信号蛋白论文范文

信号蛋白论文范文（精选8篇）

信号蛋白论文 第1篇

神经系统细胞使用多巴胺、血清素及去甲肾上腺素等小分子神经递质进行沟通。多巴胺与诸如记忆等认知功能相关, 而血清素负责情绪控制, 去甲肾上腺素则与注意力和觉醒有关。脑细胞通过神经突触传递化学递质构成复杂的信息网络系统。电信号可以使突触小泡与膜融合, 并将化学递质释放, 这一过程以毫秒的速度发生。

哥本哈根哥廷根大学和阿姆斯特丹大学的研究人员一直在研究参与膜融合的核心蛋白复合物 (SNARE复合体) , 为大脑神经的迅捷传递速度寻求解释。他们发现, 突触小泡含有不少于3份连接桥或“SNARE复合体”。囊泡只和一个SNARE复合体较长时间地与细胞膜融合, 慢慢地分泌神经递质。S N A R E复合体的前体在囊泡到达目标膜之前出现。至少有三个SNARE复合体串联时, 同步融合启动。如果小泡只有一个SNARE复合体, 就会长时间与目标膜融合。

信号蛋白论文 第2篇

细胞使用相对有限的蛋白质组分传递大量的信号,因此不同的信号通常由相同的蛋白质组分传递.这些蛋白质组分是如何选择性地参与不同的信号通路,“高保真”地传递不同的刺激,从而产生特定的细胞应答,是目前细胞生物学领域中的研究热点和难点之一.鉴于Scaffold蛋白在确保信号转导专一性和保真性中的关键作用,作者基于酵母S. cerevisiae的`生物学实验数据,建立了由Scaffold介导的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联信号转导网络的数学模型.并对已报道的工作进行扩展,给出了多条信号级联网络的“专一性(specificity)”和“保真性(fidelity)”的精确数学定义,计算了MAPK信号网络的专一性和保真性的解析解.用这些解定量分析细胞信号转导的专一性和保真性与信号通路各种动力学参数(输入信号的强度和时间、反应率、磷酸化和去磷酸化系数、降解系数等)之间的关系,从理论上阐述Scaffold蛋白通过隔离(sequestration)和选择性激活(selective activation)等机制增强信号转导网络的专一性和保真性.从而有助于加佑深对细胞信号转导及其调控过程的系统理解,为揭示某些因细胞信号转导异常所致疾病的发生机理,寻找治疗药物提供新的思路.

作 者：邹秀芬 许志强 潘兹书 ZOU Xiu-fen XU Zhi-qiang PAN Zi-shu 作者单位：邹秀芬,许志强,ZOU Xiu-fen,XU Zhi-qiang(武汉大学数学与统计学院,武汉,430072)

潘兹书,PAN Zi-shu(武汉大学生命科学学院,武汉,430072)

信号蛋白论文 第3篇

外源蛋白在酵母系统中的分泌机制是多样的,其中信号肽引导蛋白质的分泌是蛋白质释放的主要方式之一,而以往对于如何提高蛋白质在酵母表达系统中分泌效率,最终获得高表达量的蛋白用于研究和生产,其描述并不全面,本文就信号肽对酵母系统分泌效率的影响和研究进展进行较为全面综述。

1 信号肽简介

信号肽(signal peptide)是存在于分泌蛋白质N末端的特异氨基酸序列,引导新合成的分泌性蛋白质至不同的转运系统。这些序列由10~40个氨基酸残基组成,包括三个区:一个带正电的N末端,称为碱性氨基末端:一个中间疏水序列,由一段长度为10~35个氨基酸残基组成的高度疏水性的氨基酸(如丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸和苯丙氨酸)肽链,形成一段a螺旋结构,它是信号肽的主要功能区;一个较长的带负电荷的C末端,含极性、小分子氨基酸,是信号序列切割位点,也称加工区。

在蛋白质合成过程中,当多肽链延伸至80个左右氨基酸时,信号肽序列被信号识别颗粒(SRP)所识别,蛋白质合成暂停或减缓,信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上,蛋白质合成重新开始。分泌型蛋白在信号肽的引导下进入内质网腔,而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除[2],多肽链继续延伸,直至完成整条多肽链的合成。在多肽链从内质网通过高尔基体运输到细胞表面的囊泡之后,高尔基体产生的分泌小泡与质膜融合,泡内的蛋白被释放到胞外空间,此即为蛋白质的合成分泌过程。

2 信号肽的选择

信号肽没有严格专一性,酵母系统对信号肽的利用有一定的灵活性,如何选择适当的信号肽直接影响蛋白质在酵母系统中的分泌水平。

2.1 蛋白质自身信号肽

外源蛋白的自身信号肽对切割位点有把握,可以得到天然的N末端,部分蛋白质利用自身信号肽即可引导蛋白质在酵母中的高效表达,Markus等用酸性磷酸脂酶(phosphatase 1,PHO1)、α因子信号肽(mating factorα,MF-α)和天然外源基因信号肽表达小鼠5HT5A5-羟色胺受体,发现用天然信号肽的表达量比PHO1和MF-α信号肽高。在研究来源于米曲霉菌的碱性蛋白酶在毕赤酵母中的表达时,利用自身信号肽比选用MF-α信号肽表达量提高了1.5倍[3]。还有如漆酶、木聚糖酶、Ex-4/HSA等[4,5,6,7]利用自身信号肽也能满足分泌需要。

在不同的酵母表达系统中,信号肽的选择也不是绝对的。Anand Ghosalkar等在研究人IFN-α2b在酵母中的表达时,选用了其自身信号肽、MF-α和去除了Glu-Ala重复序列(EAEA)的MF-α三种不同的信号肽,发现其自身信号肽不能促进人IFN-α2b的分泌[8],而IFN-α2b在啤酒酵母表达中利用自身信号肽则可以得到有效分泌。这就说明信号肽的选择不仅与蛋白质本身特性有关,还与表达系统的选择有关,例如利用MF-α信号肽前体引导IFN-α2b在酵母表达系统中的分泌,发现在毕赤酵母中的表达比啤酒酵母高100多倍。

2.2 酵母信号肽

一些蛋白质利用自身信号肽虽然可引导蛋白质在酵母中的高效表达,然而大部分蛋白质利用自身信号肽引导蛋白在酵母系统中的分泌效率很低,如脂肪酶等。往往会出现目的蛋白胞内堆积不能有效分泌表达的现象,且表达的重组蛋白较易降解。因此常优先选用酵母特有的分泌信号肽表达外源基因,会得到较好的分泌效果。

酵母信号肽主要有来自啤酒酵母的MF-α,酸性磷酸脂酶PHO1信号肽,蔗糖酶基因(sucrase2,SUC2)信号肽、Killer毒素信号肽、间质金属蛋白酶(MMP)/间质金属蛋白酶组织抑制剂信号肽、菊粉酶信号肽(INU)等,还有一些新的信号肽不断被发现和利用。其中MF-α在酵母表达外源蛋白中应用最为广泛[9,10]。如Akira Murasugi等用MF-α、天然信号肽和PHO1信号肽来引导人重组肝素结合细胞因子在毕赤酵母中的分泌发现,三种信号肽均可以引导蛋白的分泌,但是以MF-α的分泌效率最高,可能与MF-α前导序列引导蛋白至高尔基体或小囊泡的效率有关,也可能与蛋白质折叠和二硫键形成有关[11]。MF-α对引导小分子多肽和蛋白的分泌非常有效,如对降钙素、抑肽酶、表皮生长因子、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)、单链抗体Fv片段、凝血因子Ⅶ等[12]。但MF-α对于大分子蛋白的分泌效果并不明显,选用其他新的信号肽在一定程度上可以提高外源蛋白的分泌。将酿酒酵母中的α因子信号肽替换为来自于克鲁维酵母的INU,能够促进多种外源蛋白分泌到胞外,如引导非糖基化蛋白如人脂肪皮质l和白介素2分泌,还有大分子糖蛋白如α1-抗胰蛋白酶(αl-AT)、β-葡聚糖酶的分泌。

