诱导其在缺氧条件下进行转录。现今已知HIF可诱导涉及缺氧应答的多种基因。在体外多种细胞培养系统中,HIF在缺氧5%的情况下可被激活,且在氧浓度梯度降至0.2%～0.1%(1.6～0.8 mm Hg)几近无氧的条件下,其活性呈显著增长[2]。

HIF-1的生物活性主要依赖于HIF-1α亚基的表达和活性。HIF-1α在体内表达和活性受多水平的调控:mRNA表达水平、蛋白表达水平、核定位水平和转录激活。在这些调节中,研究最透彻的是HIF-1α蛋白水平的调节。HIF对于氧分压(pO2)的变化并无直接感知,调节的关键是一组依赖2-酮戊二酸及铁的加双氧酶,其属于已被详细研究的非血红素氧化酶家族(EC1-14.11.2)。由于这些酶的活性严格依赖细胞氧分压,因此它们才是真正的调节缺氧应答的氧敏分子。

目前已知有两种氧传感器控制HIF活性。第一种属于脯氨酸羟化酶结构域蛋白(PHDs)。PHDs羟化HIF-1α中ODDD区的两个脯氨酸残基(p402或p54)[3],这种HIF-α的修饰会与肿瘤抑制蛋白Von Hippel-Lindau(VHL)特异性快反应。VHL为E3泛素连接酶复合体的组分。随后,HIF-1α亚基被多泛素链标记,使其被蛋白酶系统降解。在含氧丰富的细胞中(pO2=21%),HIF在细胞蛋白中呈最短半衰期(<5 min)。在人体内的3种PHD异构体中,PHD2是在常氧条件下靶向降解HIF-1α的关键性限制酶,而PHD1和PHD3在慢性缺氧条件下起到一定生理作用。

第二种控制缺氧反应的传感器是一种天冬酰胺羟化酶,它属于HIF-1抑制因子(FIH)。这种酶在人类HIF-1α的C端转录激活结构域(C-TAD)处羟化一个天冬氨酸残基(N803),这种共价修饰阻止了C-TAD与转录辅激活因子(如p300和它的同源旁系物CBP)的反应。因此,两种代谢传感器,PHD2和FIH,通过控制降解和失活HIF-α亚基,确保了HIF通路在富氧细胞中的充分抑制。HIF-α亚基的一个有趣的特征是出现2个转录激活结构域(C-TAD和N-TAD),只有和p300/CBP反应的C-TAD易受FIH的羟化和抑制。笔者认为C-TAD和N-TAD可以区别不同缺氧基因的感应,而在自然存在的HIF-1α中,C-TAD的消除则保留了1/3的转录活性[4]。

3 HIF-1α在肿瘤形成过程中的作用

保持氧气动态平衡对细胞生存是必要的。氧分压的改变是引导细胞快速反应的一个主要刺激因素。缺氧可导致转录基因帮助供氧,包括糖酵解、红细胞生成、血管生成的方式。转录因子HIF是细胞反应的必需因子,重要的是,已发现HIF-1α可促进肿瘤发生中的关键步骤,包括血管新生、代谢、增殖、转移和分化。

3.1 新血管生成

癌细胞的生长需要通过新血管生成来获得必须的氧气和养分的供应,HIF-1能直接激活一系列促血管生成因子的表达,其中包括:VEGF、VEGF受体、FLT-1、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAL-1)、血管生成素(ANG-1和ANG-2)、血小板衍生生长因子B(PDGF-B)、酪氨酸激酶TIE-2受体和基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)。在由HIF-1诱导的一切促进血管生成因子中,还是以血管内皮生长因子-A为主,因为它有较强的血管生成特性,并在人类肿瘤中普遍表达[5]。

3.2 代谢

普遍认为,即使在有氧条件下,肿瘤细胞也会将细胞的代谢途径由有氧途径变为糖酵解途径。研究表明,在肿瘤细胞代谢中,HIF是一种重要介质,尤其是HIF-1能够在低氧或正常氧量细胞中直接调控参与糖酵解途径代谢中的众多基因表达,其中包括糖酵解酶、乳酸产物、丙酮酸代谢等。而且,通过激活C-Myc抑制子、MXI-1的活性和调控C-Myc蛋白的稳定性,HIF-1能够负性调节C-Myc活性和线粒体呼吸作用。因此,HIF-1是通过直接调控代谢有关基因并且间接抑制C-Myc活性来调节肿瘤细胞的代谢[6]。

3.3 增殖

与HIF-1相比,HIF-2在肿瘤细胞增殖方面起到了更主要的作用。HIF-2通过多种机制正性调控肿瘤的增殖:一方面,HIF-2通过调节C-Myc的活性,控制其与转录辅因子的反应,进而间接调节细胞周期中蛋白D2和蛋白激酶抑制子基因的表达,最终促进肿瘤细胞的增殖[7]。另一方面,HIF-2也可通过细胞周期蛋白D1的活性来调控细胞周期的进程,但机制尚未明确。

