废酵母菌范文

废酵母菌范文（精选4篇）

废酵母菌 第1篇

为了满足社会日益增长的需求,矿物质开采和加工业迅速发展,这导致世界各地重金属污染严重。水中的重金属离子对人类产生严重的毒害作用,去除水中的重金属离子是需要迫切解决的课题。铜离子是城市污水中常见的重金属离子,其主要来源于某些工业废水,如漂洗和电镀废水中都含有大量的铜。铜离子会通过生物吸附作用在人体内积累,对人体健康造成了严重的威胁[1]。铜离子会使动物蛋白变性而产生毒性。因此,重金属离子在水中的浓度须降低到国家环境安全规定水平之下。

目前,有多种技术方法可用于去除水溶液中的重金属[2,3]。这些方法有絮凝法、化学沉淀法、离子交换法和吸附再生法[4]。其中吸附再生法是活性污泥法的一种。这种方法可以充分提高活性污泥的浓度,降低有机营养物和微生物之比,简单经济有效,现被广泛采用。

发酵工业的生物残渣含有细菌、酵母菌等多种类微生物,如饮料工业中的酵母菌、制作柠檬酸的真菌、酶工业中的葡萄糖和脂酶等[7,12]。本研究是以一种微波改性的废酵母菌作为吸附剂对废水中的铜离子进行吸附,因为活的酵母菌虽然效果好,但是价格较高且难以保存[4,5],给实验增加了难度。而废酵母菌具有易固化、反复使用的优点,可用于制造特殊生物吸附剂[6]。用失活的废酵母菌吸附废水中的重金属离子,能够节约废水处理成本,还可对生物残渣进行废物利用,达到了真正的以废治废[9,10]。

本研究对废酵母菌吸附废水中重金属离子Cu2+的实验过程进行了热力学、动力学研究,评价了废酵母菌对废水中重金属离子Cu2+的吸附效率[14],并对实验结果的数据采用Langmuir等温式进行了拟合。

2 实验方法

实验材料选用蒸馏水溶解定量分析纯的硫酸铜,配制500 mg/L的Cu2+溶液。实验用废酵母菌为沈阳某制药厂的液体状废菌泥。对废菌泥进行处理,将其取200mL置于烧杯中,放入微波炉在中高温状态下加热15min,对其进行微波改性,取出后放于烘箱内在恒温115℃状态下烘干,研磨成粉备用。

在不同参数条件下,在含一定浓度的初始溶液中分别加入不等量的微波改性酵母菌,搅拌后进行离心分离,取上清液测定其中残留Cu2+离子的含量。

3 结果和讨论

3.1 溶液的pH值对Cu2+吸附效果的影响

在温度25℃时,用HCl和NaOH(质量分数为10%)调节200mL含铜废水(浓度为100 mg/L)的pH值,在其pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0时,用0.6g的微波改性废酵母菌加入废水中,振荡速度180r/min,反应120min,沉淀10 min,测定含铜废水反应后铜离子的变化见图1。

由图1可知,Cu2+的吸附效果受到pH值较大的影响。实验在振荡吸附时间充足、吸附剂用量适宜的前提下进行,Cu2+的去除率随着溶液pH值的升高而逐渐增大。当pH=7时,溶液为中性,溶液中吸附剂对Cu2+的去除率达到最大。这说明微波改性酵母菌对溶液中Cu2+吸附实验进行的最佳pH为7。

Cu2+的去除效果与溶液pH有关,因为酸碱性的变化会影响官能团的离子电荷性。在pH<7(溶液为酸性)时,大量的H3O+与金属离子竞争吸附位点,导致废酵母菌对Cu2+的吸附能力下降;当pH>7(溶液为碱性)时,生物吸附活性点受到影响,水解生成的氢氧化物沉积在废酵母菌表面,影响废酵母菌对Cu2+的吸附能力。

3.2 反应时间对Cu2+吸附效果的影响

在温度为25℃时,用HCl和NaOH(质量分数为10%)调节200mL含铜废水(浓度为100 mg/L)的pH=7,取0.6g微波改性废酵母菌加入废水中,在振荡速度为180r/min时,将各组的反应时间分别取为30、60、90、120、150、180min,反应后沉淀10 min取其上清液测量浓度,所测定的铜离子去除率的变化趋势见图2。

由图2可知,在初始的60min中,微波改性废酵母菌有大量的活性位点可与Cu2+反应,在这个过程中吸附反应速度非常快,溶液中Cu2+的去除率急剧上升,吸附效果非常好。溶液中可用于吸附Cu2+的生物活性吸附位点相对减少,Cu2+的去除率的上升趋势减缓,随着反应时间的增长,吸附剂与溶液充分接触反应,Cu2+的去除率逐渐增大。当吸附反应时间为90min时,去除率达到最大,为94.91%。