2.3 其他信号肽

在选用酵母特有信号肽和自身信号肽都无法达到很好的分泌效率情况下,可以选用外源信号肽来引导异源蛋白的分泌,如利用HSA信号肽可促进人体溶菌酶在酵母中的高表达[13]。

以上叙述说明在同一表达系统中,不同的信号肽对同一蛋白的引导效率是不一样的,而在不同的表达系统不同的信号肽的分泌效率也是不一样的,需要选择适当的信号肽才能促进外源蛋白的高效表达。

3 信号肽改造

当然目前研究中除了选用恰当的信号肽之外,人们正在不断探索新的方法,对信号肽进行改造,来达到提高分泌效率的目的。根据研究报道,对信号肽结构的适当改变(如疏水性、序列、突变、不同信号肽融合等)可能会提高外源蛋白的分泌效率。

3.1 信号肽疏水性改变

信号肽假说认为因为信号肽中存在的疏水结构,蛋白质才能跨膜送输。一般认为疏水区长度越长、疏水性越强的蛋白质其分泌效率越高。增加信号肽N端的正电荷或增加信号肽疏水核心H区的疏水性或长度,有利于提高信号肽的加工效率[14]。如改变酵母PHOA信号肽疏水核心时发现,当Leu:Ala比值为6:4时,其分泌效率最高,在此比值附近,信号肽的分泌效率随疏水性增强而提高。另有研究发现,合成一段含10个Leu的强疏水核心的信号肽ASP(artiifcial signal peptide)与青霉素G酰化酶(penillicin G acylase PAC)野生型信号肽(wild type signal peptide,WTSP)融合使PAC的分泌效率比野生型信号肽WTSP提高了约41%。Geir Mathiesen等首次对植物乳杆菌WCFS1信号肽进行预测,研究其分泌功能时发现对蛋白分泌效率较高的信号肽具有高疏水性、一个跨膜螺旋的存在、在外源蛋白上无锚定序列的存在,同时H+C结构域长度也是影响信号肽分泌效率的一个因素[15]。

然而,也有例外。Ryohei Sato等认为鲤鱼和大鼠乙酰胆碱酯酶(ACh E)自身信号肽之所以比MF-a前导肽分泌效率高,有可能与其自身信号肽的疏水性更大有关,但是研究者在实验中并没有发现分泌效率与ACh E信号肽疏水性的相关性。提示ACh E的信号肽可能作为一种新的信号肽引导异源蛋白在酵母系统中的高效表达[16]。

3.2 信号肽序列改变

蛋白分泌效率与信号肽的序列也存在相关性。Stephan A等在研究谷氨酰基环化酶同工酶(iso QCs)在毕赤酵母中的表达时,采用MF-α作为信号肽并不能促进其高表达,而当在N末端插入糖基化位点缩短N末端后,可使iso QCs的分泌提高100倍[17]。在MF-α中间插入毕赤酵母Aoxl蛋白质的N端EEAEAEAEPK共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高了2倍以上。也有研究在MF4I信号肽序列的N端分别引入1-10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸,构成10种不同的分泌信号肽序列,用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。其中以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比,使植酸酶分泌表达量增加5倍。此外在MF4I信号肽的引导序列的内切蛋白酶间增加了E E A E A E A E A P和K共10个氨基酸,进一步提高信号肽的分泌效率,使表达又提高约35%。经过修饰的天然信号肽可使人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)在酵母中的分泌提高3倍[18]。这些研究提示适当改变信号肽N端氨基酸的序列可以提高外源蛋白的分泌效率,但目前对于氨基酸的具体改变依据有待进一步研究。

3.4 信号肽位点突变

信号肽C端氨基酸残基的缺失,使H区更靠近切割位点,可能有利于蛋白的易位;而增加信号肽C端的极性,则可能会使信号肽的空间结构发生变化,降低其加工效率。另外,信号肽切割位点的氨基酸序列的改变会影响信号肽的加工效率,从而影响蛋白质的分泌效率。

3.5 偏爱密码子的应用

各种生物的密码子使用并不是随机的,而有一定的偏爱性。研究表明,在所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的。人们通过实验证明,在各种外源基因表达系统中,如果按照宿主细胞的偏爱性将目的基因编码区全部进行优化,将使表达量提高10~50倍,即使仅将5′端编码区进行改造或者改变其中的稀有密码子,也可大幅度提高蛋白的表达量。

在酵母表达载体构建过程中,将信号肽序列按酵母偏爱密码子进行优化,明显提高了外源蛋白的分泌效率。如按毕赤酵母偏爱密码合成了α因子信号肽序列MF4I,使植酸酶的分泌表达量增加。将PPICKg的信号肽序列进行密码子优化和适当地增加氨基酸,构建新的信号肽MS,有效提高黑曲霉植酸酶基因在酵母载体中的表达量。

3.6 增强子的应用

分泌增强子以其它信号肽为前导肽,发挥增强作用。据报道,人白介素-1β(human interleukin l beta,h IL-lβ)和白介素-1受体拮抗剂(IL-1rα)是非常有效的增强子,以h IL-lβ和IL-1rα与外源蛋白N末端融合,可大大促进外源蛋白在酿酒酵母的高效分泌,利用h IL-1β作为分泌增强子,促进了治疗性人粒细胞集落刺落因子(h G-CSF)、人生长激素(h GH)和牛肠激酶等在酵母中的高效分泌。当h IL-1β第7位天门冬酰胺(Asn7)和IL-1rα第84位Asn84被谷氨酰胺(Gln)取代之后可大大提高rh G-CSF的分泌效率,当增加h IL-1βN末端N-糖基化位点可使rh G-CSF分泌效率提高两倍[19]。将h IL-lβN端(Ser5-Ala28)编码序列与HBV表面抗原基因融合,以来源于克鲁维酵母的内毒素(killer toxin)信号序列为前导肽,也明显促进了HBV表面抗原在酿酒酵母的分泌[20]。

除了h IL-lβ和IL-1rα,也有新的分泌增强子被发现和利用。Wei Z等利用人巨细胞病毒增强子(HCMV)有效促进了吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂α2(DSPA alpha2)在毕赤酵母的高效表达[21]。也有研究显示,利用来源于木霉属内切葡聚糖酶II(THEG)的纤维素结合域(CBD)作为增强子,与嗜热脂肪芽孢杆菌L1脂肪酶结合形成CBD-linker-L1脂肪酶在α淀粉酶信号肽的引导下,在酿酒酵母菌中的表达量提高了7倍。当在CBD-linker-L1连接处加上Kex2切割位点后可得到切割正确的蛋白质,并不影响其分泌效率[22]。

4 存在问题

4.1 切割不完全现象

酵母表达系统产物存在的一个问题是信号肽切除不完全。信号肽被信号肽酶正确识别和切割时,能有效提高蛋白质的分泌效率。信号肽在引导蛋白质移动的过程中前导序列被信号肽Kex2切割酶切除从而得到成熟的蛋白质。α因子信号序列的切割位点Kex2在AGA和GAG之间,在AGA后面直接插入目的基因可维持蛋白质N端的天然序列。当Kex2位点后面的氨基酸残基比较小时,对切割的影响不大,但Kex2不能切割N-末端含碱性氨基酸的蛋白质[17]。如在研究BPT1在酵母系统中的表达时,因其N-末端序列为精氨酸-脯氨酸-天冬氨酸,因此利用a信号肽不能使其得到正确的加工和有效分泌,当利用PHO1和白蛋白信号肽作为信号肽能高效表达具有正确N-端序列的r BPT1。RNase U2的第一个半胱氨酸(Cys)被丝氨酸(Ser)取代以后,可明显促进其分泌,同时不存在MF-α切割不完全现象[23]。

4.1.1 Glu-Ala序列的作用

有研究发现当无Glu-Ala序列存在于MF-α信号肽中时,可以得到与天然人IFN-α2b一样的蛋白在毕赤酵母的高效表达。如在毕赤酵母中表达人三叶因子3(h TFF3)时,正向引物中加入α因子信号肽酶切序列,反向引物中删去表达Glu-Ala的基因序列,可得到与天然h TFF3N端序列相同的蛋白。反之在表达大鼠内源因子及人表皮生长因子时采用加入STE13切割部分Glu-Ala或其重复序列的方法,结果重组蛋白N-端存在Glu-Ala未切割完全的蛋白序列。说明GluAla序列的存在对信号肽的切割不完全有一定的影响。