3.4 转移

转移是肿瘤致病过程中的一个关键环节,也是导致癌症患者死亡的重要原因。转移的过程包括肿瘤细胞侵入、内渗、外渗和增殖。在很多肿瘤的转移中,HIF-1通过调节转移过程中的重要因子,其中有CXCR4、E-钙粘素、LOX和SDF-1而促进转移。E-钙粘素通过与β连环蛋白的胞浆作用来调节细胞间黏附和刺激抗生长信号。E-钙粘素的失活会增大肿瘤转移的潜力,而它的表达将抑制转移。据报道,HIF-1能够上调E-钙粘素特异性抑制因子(Snail和SIP1)而抑制E-钙粘素的表达。HIF-1还能够激活细胞外基质单胺氧化酶LOX,而LOX作为HIF-1的直接靶点,能够促进癌细胞远处转移的潜能。此外有研究表明,在各种癌性细胞中,HIF-1能强力诱导趋化因子受体CXCR4和其配体SDF-1的表达,包括VHL缺乏的RCCs,非小细胞肺癌,胶质母细胞瘤,和血管内皮细胞等,在转移肿瘤细胞的定向迁移中起关键作用[8]。

3.5 分化

有证据表明肿瘤干细胞是肿瘤生长的重要介质。肿瘤起源于一小部分具有自我复制和分化能力的增殖细胞,而在缺氧条件下,HIF-1能够维持多种类型细胞处于未分化的状态。首先,HIF-1能够阻止远祖细胞分化同时促进肿瘤细胞去分化。研究证明缺氧条件会增强HIF-1依赖的Notch信号,而后HIF-1α会通过反应来稳定NotchICD结构域。其次,HIF也可直接激活干细胞的基因表达来促进未分化状态的维持。此外,缺氧亦能够维持人类ES细胞处于未分化状态和保持干细胞多能性。同时,缺氧hES细胞未分化状态的维持和Oct4的表达有关,而HIF-2可以直接调节Oct4的表达[9]。

4 HIF-1α在肿瘤治疗当中的治疗前景

HIF-1α在许多人类癌症中过表达,而HIF-1α表达的影响取决于癌症的类型。抑制HIF-1α的活性对癌症的抑制有利,因为这将使肿瘤生长的氧气和养分供应量不足[10]。

低氧诱导 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性SD大鼠96只,周龄8~10周,体重(250±30)g,购于辽宁长生生物技术有限公司,动物合格证号:211002300010781,动物许可证号:SCXK(辽)2015-0001。大鼠饲养在辽宁中医药大学附属第二医院(以下简称“我院”)实验动物中心,温度20~23℃,相对湿度50%~60%。按照随机数字表将其分为假手术组、模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组,每组24只。假手术组、模型组分别给予生理盐水、川芎赤芍组予川芎赤芍提取液,尼莫地平组予尼莫地平液,每日2次,连续给药。

1.2 实验药物与试剂

川芎和赤芍由我院临床药学实验室制成汤剂备用。川芎、赤芍提取液浓度为1.08 g生药/m L。阳性对照药尼莫地平片(亚宝药业集团股份有限公司,批号:150166),尼莫地平片配制成浓度1.08 mg/m L的溶液。Ang-1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(北京诚林生物科技有限公司,批号:E-30570);Mag NA Pure LC RNA Isolation Tissue(Roche,批号:12234000)。

1.3 主要仪器

罗氏全自动核酸提取系统(Roche,MPLC2.0);实时荧光定量PCR仪(Roche,LC480);罗氏组织匀浆仪(Roche,LR56495);电热恒温培养箱(厦门医疗电子仪器厂,出厂编号:82062);低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司,型号:TD5A-WS)。

1.4 模型制备

线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型[3]:3%水合氯醛腹腔注射麻醉后,SD大鼠仰卧固定于手术台上,颈部正中切口,暴露右侧颈总动脉,分离颈内、外动脉,在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉,右侧颈总动脉处剪口,插入头端圆钝直径为0.28 mm的MCAO栓线,进栓线长度18~19 mm,在大脑中动脉起始端线栓大鼠大脑中动脉。栓塞2 h后取出MCAO栓线。

1.5 取材与标本处理

各组于给药第3、7、14天分别处死大鼠8只。处置方法:3%水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉取血,每次取血4~5 m L,全血放在室温中静置30 min左右后3000 r/min,离心10 min,用移液器分离血清至EP管中,记号笔标上记号,放入-20℃冰箱中冻存备用。取血后将各组大鼠断头处死,立即取出脑组织后除去嗅球、小脑、脑干,取出右侧缺血脑组织,置-80℃冰箱进行冻存。

1.6 脑梗死面积(TTC染色)