用准二级速率方程来拟合吸附过程,其吸附反应动力学分析见图3。由图可估算出qe=23.87mg/g,该值与实验值qe=23.68mg/g接近,相关系数R2=0.999 78。分析表明准二级动力学模型可以很好描述微波改性废酵母菌对废水中Cu2+的吸附过程。

3.3 反应温度、溶液初始浓度及Cu2+浓度对吸附效果的影响

分别在反应温度为25、40、55、70℃时,将浓度分别为40、60、80、100、120、140 mg/L的含铜废水150mL用质量分数为10%HCl及NaOH调节pH值至7,废水中加入0.6g微波改性废酵母菌,在振荡速度为180r/min时反应90min后,沉淀10 min取上清液,测定其反应后Cu2+的变化,不同温度下吸附剂对Cu2+的吸附等温线见图4。

由图4可知,溶液中剩余铜离子的浓度也随着含铜废水初始浓度的增加而增加,吸附剂对Cu2+的去除率降低。当C0=40mg/L时铜的去除率最好,达到96.23%。

在吸附剂投加量不变的前提下,吸附位点的数量有限,当初始Cu2+浓度较低时,吸附剂能够提供充足的生物活性位点,此时Cu2+的去除率很高;而当初始Cu2+浓度升高时,其生物活性位点相对不足,吸附位点产生竞争,致使Cu2+无法完全被有限的废酵母菌吸附,导致对Cu2+的去除率下降。本次吸附反应过程采用Langmuir等温式对实验数据进行拟合(图5)。

图5中4条等温线的qm和KL数值通过线性回归实验数据得到。不同温度下Cu2+在微波改性酵母菌上的等温吸附常数见表1。表1显示吸附剂对Cu2+的吸附行为与Langmuir吸附等温线有较好相关性。

由表1可知,随着反应温度不断升高,吸附剂对Cu2+的吸附量qe也随之增大。不同温度下吸附反应达到平衡,通过ln(qe/ce)对qe作图(图6)推出qe=0时的值。根据最小平方分析得到直线上的各点的热力学常数K0,数据见表2。

通过lnK对1/T作图,得到图7,计算出吸附反应的焓变△H和熵变△S。实验得到的标准焓变△H=3.169 09kJ/mol,这表明吸附剂对Cu2+的吸附过程是一个吸热反应。温度的升高有利于吸附的进行,在这4个温度下标准自由能变化△G0<0,并且随着温度的升高而变小,这说明了微波改性酵母菌对Cu2+的吸附过程是一个自发的过程,自发的程度随着温度的升高而增大。正的熵变△S=20.214 86J/Kmol可导致酵母菌表面官能团与被吸附溶液发生离子交换。△S0的正值也说明吸附质的自由度增加了。

4 结语

吸附剂微波改性废酵母菌对Cu2+的吸附过程表明,微波改性废酵母菌对Cu2+的吸附效果比较好,能够有效地去除废水中的Cu2+。

微波改性废酵母菌的最佳反应条件为:温度55℃、pH值7、吸附剂投加量4g/L、振荡速度180r/min、反应时间90min,废液中Cu2+的吸附效果达到最好。

废酵母菌 第2篇

本实验研究的重要意义在于利用啤酒废酵母泥中含有多种对人体有益的微量成份, 通过对啤酒废酵母泥进行脱苦、脱臭工艺及自溶抽提其中的营养物质, 并将其中具有许多营养成分的抽提物应用到酸奶发酵中, 将啤酒酵母的提取物添加到酸奶发酵中, 这样不仅可以增加了酸奶的鲜味, 而且还能够使酸奶中所含的营养成分更为丰富, 从而能够生产出更优质的酸奶, 对人体更为有益[3]。通过对啤酒酵母酸奶最佳工艺条件的研究, 这样不但可以解决当前大量啤酒废酵母泥的浪费问题, 以及由于啤酒酵母泥大量向环境中排放所带来的环境问题, 同时还能为啤酒生产企业带来一定的经济效益[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯牛奶 (或者市售当天鲜牛奶, 理化指标和微生物指标合格, 不含抗生素) 菌种:嗜热链球菌 (St) , 保加利亚乳杆菌 (Lb) St:Lb=1:1[5] (或者市售酸奶) 啤酒废酵母, 白砂糖。

1.2 设备

酸奶瓶, 高压蒸汽灭菌锅, 转速为2000r/min的离心机, 恒温培养箱, 80目的筛子, 100目的筛子, 水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