4.1.2 全前导肽序列(pre-pro)的应用

外源蛋白形成的三级结构可通过对相应酶切位点的保护作用,而降低信号酶对信号序列的酶切效率。研究发现在目的蛋白前面加入全前导肽序列(pre-pro)可提高切割效率,从而提高分泌表达的产量[24]。如在研究竹芋蛋白在毕赤酵母中的表达时,选用含有Kex2切割位点的MF-α时,竹芋蛋白N端不能得到正确切割,当竹芋蛋白含有N端前导序列时可得到正确的成熟蛋白,而其C末端对其分泌效率并无影响[25]。但Zhao HL等在毕赤酵母中表达来自豹纹蛙的核糖核酸酶Onconase时,利用MF-α-pre-pro却不能获得正确的N-末端,当用MF-α-pre代替后可促进Onconase的正确而高效的分泌,并且具有良好的酶活[26]。所以信号肽的分泌效率影响因素不是绝对的,要根据实际情况进行选择和改造。

4.1.3 其他:

在构建载体p YA-4时,预先除去前导肽编码顺序第85密码子下游的4个密码子,在此处重建一个HindⅢ位点,得到的成熟蛋白质没有多余的氨基酸残基。也有将启动子和目的基因连接处寡核苷酸定向缺失诱变促进了含有N天然端的成熟目的蛋白的释放,在一定程度上解决了信号肽加工不完全的问题。这可能与N-末端蛋白质所含氨基酸的酸碱性控制有关。

4.2 无法预测

目前对信号肽的应用存在的最大问题就是无法预测。并没有有效的方法预测哪种信号肽对于具体哪一种蛋白的表达是最有效的,并且同一信号肽引导蛋白表达在不同的酵母表达系统分泌效率也不一样,因此只能通过选择适当的策略和必要的实验来确定最后使用的信号肽。

5 前景与展望

信号蛋白论文 第4篇

冠心病(CHD)是严重影响人类健康的常见病、多发病,是威胁人类健康的疾病之一,预防和治疗冠心病成为保护人类健康的重要课题。冠心病属于中医“胸痹”“心痛”“真心痛”等范畴。张仲景在《金匮要略》中提到:“夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者责其极虚也”。将胸痹病机概括为“阳微阴弦”, “阳微”即为寸口脉沉而细,系指上焦阳气不足,胸阳不振,“责其极虚也”;“阴弦”即尺脉弦紧,意指阴邪内盛, 水饮停聚,上泛胸中而致胸痹心痛,揭示冠心病、胸痹乃本虚标实之病变实质。从20世纪60年代起,中医开始研究CHD的病因病机特点,20世纪70年代始,逐渐认识到“血瘀”是CHD的主要病理因素,贯穿于CHD的发病始终。除了“血瘀”“痰浊”等病理因素外,本病的病理特点是本虚而标实,虚实互见。虚以心气虚为主,旁及脾肾;标实以瘀血、痰浊为主,寒凝、气滞次之。 随着循证医学的理念在中医学中的逐渐渗透,众多的临床调查研究发现冠心病的中医证型以气虚血瘀证最为多见,其中气虚 证是冠心 病的主要 发病机制 之一[1,2]。

从冠心病的发病特点看,冠心病多发于老年,冬季多发,尤其是不良心血管事件(心肌梗死、心源性死亡等)多发于冬季,这与老年人正气亏虚,冬季寒冷,阳气亏虚有关。研究证实[3]随着年龄的增大CHD的发病率显著增加,与青中年相比,老年人群年龄每增加10岁,冠心病的发病风险增加12.70%。可见冠心病的发生与年老体衰、脏腑功能减退、抗病能力低下密切相关。无论寒湿、痰浊、气滞、气虚都可致病,但外邪致病多以气虚为前提条件。“正气亏虚”以心气虚最为突出,心气无力推动血流之运行,自然生痰、生瘀。

针对冠心病气虚这一病理特点,应用补气中药多能收到良好疗效。陈可冀院士对冠心病的诊疗经验提出“三通”和“两补”治疗心绞痛的临证思想,前瞻性队列研究结果显示补气法治疗心绞痛有助于减少终点事件的发生[4]。冠心病介入术后中医证候调查也显示介入术后气虚证明显增加,给予补气药物对于冠心病介入术后尤为重要[5]。目前临床中药治疗冠心病心绞痛的用药分析显示,大量治疗冠心病心绞痛的方剂涉及的中药范围非常广,其中主要以活血化瘀、补气药为主,使用频率最高[6]。

总之,气虚是冠心病发病的主要病因之一,针对这一特点,对于冠心病高危人群给予补气中药治疗,增强机体御邪的能力,达到“正气存内,邪不可干”,以减少冠心病心绞痛发病及不良心血管事件的发生。

2腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路在缺血再灌注中的作用

AMPK作为一种能量调控器,对心脏尤其是当心脏面临缺血性损伤对能量需求显著增加的时候具有重要作用。活化的AMPK能够增加葡萄糖摄取和糖酵 解,加速脂肪酸氧化增加心肌组织的能量供应,并能抑制心肌细胞凋亡来保护心肌组织。

2.1调节心肌能量代谢,保护心脏功能Kudo等[7]率先发现了在心肌缺血中AMPK被快速激活。AMPK的激活很可能是通过开启三 磷酸腺苷 (ATP)产生通路,增加葡萄糖和脂肪酸的代谢来维持ATP水平,从而减轻心肌损伤,保护心脏功能,其具体机制为:1增加心肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)转运至细胞膜,从而增加葡萄糖的摄取和酵解[8]。这可能与AMPK与TAB1蛋白的相互作用而引起的p38分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的自动磷酸化和活化有关;2通过蛋白激酶C(PKC)使缺血心肌GLUT-4 mRNA表达增加, 加速葡萄糖的摄取和利用[9]。3 AMPK磷酸化并激活磷酸果糖激酶-2,产生2,6-二磷酸果搪,加速糖原分解,从而产热供 能[10]。 4抑制乙酰 辅酶A羧化酶 (ACC)的活性,降低丙二酰辅酶A的水平,减弱对肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)的抑制作用,增加脂肪酸氧化,产热供能[8]。在缺血心脏中,AMPK的活化是心脏的一个适应性反应,它能够提供心脏所需要的ATP,从而在缺氧时保护心脏组织使其免受损害[11,12,13]。

2.2抑制心肌细胞凋亡,保护心脏功能研究表明, AMPK的活化具 有抗凋亡 作用。Russell等[14]对AMPK活性被长期抑制的转基因小鼠进行了研究,发现其心 脏功能正 常 ,无心肌肥 大或心肌 纤维化 ,但LV dp/dt低于野生型鼠。在低流量缺血和缺血再灌注后,与野生型鼠比较,转基因鼠心功能恢复过程受损, 心肌损伤增加,Caspase-3活性增加,心肌细胞凋亡增加。Shibata等[13]研究发现,脂联素缺乏的大鼠缺血再灌注后,心肌细胞凋亡增加。补充脂联素后,间接活化AMPK,抑制了凋亡。研究还发现,应用脂联素后的新生心肌细胞能够抵御缺氧所导致的凋亡。这表明脂联素具有 抗凋亡作 用,而且其抗 凋亡作用 是通过AMPK的活化来实现的。

2.3 AMPK的抗炎作用AMPK的活化抑制了缺血后白细胞和内皮细胞之间的黏附,从而发挥抗炎作用。 Gaskin等[15]利用活体显微镜观察鼠的空肠毛细血管后微静脉,发现在缺血再灌注损伤前,应用AMPK激活剂可以在实验鼠的后微静脉中产生抗炎作用,而减少血管黏附分子的表达,减少白细胞的“滚动”及黏附, 增加血管在缺血再灌注时的通透性。对AMPK的研究正处于“黄金年代”,众多研究发现AMPK在心肌缺血、心肌肥厚、心血管重构、心律失常、衰老的过程中发挥着重要作用,不少制药公司已为此立项,致力于研发理想的AMPK激活剂来治疗上述疾病。