将各组大鼠在7 d后进行断头取脑,去除嗅球、小脑、低位脑干,大鼠用3%水合氯醛麻醉后,断头取脑,将大鼠大脑置于-20℃冷冻20 min后,去掉嗅球、小脑和低位脑干,冠状切分脑组织成5片。用2%的红四氮唑将脑片染色,37℃培养箱中避光染色30 min,期间不断翻转脑片,使两面染色均匀。正常脑组织呈红色,而梗死脑组织则为白色。

1.7 观察指标

采用ELISA法测定大鼠血清Ang-1水平,采用实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织HIF-1α的表达情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析处理,计量资料数据采用均数±标准差(±s)表示,经方差齐性检验和正态性检验,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD法检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑梗死面积比较

假手术组:大脑红染,未发现任何白色梗死区域;模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组各组均出现不同面积的白色梗死灶,模型组梗死面积最大,川芎赤芍组、尼莫地平组白色梗死灶面积较模型组明显减小,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

注:与模型组比较,*P<0.05;与假手术组比较,#P<0.05

A:模型组;B:假手术组;C:川芎赤芍组;D:尼莫地平组

2.2 各组血清血管生成素-1水平比较

给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义(P<0.05);给药3、7、14 d,川芎赤芍组、尼莫地平组Ang-1水平较假手术组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示川芎赤芍对脑缺血损伤有治疗作用,可能是通过调节与血管再生有关因子的变化,改善了侧支循环的建立。见表2。

注:与模型组比较,*P<0.05;与假手术组比较,#P<0.05

2.3 各组缺血脑组织中HIF-1αm RNA相对表达量水平变化比较

给药3、7、14 d,模型组HIF-1αm RNA表达较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);给药3、7、14 d,模型组HIF-1αm RNA表达水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义(P<0.05);给药3、7、14 d,川芎赤芍组、尼莫地平组HIF-1αm RNA含量较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组给药7 d HIF-1αm RNA含量与本组给药3 d时比较,差异均有统计学意义(P<0.05),模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组给药14 d HIF-1αm RNA含量与本组给药3 d时比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

注:与模型组比较,*P<0.05;与假手术组比较,#P<0.05;与本组给药3 d比较,△P<0.05

3 讨论

血管生成素(Ang)是一族蛋白质分子,Ang-1是该家族成员之一,主要表达在血管旁细胞。通过Tie-2的磷酸化,Ang-1触发血管周细胞和血管内皮细胞之间的相互作用,从而促进新生血管的稳定和重塑。Ang/Tie信号通路在生理性、病理性血管生成过程中均发挥着重要的作用。Ang-1在血管新生过程中发挥重要作用。Ang-1和受体Tie-2相结合后,活化的内皮细胞能吸引血管平滑肌细胞和周细胞等形成完整的血管壁,促进血管新生[4,5,6]。Ang-1可以通过增加血管内皮细胞间连接的紧密性,减少血管的渗漏,从而减轻炎性反应。庄越等[7]发现Ang-1可能通过减轻脑血管炎性反应过程和维持血管内皮细胞完整性来减轻脑血管内皮细胞缺血再灌注损伤,从而起到保护作用。任虹宇等[8]结果提示,神经干细胞移植能够有效促进脑出血恢复期大鼠神经功能的恢复,其机制可能与增加出血周围脑组织促血管生成素及酪氨酸激酶受体2的含量有关。Ang-1是一种能够抵抗血管渗漏的内源性蛋白质因子,它能抵抗炎症以及血管内皮生长因子(VEGF)引起的血管渗漏,对VEGF促血管新生的功能有促进和互补作用,且并不影响血管的正常形态,长期高浓度的Ang-1对健康无明显不利影响[9]。研究显示,大鼠脑缺血再灌注7 d后,大脑患侧皮层Ang-1和Tie-2蛋白表达升高,给予莫诺苷治疗后,Ang-1和Tie-2蛋白表达水平进一步增加[10]。电针“百会”“水沟”“后三里”能有效对抗脑缺血再灌注损伤,其作用机制可能与促进HIF-1α及VEGF在海马的表达、调节脑缺血再灌注后血管新生进程有关[11]。丹龙醒脑方能够促进脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织血管新生,对缺血脑组织具有保护作用,其作用机制可能与上调Ang-1蛋白表达有关[12]。大鼠脑缺血后VEGF、Ang-1和Ang-2共同协调作用促进血管生成,中药脑泰方在脑缺血损伤后治疗血管新生样作用中发挥着促进作用[13]。