纯奶蔗糖调配过滤预热 (50～55℃) 均质 (15.68～17.64MPa) 杀菌 (90～95℃, 5～10min) 冷却 (43～45℃) 接种灌装保温发酵冷却至室温冷藏 (4℃左右) 检验成品。

1.3.2 工艺要求

啤酒废酵母的制备的生产工艺:废弃啤酒酵母预处理120目过筛分离脱苦调整母液浓度加促进剂自溶 (温度50℃, pH5.2～6.0, 时间24h) 酶解 (pH7.0, 50℃, 24h) 纳米对撞机破碎 (150～200MP, 循环2～4次) 加麦芽根酶解酶 (70℃, 3～4h) 加热灭酶 (95℃, 10min) 离心分离酵母上清液浓缩酵母抽提物产品。

1.3.3 调配、均质

将啤酒酵母抽提物和纯牛奶按一定比例混合, 并加入一定量的蔗糖, 进行调配、混匀, 再将混合液预热到50～55℃, 均质。

1.3.4 杀菌

杀菌采用90～95℃, 维持5～10min, 杀死混合液中的有害微生物, 使至少75%乳清蛋白变性, 且使各成分进一步混匀。

1.3.5 感官评分

根据啤酒酵母酸奶的乳清析出情况、风味、口感进行感官品分并测量所做酸奶pH值。

2 结果与分析

2.1 啤酒废酵母发酵工艺条件的选择

2.1.1 啤酒废酵母酸奶配方的选择

实验结果表明, 啤酒酵母酸奶最佳工艺条件为:啤酒酵母:牛奶=1:2;接种量1%, 加糖量10%, 发酵时间4h, 参见表1、表2、表3、表4。

2.1.2 发酵温度的选择

根据嗜热链球菌 (St) 的最适生产温度40～45℃[7], 保加利亚杆菌 (Lb) 的最适生产温度:40～45℃[8], 以及酸奶中的一般温度参数, 本实验取两种菌株最适生产温度的中间值, 采用42℃发酵。

2.2 杀菌条件的选择

杀菌温度的选择, 要考虑达到杀菌目的, 提高成品的感官质量, 同时又要最大限度保持牛奶中原有的营养成分。酸奶制作过程, 最易出现乳清析出现象, 热处理不当是引起乳清析出的主要原因之一[9]。根据研究, 变性乳清蛋白可与络蛋白形成复合物, 能容纳更多的水分, 并具有最小的脱水收缩作用, 防止乳清析出, 至少要使755的乳清蛋白变性, 这就要求90～95℃, 5～10min的热处理[10]。这个热处理条件同时可以满足杀菌目的, 故选择90～95℃, 5～10min的杀菌条件。

3 产品质量指标

3.1 感官指标

实验发酵获得的酸奶呈现乳白色, 均匀一致, 没有分层现象, 无气泡及沉淀现象, 与鲜奶相比较为粘稠, 具有啤酒酵母独特的鲜味和浓郁的乳酸菌发酵酸奶香味, 无异味, 酸甜适口, 口感细腻柔和。参见图1。

1酸奶;2酸奶:蒸馏水=1:1混合液;3酸奶:蒸馏水=1:3混合液;4酸奶:蒸馏水=1:4混合液。

3.2酸奶pH的测定

见图2。

啤酒酸奶测定的pH值为5.5左右。

4结论

(1) 实验结果表明:啤酒酵母酸奶的最佳工艺条件为:啤酒酵母:牛奶=1:2, 接种量1%, 加糖量10%, 发酵时间4h。

(2) 以啤酒酵母为原料制作的酸奶制品, 风味独特, 酸甜适口, 营养丰富, 富含啤酒废酵母中对人体有益的营养成份, 是一种新型的优良保健饮料, 具有较高的营养价值, 市场前景广阔。

5 讨论

在本实验进行的过程中需要注意一些容易引起发酵失败的一些因素, 首先注意鲜奶的选择, 要选用不含抗生素的鲜奶。其次, 要注意的是接种过程中要在超净工作台上接种, 避免杂菌的污染;第三点, 需要注意发酵时pH值及温度的控制, 根据菌种的生长曲线, 将发酵条件控制在最适条件从而能够使菌种更好的生长;第四点, 需要注意的是在杀菌过程中温度不能过低或者过高, 时间不能过长或者过短;第五点, 在对牛奶进行装瓶的时候注意不要洒在瓶壁外面, 否则容易引起细菌的污染。