3AMPK与人之正气

中医学“气”的功能与AMPK的功能有许多相似之处。从二者的作用看,气是人体内活力很强运行不息的极精微物质,是构成人体和维持人体生命活动的基本物质之一。气运行不息,推动和调控着人体内的新陈代谢,维系着人体的生命进程。气的运动停止,则意味着生命的终止。气的功能包括:推动与调控作用、 温煦与凉润作用、防御作用、固摄作用、中介作用。气的防御作用可以护卫肌表,防御外邪,也可以保卫机体,驱邪外出。人体之“正气”是人体机能活动的总称; 是人正常的功能活动和抗病防御能力以及病后的康复能力。通常与病邪相对而言,指人体的抗病能力。《素问·剌法论》:“正气存内,邪不可干”。

AMPK是一种重要的蛋白激酶,可以调节能量代谢。在疾病的发生、发展、治疗的过程中起着重要的调节作用。AMPK的激活能够阻止疾病的发生,促进疾病的痊愈,这与中医学“气”的调控、防御作用相类似。

从变化的规律看,气的盛衰与AMPK也有类似规律,高龄、肥胖、疲劳等因素均可导致气虚,同时上述因素也会导致AMPK表达的下调。流行病学调查发现随着年龄的增加,气虚的出现呈递增趋势,《素问·上古天真论》记载:“女子……五七阳明脉衰,面始焦,发始堕;六七三阳脉衰于上,面皆焦,发始白;七七任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也。 丈夫……五八肾气衰,发堕齿槁;六八阳气衰竭于上, 面焦,发鬓斑白;七八肝气衰,筋不能动;八八天癸竭, 精少,肾藏衰,形体皆极,则齿发去”。AMPK表达也随年龄的增长呈递减趋势。

疲劳可以导致气虚的发生,同时也导致AMPK表达的下调;流行病学调查发现体力劳动者较脑力劳动者更易出现气虚,疲劳应激动物模型中也看到AMPK表达的下调,这也是二者相似之处[16]。

高脂、肥胖也是导致气虚和AMPK表达下调的因素[17,18]。肥人多气虚,元·朱丹溪在《丹溪治法心要》 中说:“肥白之人,沉困怠惰是气虚”。明·虞抟《医学正传 · 疮疡》也明确指出 :“肥人大概是气虚挟痰”。 清·沈金鳌《杂病源流犀烛》称:肥盛之人“实为肥盛气衰”。现代研究证实肥胖及高血脂的患者中AMPK表达明显降低。

中医学的“气”与AMPK从功能及变化规律有众 多相似之处,采用补气的方法有可能调控AMPK的激活,减少疾病的发生及改善疾病的预后,同时也对于完善中医理论,研究“气”的物质基础有重要意义。

综上所述,中医学认为气虚是冠心病发病主要病因病机之一,补气法是治疗冠心病的重要方法之一,补气中药能够改善冠心病临床症状,降低心肌缺血再灌注损伤。AMPK信号通路能够调节心肌能量代谢,维持心肌细胞ATP水平,减少黏附分子的表达,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。AMPK的表达在气虚模型中明显降低,因此深入研究补气中药对于AMPK信号通路的干预机制,对于新药开发以及补气中药抗心肌缺血的机制有重要的科研和临床意义,也是中药研究的一个重要方向,并为中医“气虚”相关理论提供依据。

摘要：中医学认为冠心病病理特点是本虚标实,虚实互见,虚以心气虚为主。补气法是中医治疗冠心病的重要治法之一。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路在心肌缺血的过程中能够调节心肌能量代谢,减轻心肌损伤,AMPK的表达在气虚模型中明显降低。本研究探讨AMPK信号通路与中医冠心病气虚理论的关系,为临床及科研提供思路。

信号蛋白论文 第5篇

1 材料与方法

1.1 主要材料

SPF级SD大鼠,体重(200±50)g,由上海中医药大学实验动物中心提供;实验试剂和仪器包括:Aβ1-40购自美国Sigma公司;兔抗大鼠p-mTOR、p-p70S60K、p-4E-BP1和GAPDH抗体均购自美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Cell Signaling Technology公司;立体定位仪(江湾I型)为第二军医大学生理教研室研制;Morris水迷宫为中国医药科学研究院研制。

1.2 AD动物模型建立

10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,参照大鼠脑立体定位图谱,自脑颅骨表面进针3.0mm至海马,用微量进样器抽取2μL(10μg)Aβ1-40[5],注射完毕后停针5min,术后肌肉注射青霉素,连续3d,以防感染。假手术组注射等量生理盐水。

1.3 分组及治疗

7d伤口完全愈合后,饮食正常,无肢体残疾,即开始治疗。实验分4组:正常组、假手术组、模型组和电针组。在电针组,取百会和肾俞,用普通28号0.5寸不锈钢毫针,百会穴平刺约2.5mm;双侧肾俞穴直刺约4mm;连接G6805A型电针治疗仪,选择连续波,频率为20 Hz,强度以肢体抖动,且大鼠能安静耐受为度。针刺治疗每天1次,每次30min,7d为一疗程,疗程间休息1d,治疗4个疗程。正常组、假手术组及模型组正常饲养,不予电针治疗。

1.4 Morris水迷宫检测大鼠学习记忆力

采用Morris水迷宫检测大鼠逃避潜伏期和通过原平台次数以检测大鼠空间学习和记忆能力的变化[6]。历时5d,记录逃避潜伏期。实验第6天撤除平台,将大鼠面向池壁从任一入水点放入水池,测试70s内跨越原平台位置的次数和原象限停留时间。

1.5 Western

blot检测p-mTOR、p-p70S60K和p-4E-BP1的表达Morris水迷宫检测结束后,立即颈椎脱臼处死大鼠,快速取出海马组织,加入含磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA buffer裂解液,提取总蛋白,通过BCA法对蛋白进行定量。按常规方法灌制聚丙烯酰胺凝胶,ECL发光法检测蛋白表达,用凝胶图像处理系统分析,计算蛋白质的相对表达量,方法为待测蛋白质的净像素值/GADPH的净像素。

1.6 统计学处理

采用SPSS 15统计软件处理,结果用均数±标准差(±s)表示,各组间的差别采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 电针对AD大鼠学习记忆力的改善

与正常组相比,自第2天开始,AD模型组的平均逃避潜伏期时间显著延长(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,电针治疗可明显缩短大鼠逃避潜伏期的时间(P<0.01)。详见表1。撤除平台后,与正常组相比,AD模型组大鼠跨越原平台的次数和平台象限停留时间减少(P<0.01);与模型组相比,电针治疗可以显著增加大鼠跨越原平台的次数和平台象限停留时间(P<0.01)。详见表2。

s

2.2 电针对海马CA1区组织形态的影响

正常组大鼠海马神经元呈圆形或椭圆形,排列整齐、紧密。假手术组CA1区组织形态与正常组没有明显差异。而模型组大鼠海马神经元层次明显减少,细胞排列稀疏,细胞缺失明显,细胞核染色较深,核固缩、异形。电针组海马神经元排列较整齐,细胞呈圆形或椭圆形,核仁清晰,有少量细胞脱失。

2.3 电针对大鼠海马mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示:与正常组相比,模型组大鼠海马组织中p-mTOR和p-p70S60K蛋白表达明显增高(P<0.01);与模型组相比,电针治疗可显著下调p-mTOR和p-p70S60K蛋白的表达(P<0.05)。而4组中p-4E-BP1的表达无统计学意义。详见表3。