1992年首次发现HIF-1,Semenza等[14]在缺氧诱导的Hep3B细胞核提取物中发现,它是由氧分压调控的α亚基和基础性表达的β亚基构成的异源二聚体。HIF-1是细胞与组织为适应低氧压力环境产生的转录因子。HIF-1的活性主要通过HIF-1α的蛋白水平来调节。氧分压正常时,HIF-1α被脯氨酸羟化酶快速羟基化,而后在蛋白酶体中降解;低氧分压时,PHD活性降低,HIF-1α在胞浆中蓄积,与HIF-1β结合形成HIF-1后进入细胞核,与低氧反应元件结合,调控下游靶基因表达。在机体对低氧代偿的调节机制中,HIF-1是重要的细胞转录因子,在细胞氧稳态的调节过程中起到了核心作用。缺氧是诱导HIF-1表达的强因素,在脑缺血条件下内皮细胞上的HIF-1 m RNA表达明显增加。HIF-1的活性对于组织缺血后的恢复是非常重要的。HIF-1可以通过上调与血管新生系统相关蛋白的基因表达,如促进血管生成的VEGF及其受体,如诱导型一氧化氮合酶血红素氧化酶-1等来增加血流,降低缺血损伤。HIF-1是细胞与组织为适应低氧环境所产生的转录因子。HIF-1通过调节一系列基因,参与了血管生成、葡萄糖代谢、铁代谢及细胞增殖与存活等。脑缺血缺氧时,HIF-1α表达增多可以增加血液、氧及营养的供应。有研究显示在大鼠中动脉闭塞模型基因敲除大鼠,HIF在神经元的激活经过了一个双相过程,在缺血后6 h达到高峰,1 d时下降,但2 d后又持续升高至8 d的时候再下降[15]。

研究表明川芎、丹参、当归、三七、红花这些活血化瘀药都有促血管新生和保护血管的作用,能增加血管密度,促进脑梗死急性期侧枝循环的建立,减少后遗症的发生[16,17]。通络救脑注射液及其有效组分栀子苷、三七总皂苷均可通过抗氧化作用有效减轻内皮细胞拟缺血损伤,提高细胞活性[18]。经检索《普济方》数据库管理系统,同时含川芎赤芍的方剂高达3546首[19],现代药理研究提示,两药合用对脑缺血有调节作用[20]。脑缺血后脑微血管的完整性对神经系统的损伤与修复有明显作用,川芎赤芍可能通过升高Ang-1水平及HIF-1αm RNA的表达,对脑缺血后微血管的修复新生起作用,进而起到改善脑微循环的作用。

摘要：目的 探讨川芎赤芍对脑缺血再灌注大鼠血管生成素-1(Ang-1)及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、川芎赤芍组、尼莫地平组,以“Zea Longa线栓法”造成脑缺血再灌注大鼠模型。假手术组、模型组给予生理盐水,川芎赤芍组给予川芎赤芍提取液,尼莫地平组给予尼莫地平溶液,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定大鼠血清Ang-1水平,实时荧光定量PCR法检测HIF-1αm RNA的表达。结果 ELISA法测定大鼠血清Ang-1显示:给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);给药3、7、14 d,模型组Ang-1水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测HIF-1αm RNA显示:给药3、7、14 d,模型组HIF-1αm RNA表达较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);给药3、7、14 d,模型组HIF-1αm RNA表达水平显著低于川芎赤芍组、尼莫地平组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 川芎赤芍可显著升高血清中Ang-1水平及脑组织中HIF-1αm RNA的表达,其治疗脑梗死可能与促进脑血管新生有关。

低氧诱导 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌SMMC-7721细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床分子试验中心陈威主任惠赠;氯化钴 (Co Cl2) 和AG-490购自Sigma公司, 柴胡皂甙d购自江西本草天工有限公司;哺乳动物细胞总蛋白提取RIPA裂解液购自北京天根公司, 蛋白酶抑制剂Cocktail和磷酸酶抑制剂Phosstop为Roche公司产品, 免疫印迹一抗p-STAT3和HIF-1α兔抗人抗体均为美国CST公司产品, 免疫印迹一抗β-actin兔抗人抗体为北京博奥森公司产品, HRP标记羊抗兔二抗为Santa Cruz公司产品, ECL化学发光试剂盒为Pierce公司产品;细胞总RNA提取试剂盒Fast200购自上海飞捷生物, 逆转录试剂盒为Fermentas产品, PCR 2Master Mix为西安润德公司产品, PCR引物由北京三博远志生物技术有限技术公司合成, 序列如下, 扩增片段分别为111、223和179 bp。HIF-1α:Primer1:5'-CATTAGA AAGCAGTTCCGCAAGC-3', Primer2:5'-CAGTGGTA GTGGTGGCATTAGC-3';STAT3:Primer1:5'-GGCTT CTCCTTCTGGGTCTGG-3', Primer2:5'-TCTTACCGC TGATGTCCTTCTCC-3';β-actin:Primer1:5'-ATCGT GCGTGACATTAAGGAGAAG-3', Primer2:5'-AGGA AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

人肝癌SMMC-7721细胞培养在含10%新生牛血清 (血清56℃30 min灭活) 、青霉素和链霉素各为100 u/m L的RPMI-1640培养液中, 于37℃恒温、饱和湿度和5%二氧化碳的孵箱中传代培养。