通过实验获得的结果是啤酒酵母酸奶的最佳工艺条件为:啤酒酵母:牛奶=1:2, 接种量1%, 加糖量10%, 发酵时间4h。酸奶为乳白色, 均匀一致, 无分层, 无气泡及沉淀现象, 比鲜奶较粘稠, 具有啤酒酵母独特的鲜味和浓郁的乳酸菌发酵酸奶香味, 无异味, 酸甜适口, 口感细腻柔和, pH值在5.5左右, 不是过酸也不是过甜。如果啤酒酵母比牛奶的比例过小, 则会使发酵出来的酸奶只具有酸奶风味而不具有啤酒酵母的鲜味或者啤酒酵母的鲜味不够明显。发酵时间过长的话有可能使发酵酸奶过酸, 发酵时间过短的话, 则会使发酵出来的酸奶不具有酸奶的味道。

摘要：啤酒酵母泥是啤酒发酵过程中的主要副产物之一。啤酒酵母细胞含水分量为75～80%左右, 主要成分是蛋白质、核酸、B族维生素和矿物质元素等。以啤酒废酵母泥为原料, 通过脱苦、脱臭工艺及自溶抽提其中的营养物质, 可以用作酸奶制作中的添加剂, 来生产出优质酸奶。通过对啤酒酵母酸奶最佳工艺条件的研究得知, 啤酒酸奶制作的最佳工艺为:啤酒酵母:牛奶=1:2, 接种量1%, 发酵时间4h, 培养温度42℃。

关键词：啤酒废酵母,脱苦,脱臭,酸奶,最佳工艺

参考文献

[1]衣海龙, 郭玲玲, 张巍, 黄宝玺.啤酒酵母泥的综合利用[J].酿酒, 2009, 36 (6) .

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[4]喝酸奶有益健康[J]. (中国建材资讯) 北京建材, 2006 (3) .

[5]曹军卫, 马辉文, 张甲耀.微生物工程[M].北京:科学出版社, 2007.

[6]李彦.利用啤酒废酵母泥生产营养酸奶[J].包装与食品机械, 2004, 22 (5) .

[7]岑佩霖.工业微生物学[M].北京:化学工业出版社, 2000.

[8]蒋爱民.乳制品工艺及进展[M].西安:陕西科学技术出版社, 1996.

[9]郑建仙.功能性食品[M].北京:中国轻工业出版社, 1996.

废酵母菌 第3篇

啤酒在食品工业中具有一定的战略经济地位, 2011年底世界上啤酒的年产量已达到1927亿L, 啤酒已成为继茶、碳酸饮料、牛奶和咖啡后的第五大消费饮料[1]。中国是全球啤酒消费量和产量最大的国家, 2011年我国啤酒总产量为0.5亿t[2], 同时啤酒产量以每年6%的百分点不断增长。

啤酒废酵母是啤酒生产过程中的主要副产物之一, 它是由啤酒和酵母细胞组成的泥浆状混合物, 含有丰富有用成分, 各种物质的含量如表1所示。

啤酒酵母的有用成分和含量相对食用酵母、面包酵母及精牛肉来说具有较高的营养价值。

随着啤酒产量的逐年增加, 啤酒废酵母的产生量也不断增大, 其中每生产100t啤酒, 就会产生大约1~1.5t的酵母泥[3], 废酵母的含水量在70%~90%之间[4]。2/3的废酵母来源于主发酵沉淀酵母, 剩余的废酵母主要是后发酵贮酒罐的沉淀酵母, 这些啤酒废酵母的合理化利用将会带来可观的收益, 反之将会给环境带来巨大挑战。

目前啤酒废酵母提取制药物质的研究中, 有一个重要的研究方向是啤酒废酵母提取谷胱甘肽, 谷胱甘肽主要由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成, 是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽。谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性肽, 对维持身体正常的免疫系统、抗氧化和整合解毒等发挥重要作用。

本文以啤酒废酵母作为原料, 采用热水法提取废酵母中的GSH, 同时通过响应面实验设计进行提取条件的优化。

2 实验

2.1 实验装置

实验装置示意图如图1所示。

2.2 实验方法

2.2.1 啤酒废酵母预处理方法

实验所用啤酒废酵母取源于成都市某啤酒生产厂, 将取得的啤酒酵母混合液分装于离心管内, 以2500r/min速度离心20min, 去掉上清液, 加入5倍体积去离子水, 用玻璃棒搅拌均匀, 再以2500r/min速度离心20min, 重复3次, 去掉上清液, 用称量袋分装沉淀的湿酵母, 置于4℃的冰箱内备用。