3 讨论

AD在祖国医学中散见于“郁证”、“癫狂”、“呆病”、“健忘”等证的描述中,其发生和脑、脾、肾关系密切。中医学认为本病的发生与肾精亏虚、髓海失充有关,故“肾虚血瘀、神明失养”是其基本病机。经络是构成脑髓气血津液运行的通道,输送精髓充实于脑,并为传达脑神到人之五脏百骸之通路。针灸通过刺激人体特定的腧穴,激发经络之气,调整脏腑、经络及大脑的机能,促进衰退神经元的能量代谢,以达到防治AD的目的。本实验中,百会位于巅顶,通过督脉入络脑,乃局部取穴,以醒脑宁神,肾俞补肾养髓,髓海得充,可健脑益智,两穴合用,既可补肾益髓,又可开窍醒神,起到贯通气血、疏通督脉和补肾益髓的作用。本实验发现,AD大鼠给电针治疗后,逃避潜伏期时间明显缩短,同时穿越原平台次数和原象限平台停留时间明显增加,表明电针可改善AD大鼠的学习和记忆功能。胆碱能神经元的丢失是引起进行性记忆和认知功能减退的根本原因,海马CA1区在学习和记忆中担负重要作用。本研究发现,模型组大鼠海马CA1区神经元层次明显减少,细胞排列稀疏,细胞缺失明显,细胞核染色较深,核固缩、异形。经电针治疗后,海马神经元排列较整齐,细胞呈圆形或椭圆形,核仁清晰,只有少量细胞脱失。结果提示电针对海马神经元具有明显的保护作用。

mTOR是雷帕霉素在哺乳动物细胞内的靶分子,是一种进化上十分保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR对细胞周期进程和细胞生长具有重要的调节作用,它通过调控代谢和有丝分裂从而影响细胞增殖。真核细胞翻译启始因子4E结合蛋白(4E-BP)和p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)是mTOR下游的直接底物,对蛋白质翻译起重要调节作用。mTOR对于轴突的导向、树突的发育和树突棘的形态发生发挥着重要的作用[7,8],可调节突触可塑性,影响学习和记忆[9]。近来研究发现,AD患者体内mTOR通路存在明显异常[10,11],提示mTOR信号的调控可能与AD的发生发展密切相关。

在APP-PS1(淀粉样前体蛋白-早老素)双转基因小鼠大脑皮层细胞和AD患者的淋巴细胞中,存在mTOR/p70S6K通路的下调,且p70S6K的磷酸化水平与细微精神状态检查(MMSE)的得分相关[12]。AD的发生伴随着mTOR/p70S6K通路活性的增强,使得AD整个病理过程中伴随着某些蛋白表达水平的增加,如具有神经毒性的Tau蛋白[10,11]。本研究Aβ脑内注射建立AD模型,结果也发现,mTOR/p70S6K的磷酸化水平明显升高,这可能与AD的发病机制有一定关系。而经电针治疗后,与模型组相比,mTOR/p70S6K的磷酸化水平显著降低,而4E-BP1的磷酸化水平与其他组之间无明显差异,电针可能通过调控mTOR信号通路及下游蛋白p70S6K的表达,发挥保护神经元和促进大鼠学习记忆力恢复的作用。进一步明确mTOR信号通路在电针治疗AD中的作用,可为阐明电针治疗AD的作用机制和寻找特异性治疗靶点提供理论基础和实验依据。

摘要：目的 探讨电针对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马组织mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。方法 将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组,采用Morris水迷宫检测空间学习和记忆能力的变化。HE染色观察各组海马CA1区组织形态变化;Western blot检测p-mTOR、p-p70S60K和p-4E-BP1的水平。结果 电针治疗可明显改善AD大鼠学习和记忆力,减轻海马CA1区组织形态的变化,并可降低海马组织p-mTOR和p-p70S60K的表达,而对p-4E-BP1的表达无明显影响。结论 电针治疗可能通过调控mTOR信号通路及下游蛋白p70S6K的表达,对抗Aβ诱导的神经元损伤,提高AD大鼠学习记忆功能。

信号蛋白论文 第6篇

1 APC蛋白的结构特征

APC基因位于5号染色体长臂的2区1带 (5q21) , 其编码的APC蛋白分子量约为3×106, 含2844个氨基酸[1]。 (1) N-端区由7个重复疏水残基区 (armadillo重复序列) 组成, 具有α-超螺旋结构。N-端区含有APC蛋白核质穿梭运动需要的核转出信号 (NES) , 并且N-端区可与出核因子 (chromosome maintenance region-1, CRM-1) 直接作用[2]。与APC蛋白N-端区结合的蛋白包括:磷酸酶2a (PP2A) 的调节亚单位、Rho家族受APC激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子 (Asef) 还有角蛋白关联蛋白 (KAP3) [3,4]。 (2) 不同种类来源的APC蛋白序列其N-端区与中间区是高度保守的区域。中心区含有两类可与β-catenin结合的结构域:一类是20个氨基酸 (20aa) 重复序列 (在1262~2033aa之间重复7次) ;另一类是15个氨基酸 (15aa) 重复序列 (在1020~2033aa之间重复3次) 。这两类重复序列也是Wnt信号通路和细胞黏附位点的重要组成部分[5]。 (3) C-端区包含调节APC与许多结构蛋白相互作用的基序:末端的170个残基能与微管顶端结合蛋白EB1 (end binding protein-1) 结合[4]。

2 APC蛋白在Wnt信号通路中的功能

APC蛋白在Wnt信号通路调节过程中扮演重要的角色, 大量的生物化学和遗传数据表明, APC蛋白下调β-catenin/Armadillo的转录活性。这种调节被认为发生在3个水平。

2.1 APC蛋白促进β-catenin/Armadillo的磷酸化

APC蛋白通过糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β) 促进β-catenin N-端区磷酸化后经过泛素 (ubiquition) 介导的蛋白酶体降解。APC蛋白的活性关键依赖其与轴蛋白 (Axin) 的结合能力。因此细胞表达的APC蛋白突变体不能与轴蛋白结合。就像在大部分结直肠癌中发现截短APC一样, 同时存在β-catenin/Armadillo胞浆内积累, 这可能与β-catenin未磷酸化有关。显然, 缺乏β-catenin磷酸化将危及Wnt信号的转导[6,7]。还不清楚APC蛋白是如何促进β-catenin/Armadillo磷酸化的, 但是像是APC蛋白此过程中起到靶向作用从而促进β-catenin/Armadillo和轴蛋白结合。由于果蝇E-APC蛋白突变体 (N175K) 的发现, 为人们所不知的这种精密机制最近引起了人们的关注, 尽管N175K可以和野生型APC一样在活体外有效的稳定的同Armadillo和轴蛋白结合, 但N175K在活体内不能与轴蛋白结合[8]。研究指出, N175K蛋白被从质膜移位[9], 提示了APC的膜连接在某种方式上对Armadillo靶向结合轴蛋白可能很关键。然而, 轴蛋白除了在Wnt信号通路中与Wnt信号辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白 (LRP) 结合, 其本身并不与质膜连接[8,10,11,12]。

2.2 APC蛋白促进β-catenin/Armadillo的核转出

APC蛋白包含保守的核转出信号 (NES) , 并且最近的光漂白试验为NES依赖性的APC核质穿梭运动提供了直接的证据[13]。细胞表达APC突变体 (包括肿瘤中发现截短的APC) 缺乏核转出信号, 呈现β-catenin/Armadillo核内积累[14,15,16,17]。这可能直接归因于APC蛋白的核质穿梭运动[18]。换句话说, β-catenin/Armadillo的核质分布可能间接与APC蛋白的穿梭运动有关, 并且能够反映APC介导的β-catenin/Armadillo贮留 (在细胞核内通过APC突变体介导, 或在胞质内通过野生型APC介导) [19]。

2.3 β-catenin/Armadillo磷酸化与转录活性

细胞核内APC出现后隔离了细胞核内β-catenin, 因此高浓度的未磷酸化β-catenin不会提高T细胞转录因子 (TCF) 介导的转录水平[13,1]:在结直肠癌细胞内, 此转录水平与截短APC的长度或是保留在截头内β-catenin结合位点的数量呈负相关。此外, 如果APC的β-catenin结合片段被试验性的定位于细胞核, 这种添补进细胞核内的高浓度β-catenin并不刺激TCF介导的转录[13]。这种明显的APC隔离细胞核β-catenin现象, 像是涉及C-端结合蛋白 (Ct BP) , Ct BP通过与APC结合对抗TCF介导的转录。