1.2.2 主要药物配制

柴胡皂甙d和AG-490以DMSO溶解配成浓度分别为10 mg/m L和100mmol/L的储备液, 使用前以RPMI-1640培养液稀释成所需的工作浓度, DMSO在工作液中的终浓度始终0.1%;Co Cl2以三蒸水溶解, 配成150 mmol/L储备液, 一次性针头滤器无菌过滤分装备用。

1.2.3 免疫印迹检测p-STAT3和HIF-1α的表达

细胞分组如下:正常组, 缺氧组 (Co Cl2150μmol/L) , AG-490组 (AG-490 10/50/100μmol/L+Co Cl2150μmol/L) , 柴胡皂甙d组 (SSd2.5/5.0/10.0μg/m L+Co Cl2150μmol/L) , 添加相应干预24 h后取出置冰上, 4℃预冷PBS漂洗, 加入适量预冷RIPA裂解液 (含1Cocktail及Phosstop) , 4℃冰上裂解30min, 14 000 g离心力4℃离心20 min取上清, Bradford法测定蛋白浓度, 分装样品-70℃贮藏备用。取50μg总蛋白上样, 10%SDS-PAGE胶电泳, 半干式转膜, 5%BSA-TBST常温封闭1 h, p-STAT3和HIF-1α一抗1︰1 000稀释, β-actin一抗1︰400稀释, 4℃孵育过夜, 次日1︰10 000稀释的HRP标记羊抗兔二抗常温下孵育1 h, 添加ECL化学发光液体, 适度曝光后胶片图像扫描, 分析目的条带积分光密度值 (IOD) 。

1.2.4 R T-PCR检测STAT3和HIF-1α的m R N A水平

细胞分组同免疫印迹分组, 细胞干预完毕后取出, 应用Fast200快速RNA提取盒按说明提取细胞总RNA, 紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度, 按照Fermentas逆转录试剂盒将RNA逆转录为c DNA后并进行PCR反应, 总体系25μL, 基本反应参数设置为:94℃3 min, 94℃30 s, 58℃30 s, 72℃1 min, 总循环数30个循环, 72℃5 min后终止反应, PCR产物一次性上样, 2%琼脂糖凝胶电泳 (含0.5μg/m L EB) , 110 V恒压电泳, 电泳结束后凝胶成像分析系统下观察、保存图像, 进行图像分析。

1.3 统计分析

实验数据中的计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用t检验, 经SPSS11.0统计软件进行处理, 以P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 AG-490对S MMC-7721细胞中p-S TAT3和HIF-1α蛋白表达的影响

肝癌细胞SMMC-7721细胞在正常条件下便有一定水平的STAT3活化;正常组与Co Cl2模拟缺氧组相比, 两组p-STAT3蛋白的水平没有显著差别 (P>0.05) , 但缺氧组HIF-1α蛋白的水平显著高于正常组 (P<0.05) ;在Co Cl2模拟缺氧的基础上给以AG-490干预后, SMMC-7721细胞p-STAT3的表达出现显著下降, 与此相对应, AG-490干预24 h后HIF-1α蛋白的水平降低, 并呈现出一定的剂量依赖性 (见图1) 。

2.2 AG-490对S MMC-7721细胞中S TAT3和HIF-1αm RNA表达的影响

在SMMC-7721细胞中, RT-PCR检测示AG-490干预对STAT3及HIF-1αm RNA的水平没有明显影响 (见图2) , 各组m RNA水平比较没有明显差异 (P>0.05) 。

2.3 柴胡皂甙d对S MMC-7721细胞中p-S TAT3和HIF-1α蛋白表达的影响

如图3所示, 在SMMC-7721细胞中, 正常对照组与缺氧组p-STAT3蛋白的水平基本一致, 两组相比差异不具显著性 (P>0.05) ;柴胡皂甙d剂量依赖性降低了p-STAT3的蛋白水平, 其中柴胡皂甙d5μg/m L与10μg/m L组中p-STAT3下降明显, 同正常对照组相比差异具有显著性 (P<0.05) , 同时柴胡皂甙d剂量依赖性抑制了缺氧条件下HIF-1α的蛋白表达, 各剂量组同缺氧组相比差异具有显著性 (P<0.05) 。

2.4 柴胡皂甙d对S MMC-7721细胞中S TAT3、HIF-1αm RNA表达影响

RT-PCR检测发现 (见图4) , 正常组与缺氧组STAT3和HIF-1α的m RNA水平无明显差异, 而且柴胡皂甙d各剂量组对STAT3和HIF-1αm RNA的表达亦无明显影响, 各组比较差异不具显著性 (P>0.05) 。

