VPAC2在CHO细胞的表达及鉴定

VPAC2在CHO细胞的表达及鉴定（精选2篇）

VPAC2在CHO细胞的表达及鉴定 第1篇

荧光蛋白标记的GABAB受体在CHO中的表达及亚细胞定位

目的 确定荧光蛋白标记是否影响GB1、GB1asa和GB2亚基在CHO细胞中的表达、亚细胞定位及功能.方法 构建GB1-DsRed2和GB1asa-DsRed2真核表达载体,利用ELISA和IP3积累法检测融合蛋白在CHO细胞中的表达情况及功能,在激光扫描共聚焦显微镜下观测融合蛋白的亚细胞定位.结果 荧光蛋白标记既不影响GB1、GB1asa和GB2亚基的表达,也不影响GB1和GB2在CHO细胞上的共定位过程,同时对二聚体的功能不存在显著的影响.结论 GB1-DsRed2、GB1asa-DsRed2和GB2-EGFP在CHO细胞中具有正常的生理功能和分布,为进一步研究GABAB受体在细胞膜上的`运动及分布以及各亚基之间的相互作用奠定了基础.

作 者：曹建华 张扬 黄思罗 李莹 易平刘剑峰 CAO Jianhua ZHANG Yang HUANG Siluo LI Ying YI Ping LIU Jianfeng  作者单位：华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室,武汉市,430074 刊 名：医学分子生物学杂志  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 5(3) 分类号：Q42 关键词：G蛋白偶联受体   GABAB受体   亚细胞定位  

VPAC2在CHO细胞的表达及鉴定 第2篇

1 材料和方法

1.1 材料

质粒、细胞和工具酶:大肠杆菌DH5α、pc DNA3.1 (+) , 广州英伟创津生物科技有限公司;CHO-K1、L-02细胞、上海生物工程股份有限公司;内切酶Bam HI、内切酶Nhe I、RNase A、内切酶Bam HI、内切酶Apa1、T4DNALigase, 纽美伦生物技术有限公司;Prime STARHS DNA Polymerase、Prime ScriptOne step RT-PCR Kit Ver.2, 宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 构建pc DNA3.1-TM-Factor Xa-EPO载体

(1) 人早幼粒白血病细胞HL-60可在佛波酯和脂多糖的诱导下表达TNF-α[11,12]。提取总RNA, 使用gene NM_000594.2进行引物设计, 产物长度238 bp。正向引物5'加入Nhe1酶位点 (GCTAGC) , 反向引物5'添加了Factor Xa识别序列和Bam HI酶位点 (GGATCC) 。其肽链N端带TM-TNF-α跨膜区 (起始1~70位AA) , 其后面加入了Factor Xa酶切序列:IleGlu-Gly-Arg↓。反转录扩增TNF-α跨模片段的c DNA。

正向引物P1:

反向引物P2:

(2) 构建pc DNA3.1-TM-Factor Xa载体, 重组质粒的酶切鉴定, 阳性克隆送华大基因有限公司测序。获得序列正确的质粒。

(3) 培养人胎肝细胞, 提取总RNA, 根据NCBI Reference Sequence:NM_000799.2, 设计一对引物P5、P6。克隆EPO成熟肽段c DNA (648 bp, 263~909 bp) 。正向引物加Bam H I酶位点 (GGATCC) , 反向引物加Apa I酶位点 (GGGCCC) , RT-PCR扩增EPO全序列c DNA。

(4) pc DNA3.1-TM-Factor Xa和EPO的c DNA进行双酶切后连接反应, 转化到DH5α, 经Amp抗性筛选后挑取白斑, 继续在3 m L LB/Amp培养基上摇4 h。小量提取质粒DNA, 重组质粒的酶切鉴定后送华大基因公司测序, 获取序列正确的质粒。

正向引物P5:

反向引物P6:

1.2.2 转染CHO-K1细胞

大量抽提、纯化目的质粒, CHO-K1细胞的复苏, 取生长状态良好的以5×105个细胞/孔的密度接种。加入胎牛血清浓度为10%的Ham's F12K培养基 (含2 m M L-谷氨酰胺, 1.5 g/L Na HCO3) 2 m L, 以37℃、CO2浓度为5%的条件孵育24 h, 观察细胞形态, 若见细胞分散均匀、形态好、汇合度30%~50%、分裂旺盛且各孔状态基本一致, 存活率达90%以上, 立即转染细胞。采用Invitrogen公司的脂质体LipofectamineTM2000介导质粒转染细胞。设转pc DNA3.1-TM-Factor Xa-EPO组;转染pc DNA3.1 (+) 空载体组;未转染组。每组设2个复孔。

1.2.3 RT-PCR检测rh EPOmRNA的表达

(1) 转染24 h后提取总RNA;

(2) 反转录PCR扩增目的片段EPO, 设转染pc DNA3.1 (+) 空载体组做对照组;

(3) 实时定量PCR检测mRNA表达。

1.2.4 酶切细胞外膜上的rh EPO

(1) Factor Xa孵育细胞:将已转染24 h的的平板倒除培养液, 用PBS洗3次, 洗去杂蛋白。设转染了目的基因但未用Factor Xa酶消化的消化液和转染了空载体的消化液作对照组。