3 APC蛋白与结直肠癌细胞黏附

早有学者在结直肠癌细胞研究中指出APC肿瘤抑制因子与细胞黏附有关[20], 当截短APC突变体在SW480细胞内表达, 结果发现细胞核和细胞质内未磷酸化β-catenin积累和TCF介导转录水平提高。对这些缺陷进行补足后, 表达低水平全长APC (SW480APC) 的结肠癌细胞株被衍生出来。正像期望的那样, 这些SW480APC细胞呈现TCF介导转录水平降低, 软琼脂集落形成和裸小鼠体内肿瘤生长受到抑制。也许最引人注目的细胞表型就是它们的细胞质和细胞核内的β-catenin对于质膜做出明显的重新分布。同时伴随相似的跨膜蛋白E-钙黏蛋白 (E-cadherin) 的重新分布, 它被发现在SW480亲代细胞细胞质刻点内, 重新分布的E-钙黏蛋白在SW480APC细胞的质膜形成钙依赖性黏附位点。SW480APC细胞因此获得黏附特性并且改变形状, 在划痕法细胞运动测定中变得很少移动。因此, 在这些结肠癌细胞中APC能够恢复细胞黏附。

可能果蝇APC突变体和人类细胞的细胞黏附缺陷只是TCF靶基因转录变化的一个间接结果。例如, 在结肠癌细胞株SW480APC细胞可观察到E-钙黏蛋白水平的升高[20], 这可能由于E-钙黏蛋白的TCF介导阻遏的释放, 使在SW480APC细胞内E-钙黏蛋白转录能够响应Wnt信号通路而被阻遏[21]。

还不清楚APC蛋白是如何完成E-钙黏蛋白和β-catenin对于质膜的重新定位。一个可能就是此过程包含一种调节蛋白例如鸟嘌呤核苷酸交换因子Asef[22]。Asef与APC的Armadillo重复区域 (ARD) 结合, 虽然在表达野生型APC细胞其不被活化, 但在结直肠癌细胞Asef通过截短APC蛋白被活化[23]。在马-达二氏犬肾 (MDCK) 上皮细胞 (表达野生型APC) , 过表达或活化的Asef诱导E-钙黏蛋白从质膜到胞质刻点的重新分布, 因此刺激它们的移行活动[23]。可以想象由于APC活化的Asef的存在, APC突变体SW480细胞内的E-钙黏蛋白位于则细胞质刻点内, 这些细胞内再次补充的野生型APC可能逆转此活性从而允许E-钙黏蛋白对于质膜的重新定位。假如这样的话, 对SW480细胞内的Asef功能进行干扰, 将同样导致类似的重新定位, 但这还没有被直接证实。

APC的后转录影响细胞黏附的一个更直接证据也来自果蝇[9]:在轴蛋白突变体内或是在高度活跃的Armadillo过表达后, 没有观察到像在N175K突变体卵泡内发生卵母细胞错位这样的黏附缺陷。这提示这些缺陷应尤其归咎于E-APC蛋白突变体, 而不是由于应答Wingless信号系统转录变化的后果。无论怎样, N175K突变体较温和的结合缺陷都不支持E-APC蛋白在细胞黏附中起本质的结构性的作用。的确, 这些缺陷 (包括结合的Armadillo的离域作用) 的出现提示E-APC蛋白在维持黏附位点方面起作用。

初期的β-catenin对质膜的靶向作用是通过β-catenin与新合成的E-钙黏蛋白在细胞质内结合来完成, 因此APC蛋白不太可能在此过程中起直接作用。然而, 最近的研究证据表明β-catenin可在质膜的钙黏蛋白/连环蛋白复合体内发生有效的交换[24]。研究人员引导脉冲标记试验发现新合成的β-catenin (到达质膜与新合成的E-钙黏蛋白结合) 迅速与先前存在的表面标记的E-钙黏蛋白结合。因此, 在质膜存在一个快速有效的E-钙黏蛋白与β-catenin的交换过程, 这表明β-catenin不断地进出黏附位点。β-catenin交换池的容量是相当大的 (估计有新合成蛋白的25%) 。而对于另外两种不同的APC突变体结直肠癌细胞株 (具备正常的E-钙黏蛋白水平) , 即使α-catenin交换不受影响, 这种β-catenin交换则出现明显减少。这表明不论对APC还是质膜上钙黏蛋白/连环蛋白复合体内的β-catenin的交换均有特殊的要求[24]。

4 结语

细胞黏附特性的缺失是浸润性癌的一个特性。因为在组织发育过程中细胞信号系统和细胞黏附的进程必须相互协调且具备整体性, 这提示它们可能是共同进展并且紧密联系的。β-catenin/Armadillo作为信号通路和细胞黏附两个过程关键的直接参与者, 它是双功能蛋白的一个主要例子。APC蛋白可能是另外一个双功能蛋白的例子, 在Wnt信号通路和结直肠癌细胞黏附过程中发挥不同的作用。然而APC蛋白直接参与这两个过程的证据还没有最终显现, APC蛋白对结直肠癌细胞黏附的作用可能只是其在Wnt信号通路中功能的一个间接结果, 仍需更加深入的研究, 这可望为“为什么APC缺失在肿瘤形成过程中是如此之关键?”提供新的认识。

摘要：APC基因编码的APC蛋白是一个多功能抑制肿瘤的蛋白家族, 其主要功能是通过下调胞浆内游离的β-连环蛋白 (β-catenin) 水平发挥肿瘤抑制功能, 是Wnt信号通路关键的效应因子。已有研究证实, APC基因在细胞黏附、细胞迁移和染色体分离等基本细胞功能中发挥作用。近期的研究表明, APC蛋白在肠上皮细胞黏附过程中发挥重要的作用。现综述APC蛋白在结直肠癌细胞黏附过程中的作用机制。

信号蛋白论文 第7篇

1 材料和方法

1.1 标本来源

检测2005至2007年在鼓楼医院血液科就诊的初诊AML患者48例, 男30例, 女18例, 年龄13～76岁, 其中4例M1, 12例M2, 11例M3, 9例M4, 7例M5, 3例M6, 2例M7。正常对照组18例, 均为同期就诊的特发性血小板减少性紫癜患者及正常供髓者。另外培养HL- 60细胞作为阳性对照, K562细胞作为平行对照。

1.2 实验试剂

Nras 12引物是atg act gag tac aaa ctg gt和tct atg gtg gga tca tat t, Nras 61引物是caa gtg gtt ata gat ggt ga和agg aag cct tcg cct gtc ct[3], 均由上海生工生物工程公司合成。用购自Promega公司的Genomic DNA purification kit 提取样品DNA。使用TaKaRa的PCR试剂盒行PCR。AKT兔抗多克隆抗体和P-AKT兔抗单克隆抗体、内参GAPDH为上海康成生物工程公司产品;ERK1/2、P-ERK1/2兔抗多克隆抗体以及二抗 (抗兔, 带辣根过氧化物酶标记) 购自CELL SIGNALING公司。ECL显色液购自SANTA CRUZ生物技术公司。HL- 60细胞株为上海细胞生物研究所赠与。胎牛血清购自Promega公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集

用预先肝素化的无菌注射器取AML患者及对照组骨髓液3～5 ml, 使用淋巴细胞分离液 (Ficoll液) 分离骨髓单个核细胞 (MNC) , 保存于-70 ℃或者直接提取DNA和蛋白。HL- 60及K- 562细胞株待培养到稳定对数生长期, 分别取1107数量级的细胞提取DNA和蛋白。