3 讨论

实体瘤生长体积超过1 cm3后, 由于氧气弥散障碍便会出现肿瘤内部缺氧的现象, 此时肿瘤细胞的增殖就会因缺氧受到抑制, 严重缺氧时可以导致细胞坏死, 但是肿瘤可以通过某些机制适应和改善缺氧以继续生长、浸润和转移, 在此过程中HIF-1起主要作用。HIF-1由氧敏感的α亚单位和组成性表达的β亚单位组成。常氧条件下, HIF-1α很快被泛素-蛋白酶水解体系降解, 而在缺氧条件下变稳定, 在细胞内积聚, 入核, 与β亚单位形成异二聚体, 招募协同刺激因子CBP/P300, 作用于缺氧反应元件, 调节相应靶基因的表达, 相应的转录产物将在能量代谢、肿瘤血管形成等缺氧适应过程中发挥重要作用[5]。肝细胞癌是常见恶性肿瘤之一, 在慢性肝炎-肝硬化-肝癌多步骤多阶段发展的过程中, 肝脏组织结构及血流动力学发生显著变化, 门静脉供血减少, 肝动脉供血增加, 肿瘤细胞生长迅速, 癌组织易发生缺血缺氧, 因此, 在肿瘤低氧适应和恶性表型获得中起重要作用的HIF-1α与肝癌的发生发展密切相关, 以HIF-1α为靶点的治疗在肝癌的体外及动物实验中显示出一定的应用前景[10]。

STAT3与HIF-1α是目前明确鉴定的可以与VEGF启动子结合、促进VEGR表达、参与血管生成的两个转录因子, 而STAT3活化亦可以调控HIF-1α的表达进而间接参与血管生成。雌二醇可以剂量依赖性升高间质干细胞中VEGF和HIF-1α的表达, 此过程中可观察到STAT3的显著激活, 而STAT3敲除后消除了雌激素受体α所介导的HIF-1α及VEGF的表达[11]。在缺氧条件下的大鼠肾脏及人肾癌细胞中可以观察到STAT3活化, STAT3活化后通过阻断HIF-1α的降解和加速其合成, 提高了HIF-1α的稳定性和蛋白水平[12]。另外, STAT3是生长信号诱导及基础水平HIF-1α的表达过程中所必需的关键因素, 可以促进AKT的表达, 而PI3K/AKT通路是生长信号促进的HIF-1α表达的关键信号通路之一, 应用小分子抑制剂靶向作用于STAT3可以抑制体外HIF-1α和VEGF的表达以及体内肿瘤的生长和血管生成[8]。

在肝癌细胞中, 活化的STAT3是否可以参与HIF-1α的表达调控尚不可知。本实验发现, 在SMMC-7721细胞中有一定水平的活化状态的STAT3存在, 推测可能与癌细胞中某些信号通路的异常活化或血清中生长因子的刺激有关, 应用Jak2特异性抑制剂AG-490选择性抑制STAT3磷酸化后, 氯化钴缺氧条件下的SMMC-7721细胞中HIF-1α蛋白的水平显著降低, 但其m RNA的水平没有明显改变, 因而提示STAT3的活化参与了肝癌细胞HIF-1α表达的调节。有关STAT3的活化后调控HIF-1α蛋白表达的机制目前尚不明确, 有研究[13]发现STAT3可以同p VHL蛋白竞争结合HIF-1α, 减少p VHL介导的HIF-1α泛素化降解, 提高其稳定性和蛋白水平。另外, STAT3活化后可以促进AKT的表达, 通过PI3K/AKT信号通路促进HIF-1α的蛋白合成过程, 而对HIF-1α的m RNA表达没有影响[8]。上述研究表明, STAT3活化后主要通过某些信号转导通路影响HIF-1α蛋白的合成及稳定性上调HIF-1α蛋白的水平, 而非通过增加HIF-1α的转录来实现。本实验结果同上述研究相一致, 但亦有研究[14]显示, STAT3过度活化后可以同HIF-1α基因的启动子结合, 升高HIF-1α的m R-NA水平。

柴胡皂甙d是从中药柴胡中提取出的药物有效活性成分之一, 具有解热、镇痛、抗炎、调节免疫和抗肝纤维化等多种药理作用, 近年来研究报道柴胡皂甙d具有广泛的抗肿瘤作用。COX-2为一种诱导型环氧合酶, 同肝癌的发生和发展密切相关。柴胡皂甙d (2.5~15.0 mg/L) 可以降低人肝癌SMMC-7721细胞中COX-2蛋白及m RNA的水平, 抑制PGE2的释放, 抑制SMMC-7721细胞的增殖, 诱导凋亡, 此为柴胡皂甙d发挥其抗肿瘤的可能机制之一[6,7]。在二乙基亚硝胺 (DEN) 诱导的实验性大鼠肝癌模型中, 柴胡皂甙d各治疗组中大鼠的癌结节形成数目及大小均小于模型组, 且癌细胞的分化程度高, 异型性较低;在诱癌晚期, 治疗组癌组织中COX-2、VEGF和CD34的表达皆有明显下降, 因而提示柴胡皂甙d可能通过下调COX-2的表达抑制实验性大鼠肝癌的形成, 并通过抑制VEGF的表达发挥一定的抗血管形成作用[15]。