(2) 收集消化液浓缩蛋白:收集各孔消化液 (5孔转染组, 1孔非转染) , 每孔约2 m L, 12000 rpm离心5 min, 去除细胞等固体颗粒。各加入4 m L 4℃预冷的丙酮 (在10 m L一次性细胞离心管中进行) , 上下翻转8次。静置5 min后, 12000 rpm离心5 min, 倒出液体, 室温下晾干, 约10 min。各加入20μL蒸馏水溶解固体颗粒。

(3) SDS-PAGE分析:各样品 (消化后、未消化、空白对照) 进行SDS-PAGE电泳。

1.2.5 Western Blot和ELISA检测细胞总蛋白中rh EPO表达

(1) 将转染后24 h的CHO-K1细胞和未转染培养24 h的CHO-K1细胞, 提取总蛋白, Bradford法蛋白定量后SDS-PAGE电泳 (一抗鼠抗人EPO, 二抗羊抗小鼠Ig G-HRP) 。

(2) 用Human EPO ELISA Kit (广州锐博生物公司) ELISA检测。

2 结果

2.1 转染质粒的电泳结果

电泳如果如图1, 图中M为DNA分子标准, 1、2为提取质粒。说明抽提的质粒比较好, 可以进行转染实验。

2.2 RT-PCR检测rh EPO的mRNA的表达结果

RT-PCR结果如图2, 图中M为DNA分子标准, 1为转染组, 2为对照组。转染组能在648 bp位置出现目的片段条带, 对照组没有目的片段出现。初步说明重组质粒进入了细胞并且表达了mRNA。

2.3 实时定量PCR检测rh EPO的mRNA表达结果

图3和图4分别为目的基因和内参基因的溶解曲线图, 两种基因的溶解曲线都只有单一的峰, 说明所设计的引物有较高特异性, 只扩增出单一产物。图5和图6分别为rh EPO和β-actin的扩增曲线, 以转染了空载体的CHO-K1细胞为对照样品, 计算出实验组样品相对于对照样品的rh EPO的mRNA表达量 (2-△△Ct) , 结果如表1。

注:Compare with the two groups;**P<0.01。

2.4 Factor Xa酶切细胞外膜上的rh EPO结果

消化液丙酮沉淀浓缩后经SDS-PAGE分析, 结果如图7, 图中M为蛋白分子标准, 1、2、3为转染消化组, 4、5为转染未消化组, 6为空白组。转染消化组在34 k D范围有明显的蛋白条带, 转染未消化组和空白组均没有在34 k D范围内出现蛋白条带。初步确定成功切下了融合蛋白上的rh EPO。

2.5 Western Blot检测细胞总蛋白中rh EPO表达结果

Western Blot检测结果如图8, 图中1、2是转染组, 3、4是空白对照组。在转染的CHO-K1细胞总蛋白通过Factor Xa消化后, 在约34KD位置检测到rh EPO蛋白条带。未转染细胞看不到rh EPO蛋白条带。

2.6 ELISA检测细胞总蛋白中rh EPO含量结果

细胞总蛋白中rh EPO含量ELISA检测结果如表2。

2.7 Western Blot检测胞外消化液中rh EPO表达结果

Western Blot实验结果如图9, 图中1为转染组, 2为空白对照组。转染了pc DNA3.1-TM-Factor Xa-EPO重组质粒的消化液经丙酮沉淀浓缩后能检测到rh EPO蛋白, 非转染对照组则看不到rh EPO蛋白。

2.8 ELISA检测胞外消化液中rh EPO含量结果

胞外消化液中rh EPO含量ELISA检测结果如表3。

3 结论

我们首次设计把EPO的成熟肽c DNA与TNF-α跨膜段 (TM) 相连接, 尝试把构建的EPO重组载体转染到CHO-K1细胞中表达。实验证明pc DNA3.1-TM-Factor Xa-EPO是能在CHO-K1细胞中表达rh EPO。基于TNF-α跨膜段的pc DNA3.1-TM-Factor Xa-EPO跨膜真核表达载体在CHO-K1细胞里表达的融合蛋白是以跨膜形式存在, 融合蛋白活性段在细胞外。可以用Factor Xa酶切割下来, 得到可控性酶切目的产物。由于表达的蛋白活性区在细胞外, 高表达对宿主本身的毒性等影响较小, 且易于分离纯化。ELISA检测到转染24 h的细胞胞外rh EPO浓度为298.65μg/m L。

摘要：为了构建一种能快速表达人EPO蛋白的真核表达系统, 本研究运用的方法是构建基于TNF-α跨膜段 (transmembrane, TM) 的pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO真核表达载体。把构建好的载体瞬时转染CHO-K1细胞, 用FactorXa消化TM-FactorXa-EPO融合蛋白, rhEPO从FactorXa位点处切割下来, 达到高效表达和可控酶切。结果本研究构建的表达系统能高效快速表达人EPO。ELISA检测到转染24 h的细胞:经FactorXa酶消化总蛋白, rhEPO浓度为285.21μg/mL;经FactorXa酶消化胞外rhEPO, rhEPO浓度为298.65μg/mL。