1.3.2 PCR-SSCP法

PCR反应总体积为50 μl体系, 含有TaKaRa Taq酶0.25 μl, 10PCR Buffer 5 μl, Mgcl2 (25 mmolL-1) 3 μl, DNTP Mixture (各2.5 mmolL-1) 4 μl, 模板DNA4 μl, 引物 (20 U) 各1 μl, 加灭菌蒸馏水至50 μl。反应条件为: (1) 94 ℃预变性10 min, (2) 依次94 ℃变性60 s, 52 ℃退火40 s, 72 ℃延伸60 s, 共35个循环。 (3) 72 ℃延伸10 min。产物置于4 ℃保存。PCR产物10 μl加入变性缓冲液 (95%甲酰胺, 10 molL-1 medta, 0.02%溴酚蓝) 10 μl, 加热煮沸6 min, 立即置于冰浴中冷却至少5 min。然后上样12%PAGE胶 (含10%甘油, 0.5TBE) , 4 ℃层析柜中300 V电泳5 min, 120 V电泳8～10 h, 溴化乙锭染色, 照像分析。

1.3.3 DNA测序

经PCR-SSCP法检测有异常的条带样品, 其PCR产物送到Invitrogen公司测序验证是否存在突变, 同时明确突变位点。

1.3.4 Western blot法

用适量含磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解已分离的骨髓单个核细胞和HL- 60及K- 562细胞, 提取蛋白, 用Brad-ford法测定每个样品的总蛋白含量, 加入4样品缓冲液, 煮沸6 min, 每孔加入相同量的样品总蛋白, 10%SDS-PAGE分离后, 电转于PVDF膜, 分别用兔抗AKT和ERK1/2多克隆抗体、兔抗P-AKT单克隆抗体、兔抗P-ERK1/2、兔抗多克隆抗体以及内参兔抗GAPDH, 兔抗二抗进行Western印迹分析, ECL系统显色。

2 结果

2.1 PCR扩增Nras基因

AML组及正常对照组骨髓DNA经Nras基因第1外显子上、下游引物引导扩增后, 琼脂糖凝胶观察出现大小为110 bp的片段, 见图1。

1～3为AML组, 4～5为正常对照组, 6为HL- 60细胞株

2.2 Nras 12, 13, 61位点突变分析

检测AML组Nras 12, 13, 61位基因突变采用PCR-SSCP (聚合酶链反应-单链构象多态性) 法。48例AML患者中共检测到Nras 61位点突变2例, Nras 12/13位点突变2例。总突变率是8.33%, Nras 61和Nras 12/13突变率均为4.17%。另外在18例对照组中, 未检测到有Nras基因突变。HL- 60细胞株有Nras 61位点突变。见图2。图2显示, 4、9泳道比其他泳道泳动速度快, 6～8是正常阴性对照组, 9是HL- 60细胞株为阳性对照组, 可见4号泳道可能存在Nras基因突变。

将检测到有Nras基因突变样本的PCR扩增产物经纯化后送上海生工生物工程公司测序, 因PCR扩增片段较短, 仅110 kb, 测序未成功。

1～5为AML组, 6～8为正常对照组, 9为HL- 60细胞

2.3 AKT、ERK1/2和P-AKT和P-ERK1/2表达

将总样本48例 (AML组) 和18例 (正常对照组) 分成A、B、C 3组, 其中A组为AML伴Nras基因突变组 (4例) , B组为AML不伴Nras基因突变组 (44例) , C组为正常对照组 (18例) , 分别用Western Blot法检测信号传导通路Raf/Mek/Erk、PI3K/Akt上ERK1/2、AKT蛋白以及其活化形式P-AKT、P-ERK1/2和内参GAPDH的表达, 结果见图3、4。然后应用Gel-pro Analyzer 4.0软件分别测得AKT、ERK1/2、P-AKT和P-ERK1/2的光密度, 再除以内参GAPDH的光密度后得到各样本值, 应用SPSS 11.5统计软件进行单因数方差分析。结果见表1。

与C组比较, *P<0.05;与组内AKT/GAPDH比较, #P<0.05;与组内P-ERK/GAPDH比较, △P<0.05

表1结果显示, A、B两组间AKT/GAPDH、P-AKT/GAPDH、ERK/GAPDH、P-ERK/GAPDH比较, A组比B组稍高, 但两组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。A、B两组与C组比较, 差异有统计学意义 (均P<0.05) 。另外A、B两组内比较, P-AKT/GAPDH、P-ERK/GAPDH表达水平分别比AKT/GAPDH、ERK/GAPDH要低, 差异有统计学意义 (均P<0.05)

3 讨论

目前认为AML多由几个基因联合致病, 著名的“二次打击”认为, Ⅰ类突变导致增殖/存活优势 (包括BCR-ABL, TEL-PDGFRB, FLT3和Ras等基因突变) , Ⅱ类突变导致分化受阻 (包括PML-RARA、RUNX1-ETO等基因突变) [4], 可见Ras基因突变是导致AML发生的重要原因之一。Tayler等[5]研究表明, AML发病与Ras基因突变之间存在密切关系, 约15%～30%的AML患者有Nras和Kras基因突变, 而在正常人群中Ras的自然突变几乎检测不到。Bowen等[6]在年龄小于60岁AML患者的大样本研究中发现, 大约11% (126/1 106) 的患者存在Nras突变。

本研究中AML患者Nras基因总突变率比国内外报告稍低, 考虑可能与PCR-SSCP检测的敏感性有关, 以后可考虑采用多种方法检测以提高检测率。另外国外[7]报道Nras基因突变中主要以Nras 12/13基因位点突变为主, 而本研究中Nras 61与Nras 12/13位点突变各检测到2例, Nras 12/13位点突变占总突变的比例稍低, 考虑可能与检测样本量较少有关。

另外在18例对照组中, 未检测到Nras基因突变, 表明AML发病与Nras基因突变间存在密切关系, 因此认为Nras基因突变是导致某些AML发生的重要原因之一。

AKT和ERK1/2分别是细胞增殖途径Raf/Mek/Erk和抗凋亡途径PI3K/Akt上两个重要信号传导通路蛋白, 它们在体内一系列重要生物学效应中起重要作用, 一旦因为某种原因其蛋白被磷酸化, 则会处于持续激活状态, 导致多种恶性疾病的发生[8]。

本实验中, 在AML伴或不伴Nras基因突变组, AKT、ERK1/2、P-AKT和P-ERK1/2蛋白表达量较正常对照组均有明显增高, 其中AML伴Nras基因突变组增高更明显。据此推测Nras基因突变后导致RAS蛋白构型改变, RAS蛋白持续活化, 导致增殖途径Raf/Mek/Erk和抗凋亡途径PI3K/Akt持续激活, 从而引起AML发生。而在AML不伴Nras基因突变组AKT、ERK1/2、P-AKT和P-ERK1/2蛋白表达量也较正常对照组有明显增高, 考虑是因为AML的发生是由几个基因联合致病的, 而多种原因 (如C-kit基因突变, PI3K p110d的上调, PTEN的磷酸化或下调等) 都可以引起Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt途径的持续激活, 导致AKT、ERK1/2、P-AKT和P-ERK1/2蛋白的高表达。

随着BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂格列卫成功应用于CML患者, 分子靶向治疗越来越成为研究热点。因为在AML患者, 不管伴或不伴Nras基因突变, 都有AKT、ERK1/2、P-AKT和P-ERK1/2蛋白的高表达, 因此有理由相信阻断这两条通路是治疗AML很好的靶点, 目前已经有一些针对这两条通路的靶向抑制剂正处于临床试验中, 如PD098059、PD184352、U0126、磷脂酰肌醇类似物、perifosine和deguelin等, 并且取得了一定的疗效[9,10,11,12]。

另外, 由于Ras信号通路调控的复杂性, 阻断一条通路, 机体往往可以通过另一条通路代偿, 因此有些靶向药物单独使用有时疗效较差, 多个靶向药物的联合应用, 阻断多条发病信号通路成为一种必然选择。进一步了解信号传导通路, 寻找更多的靶向位点将对AML治疗具有重要意义。