然而, 柴胡皂甙d是否可以通过抑制HIF-1α的表达来发挥抗肿瘤作用未见报道。本实验发现, 柴胡皂甙d可以剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞STAT3的磷酸化及降低HIF-1α的蛋白水平, 而对STAT3和HIF-1αm RNA的水平没有影响。鸡胚绒毛膜尿囊膜 (chorioallantoic membrane, CAM) 实验是评价药物抗肿瘤血管生成作用的重要研究方法, 柴胡皂甙d可以抑制CAM的中小血管形成[16]。鉴于STAT3与HIF-1α在VEGF表达及肿瘤血管生成中的重要地位, 因此推测柴胡皂甙d抑制肿瘤血管生成的作用一定程度上可能是通过影响STAT3活化及HIF-1α表达来实现的。另外, 在实验中还发现, 柴胡皂甙d 2.5μg/m L可以有效抑制HIF-1α蛋白的合成, 但对STAT3的磷酸化没有显著改变, 因而柴胡皂甙d可能通过非STAT3依赖的机制影响HIF-1α的表达。有研究[17]发现, 非甾体抗炎药可以促进p-VHL的表达, 增加HIF-1α的泛素化降解, 降低VEGF的表达, 延长原位肝癌模型大鼠的生存期, 而柴胡皂甙d具有非甾体抗炎药样的药理作用, 至于柴胡皂甙d是否可以通过促进p-VHL蛋白的表达, 影响HIF-1α蛋白的稳定性, 降低HIF-1α蛋白的水平而发挥其抗肿瘤作用, 尚需进一步研究。

摘要：目的 观察转录因子信号转导与激活因子3 (STAT3) 活化在人肝癌细胞低氧诱导因子-1α (HIF-1α) 表达中的作用, 探讨柴胡皂甙d是否可以通过影响STAT3/HIF-1α信号通路参与调节人肝癌细胞的HIF-1α表达, 以进一步阐释其抗肿瘤作用的机制。方法 ①以AG-490抑制STAT3磷酸化后观察氯化钴模拟缺氧条件下人肝癌SMMC-7721细胞中p-STAT3、HIF-1α蛋白及STAT3和HIF-1α的mRNA水平。②应用不同浓度的柴胡皂甙d作用于氯化钴模拟缺氧下培养的人肝癌SMMC-7721细胞, 干预24h后, 分别检测肝癌细胞中p-STAT3、HIF-1α蛋白及STAT3和HIF-1α的mRNA水平。结果 ①AG-490干预细胞后, 细胞中p-STAT3的表达明显降低, 而HIF-1α的蛋白水平随之出现显著下降, 各组STAT3和HIF-1α的mRNA水平没有明显改变。②柴胡皂甙d抑制了氯化钴模拟缺氧条件下p-STAT3蛋白的表达, 并呈现出剂量依赖性, HIF-1α的蛋白水平随柴胡皂甙d的浓度呈下降趋势, 各处理组STAT3和HIF-1α的mRNA水平没有明显改变。结论 转录因子STAT3的活化参与了缺氧条件下人肝癌细胞HIF-1α表达的调节, 柴胡皂甙d可以抑制缺氧条件下肝癌细胞HIF-1α的表达, 部分机制是通过影响STAT3的活化来实现的, 柴胡皂甙d可以通过抑制HIF-1α的表达发挥其抗肿瘤作用。

低氧诱导 第5篇

1 材料和方法

1.1 实验动物分组和模型制备

将体重为280~320 g的雄性Wistar大鼠(购自四川大学动物实验中心)40只随机分为正常对照组、低氧组、百合碱组、低氧 + 百合碱组,每组10只,低氧组采用常压间断低氧法建立肺动脉高压实验模型,低氧浓度为(10±0.5)%,每天低氧8 h,持续3周,舱内二氧化碳和水蒸气分别用钠石灰和氯化钙吸收[5]。百合碱组:按参考文献[6]将MCT结晶溶解为1%的溶液,于大鼠腹腔内以60 mg/kg注射。低氧 + 百合碱组:将1%MCT溶液以60 mg/kg注射于大鼠腹腔,并将其与低氧组大鼠同样置于低氧仓,每天低氧时间跟低氧组相同,对照组与低氧组均以60 mg/kg于腹腔内注射生理盐水,四组均予以同等饲料、饮水下饲养3周。

1.2 肺血流动力学和右心室肥厚的检测

大鼠经浓度为1.5%乌司他丁(0.25 ml/100 g)腹腔内注射麻醉,剥离出其右侧颈外静脉并剪一V形切口,插入微导管至肺动脉,肝素抗凝,导管另一端接压力传感器,用BL-420+ 生物机能实验系统(成都泰盟生物科技有限公司) 测定平均肺动脉压力(m PAP),测定结束后取出心脏和肺脏,分离右心室(RV)、左心室 + 室间隔(LV+S),滤纸吸干后依次称重,以RV/(LV+S)比值即RVH I反映右心室肥厚情况,肺组织置于 -70℃冰箱冻存备用。

1.3 肺组织病理学标本制备及观察

取大鼠左上肺组织经4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片进行HE染色,显微镜下观察肺小动脉形态学改变。采集图像后采用Image Pro Analysis软件分析,测量肺小动脉(每张切片观察10个视野的肺动脉直径)的中膜厚度(内、外弹力板之间的厚度,WT)和血管的外径(外弹力板的平均直径,ED),计算管壁厚度占外径的百分比(WT%),反映肺小动脉管壁的增厚程度。

1.4 肺组织免疫组织化学染色

肺组织标本经甲醛固定后以石蜡包埋,石蜡切片经常规脱蜡至水、抗原修复及山羊血清封闭,依次加一抗(一抗及SP试剂盒均购自北京博奥森生物有限公司,二者一抗稀释浓度分别为1∶500和1∶100)、二抗,DAB显色,苏木素复染后脱水封片,以PBS代替一抗做阴性对照,胞质出现棕黄色为阳性。将免疫组化切片放大400倍后以Image Pro Analysis软件分析数据,选取直径为50~100μm肺动脉,分析各组肺血管免疫组化阳性细胞光密度值并进行比较。

1.5 统计方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组均数比较采用单因素方差分析,组间均数之间两两比较采用LSD-t法,将实验大鼠肺组织免疫组化的FHL1和Paxillin表达量分别与m PAP、肺血管重塑指标WT%进行相关性分析,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mPAP、RVHI及 WT%的检测

低氧组、百合碱组及低氧 + 百合碱组大鼠的mPAP与对照组相比均显著升高(P <0.01),三组的RVHI与对照组相比均显著升高(P <0.01),低氧组与百合碱组的RVHI相比,差异无统计学意义(P >0.05),低氧组与低氧 + 百合碱组的RVHI相比,差异无统计学意义(P >0.05),三组的WT%与对照组相比均显著升高(P <0.01),见表1。

2.2 肺组织病理学改变及免疫组化 FHL1 和 Paxillin 表达情况

HE染色显示各实验组肺动脉较对照组管壁增厚,管腔狭窄。免疫组化染色显示各实验组肺小动脉FHL1和Paxillin蛋白表达较强,二者主要表达于肺血管壁及血管旁组织以及气道上皮,呈棕黄色。扫描统计结果提示,二者在各实验组表达较对照组明显增强(P <0.05)。见表2、附图。

2.3 相关性分析

实验组大鼠肺组织FHL1表达与mPAP、WT%呈显著正相关(r =0.625,0.728,P <0.05),实验组大鼠肺组织Paxillin表达与m PAP、WT%呈显著正相关(r =0.675,0.713,P <0.05),FHL1表达与Paxillin水平呈显著正相关(r =0.792,P <0.01) 。

( ± s)

注:与对照组比较,P <0.01,1 mm Hg=0.133 KPa

(± s)

注:1)与对照组比较均,P <0.05;2)与对照组比较均,P <0.01

A ~ D:对照组 、 低氧组 、 百合碱组 、 低氧 + 百合碱组 HE 染色结果( × 200);E ~ H 对照组 、 低氧组 、 百合碱组 、 低氧 + 百合碱组 FHL1 表达情(SP × 200);I ~ L 分别为对照组 、 低氧组 、 百合碱组 、 低氧 + 百合碱组 Paxillin 表达情况(SP × 400)

3 讨论

肺动脉高压发病机制复杂,诊断相对困难,降低人类生活质量。其病理改变的核心在于肺动脉血管平滑肌细胞的增殖和迁移,肺动脉高压血管重塑是一个复杂的、多因素参与的过程,与呼吸系统疾病相关的肺动脉高压的发病机制主要包括低氧性血管收缩、炎症及吸烟的毒性损伤等[7]。本研究分别以常压低氧和百合碱注射等方法建立大鼠肺动脉高压模型,造模后大鼠mPAP显著升高,提示形成了肺动脉高压,而RV/(LV+S)比值的增加和肺动脉中膜的增厚,进一步说明了存在肺动脉高压并导致了右心室肥厚。实验结果显示低氧 + 百合碱组的RVHI、WT%均高于低氧组及百合碱组,但其mPAP则相对低氧组及百合碱组增高不明显。这可能是因为肺动脉压力只是一种表现形式,严重的患者肺动脉压力可能并不高,但低氧 + 百合碱组大鼠形成的肺动脉高压可能比低氧组及百合碱组更为严重[8]。三组大鼠mPAP、RVHI、WT%的明显升高表明低氧 / 炎症诱导的肺动脉高压模型建立成功。