摘要：目的研究Nras基因在急性髓系白血病 (AML) 中的突变以及在AML和正常对照组中RAS蛋白下游信号传导通路上AKT、ERK1/2以及其活化形式P-AKT和P-ERK1/2的表达情况。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性法 (PCR-SSCP) 及直接测序法检测AML中Nras基因突变率, 应用Western blot法检测AKT、ERK以及其活化形式P-AKT, P-ERK1/2的表达量。结果48例AML中检测到2例Nras 12突变, 2例Nras 61突变, 突变组P-AKT、P-ERK1/2的表达水平较正常对照组明显升高 (P<0.05) 。未有Nras基因突变的AML其P-AKT、P-ERK1/2的表达水平也增高, 但表达不均一。结论Nras基因突变可能是AML发生发展的原因之一, 其机制可能是由于突变导致编码的Ras蛋白构型改变, 使其处于功能持续活化状态, 从而激活了Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt等下游信号传导通路, 最终导致AML的发生。

关键词：Nras基因,急性髓系白血病,突变,P-AKT,P-ERK

参考文献

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信号蛋白论文 第8篇

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

dbcAMP(Sigma);Actin抗体(碧云天生物技术研究所);Phospho-CDC25B-S323抗体(Abcam);辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);BCA蛋白试剂(碧云天生物技术研究所);预染蛋白marker(BIOLABS);PKA活性ELISA试剂盒、人促有丝分裂因子(MPF)活性ELISA检测试剂盒(R&D公司);L15培养液(Gibico公司);甲状腺鳞癌细胞株SW579购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。

1.2 仪器与设备

Sunrise自动酶标检测仪(TECAN公司);BB16UV二氧化碳培养箱(HERAEUS);Mikro22R高速冷冻离心机(Hettich公司);Miniprotean tetracall电泳仪(美国伯乐公司);Trans-blot sdsemi-dry transfercell转膜仪(美国伯乐公司);凝胶成像及分析系统为英国UVP的GD58000;应用分析软件为Gel works。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

将SW579细胞接种于含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100μg/m L链霉素的L15培养基中,在37℃、5%二氧化碳条件下进行培养。

1.3.2 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生存活力

在dbcAMP作用下SW579细胞活力的变化:取对数生长期细胞,制成细胞悬液,浓度为3104/m L,以每孔100μL接种细胞于96孔板,培养12 h后,按浓度梯度0.5、1.0和2.0 mmol/L加人dbcAMP,对照组加入等体积含对应浓度DMSO的培养基,用MTT法在24、48和72 h测定吸光度,波长490 nm,每6孔1组,取平均值,以时间为横轴,以细胞生存率为纵轴绘制生长曲线。实验重复3次,取均数进行统计分析。细胞生存率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)100%。

1.3.3 ELISA法检测PKA、MPF活性

对数增殖期的SW579细胞以5105/m L的浓度,分dbcAMP组(1.0 mmol/L)和不加dbcAMP组培养48 h,收集细胞,按试剂盒说明书分别检测PKA、MPF的活性。上述实验重复3次,取均数进行统计分析。

1.3.4 Western blotting的应用

取对数增殖期的SW579细胞分dbcAMP组(1.0 mmol/L)和不加dbc AMP组培养48 h,收集细胞,裂解细胞,提取细胞的总蛋白质,并用BCA法测定蛋白浓度,加入SDS样品缓冲液,100℃煮沸5 min,取30μg蛋白于10%SDS-PAGE电泳分离(90 V,100 min),然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上,用含10%奶粉的TBST(pH7.4)室温封闭1 h,用TBST清洗3次,然后依次结合兔抗人Phospho-CDC25B-S323抗体(1︰500)、β-actin抗体(1︰1 000),4℃过夜。薄膜用TBST充分清洗后,HRP偶联山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG为二抗(1︰5 000),室温温育2 h,冲洗干净后显色,经UVP凝胶成像分析系统进行扫描成像。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据统计与分析,各组数据以均数±标准差表示,组均数间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 dbcAMP对SW579细胞活力的影响

在dbcAMP作用下,SW579细胞活力呈逐渐下降的趋势。随dbcAMP剂量的增加和作用时间的延长,其作用越明显。尤其在dbcAMP1.0 mmol/L作用下细胞活力下降最为明显。dbcAMP对SW579细胞的生长抑制作用呈时效和量效关系(见图1)。

2.2 PKA、MPF活性的变化

如表1所示,在1.0 mmol/L dbcAMP组作用下48 h,SW579细胞PKA活性明显升高,MPF活性显著下降,与未加dbcAMP组相比差异有统计学意义(P<0.01)。

注:覮与未加dbcAMP组相比,P<0.01

2.3 CDC25B-pS323磷酸化水平

Western blotting结果显示,在未加dbcAMP组甲状腺鳞癌细胞内,CDC25B-pS323的磷酸化水平较低,而dbcAMP组CDC25B-pS323的磷酸化水平显著上调,两组间差异有统计学意义(P<0.01)(见表2和图2)。

注:覮与未加dbcAMP组相比,P<0.01

3 讨论

dbcAMP是环磷腺苷衍生物,是PKA的激活剂,它能通过细胞膜,在细胞内转变成c AMP发挥作用。c AMP/PKA通路参与细胞增殖、分化和凋亡的调节,在细胞周期的调控中处于关键环节,与细胞生长、分化、基因表达、肿瘤生长及转移等生理病理过程有密切关系[3]。许多研究发现细胞内高水平的c AMP和PKA常导致细胞增殖的抑制,CHEN等[4]的报道研究c AMP/PKA通路上调在恶性神经胶质瘤的细胞株及原代培养的细胞株中的影响,结果发现cAMP/PKA上调可以抑制恶性神经胶质瘤细胞的增殖侵袭,并诱导其分化和导致其凋亡。在周涛等[5]的研究中发现,肿瘤细胞中PKA的活性显著低于正常细胞,经dbcAMP处理细胞后,PKA活性明显增强,细胞增殖受到明显的抑制。新近研究表明,PKA活性升高对肺腺癌A549细胞周期调控的关键点应该是G1/S限制点,阻止其由G1期进入S期,从而抑制A549细胞的分裂和增殖[6]。笔者的实验结果显示,经dbcAMP处理细胞后,PKA活性增高能够降低甲状腺鳞癌细胞的活力,并抑制细胞增殖,呈剂量依赖性,与文献报道结果一致。

爪蟾的研究表明,PKA可直接磷酸化CDC25B的287位丝氨酸,该位点磷酸化后导致14-3-3蛋白结合,CDC25B活性受抑制,发生G2期阻滞[7]。在人类细胞系中CDC25B的323位丝氨酸,被磷酸化后也导致14-3-3蛋白的结合,细胞发生G2期阻滞[8]。笔者的实验结果显示,经dbcAMP作用后,CDC25B-S323磷酸化水平上调,提示,在SW579细中PKA的活性升高,通过上调CDC25B-S323磷酸化水平,抑制了CDC25B的活性。近年来发现CDC25B基因是一种潜在的癌基因[9],其过表达或激酶活性异常可提高细胞增殖存活能力,促进细胞恶性转化,导致肿瘤发生[10]。本研究为研制抗肿瘤新药提供了参考依据。

MPF是调节细胞成熟关键的信号分子,是由调节亚基细胞周期蛋白cyclin B和催化亚基细胞周期蛋白依赖性激酶-1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1又称为cdc2)组成的复合体,其中cdc2负责MPF的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。CDC25B是一种重要的MPF生理激活剂,属于双向特异性蛋白磷酸酶,它直接使cdc2蛋白上Thr-14和Tyr-15位去磷酸化来激活MPF,驱动细胞进入并通过M期,加速细胞分裂,对细胞周期进程起正向调控作用[11]。相反,CDC25B蛋白表达及活性的降低则会下调其对cdc2的正向调控,使MPF活性降低,抑制细胞增殖。笔者的研究结果显示,dbcAMP处理组,MPF活性明显降低,细胞生长明显抑制,提示PKA/CDC25B/MPF信号通路对甲状腺鳞癌SW579细胞增殖发挥重要的调节作用。当然并不排除PKA对MPF的直接作用。关于PKA/CDC25B/MPF信号通路在甲状腺癌细胞中的详细作用机制本实验室仍在进一步研究中。

参考文献

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