2.2.2 含水量测定

参照城市污水污泥检验方法 (CJ/T221-2005) , 将均匀的预处理后的啤酒废酵母称量后放入恒重的蒸发皿在水浴上蒸干, 然后在105℃的烘箱内烘干至恒重, 减少的重量与原重量的百分比值作为含水量, 计算公式如下:

式中:m为废酵母取样质量, g;m1为烘干恒重后蒸发皿与废酵母的总质量, g;m2为蒸发皿的质量, g。

2.2.3 GSH的测定

目前测量谷胱甘肽的方法主要有3种:四氧嘧啶法、亚硝基铁氰化钠法、5, 5'二硫代双 (2-硝基苯甲酸) 法 (简称TNB法) 。由于四氧嘧啶法灵敏度高 (R2可达0.999以上) 、准确度高、数据重现性好、显色稳定、能避免半胱氨酸等含巯基化合物的影响, 因此本文采用四氧嘧啶法对啤酒废酵母提取液中的GSH进行定量分析。在实验条件下, GSH与四氧嘧啶反应生成物在305nm有最高吸收峰, 人们也将该法称为四氧嘧啶305法。

(1) 试剂配置。 (1) 1mg/mL GSH标准溶液。准确称取0.1gGSH标准品, 用去离子水定容至100mL。 (2) 0.02mg/L四氧嘧啶溶液。称取0.08g四氧嘧啶试剂, 用去离子水定容至25mL。 (3) 0.01mol/L甘氨酸溶液。称取0.0752g甘氨酸, 用去离子水定容至100mL。 (4) 磷酸盐缓冲溶液。分别配置0.2mol/l磷酸二氢钠中和0.2mol/L磷酸氢二钠溶液, 将二者按照10∶1体积混合, 既得0.2mol/L、pH值7.5的缓冲溶液。

(2) 标准曲线绘制。分别取GSH标准液 (1mg/mL) 0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mL于1~6号10mL比色管中, 在各比色管中加入0.02 (mg/L) 四氧嘧啶溶液0.5mL, 从1~10号比色管中加入0.5mL 0.01mol/L甘氨酸溶液, 再加入0.5mL 0.2mol/L磷酸缓冲溶液, 用去离子水稀释到10mL, 稀释混匀后, 静置40min, 用1cm比色皿以去离子水作为参比, 在波长305nm处测量溶液的吸光度。以测得的吸光度A为纵坐标, GSH含量 (mg) 为横坐标, 绘制工作曲线。啤酒废酵母提取液中的GSH的测量按照上述过程进行。

(3) 样品提取液中GSH的测定。取适量体积的酵母提取液于10mL比色管中, 加入四氧嘧啶溶液、甘氨酸溶液、磷酸缓冲液各0.5mL, 用去离子水稀释至刻度, 混匀后, 静置40min, 用1cm比色皿测量吸光度, 同时按照上述过程做空白试样。吸光度计算公式如下:

式中:A为浓度为C时溶液的吸光度;a为吸光系数, mL/ (mg·cm) ;b为比色皿厚度, cm;C为溶液中GSH浓度, mg/mL。

公式 (2) 中, a是与溶质相关的常数。在同一测量条件下, 测量溶液中GSH浓度时, ab的乘积为常数, 因此吸光度值与溶液中GSH的浓度值成正比, 通过配置GSH溶液标准系列, 绘制标准曲线, 测量样品溶液的吸光度后, 可以计算出样品溶液中GSH的浓度。

2.2.4 蛋白质的测定

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色, 同时结合物在595nm处有最大光吸收, 同时其光吸收值与蛋白质的含量成正比, 因此用该法作为蛋白质定量测定方法。

(1) 试剂配置。 (1) 1mg/mL牛血清白蛋白标准溶液。称取0.1g牛血清白蛋白, 用去离子水定容至100mL。 (2) 0.1mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液。称取0.1g考马斯亮蓝G-250试剂于250mL烧杯中, 加入50mL90%乙醇充分溶解, 再加入100mL85%的H2PO4, 用去离子水定容至1000mL。

(2) 标准曲线绘制。分别取牛血清包蛋白标准溶液:0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL于1~6号10mL比色管中, 分别在比色管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液, 再分别在1~6号比色管中加入去离子水, 使比色管中的液体总体积为6mL。以去离子水为参比, 用1cm比色皿在波长为595nm处测量吸光度。

(3) 提取液中蛋白质的测定。取适量体积的酵母提取液于10mL比色管中, 在比色管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液, 同时加入一定体积的去离子水, 使比色管中溶液总体积为6mL, 做空白试样, 以去离子水为参比在波长595nm处测量样品吸光度 (A) 。样品中蛋白质浓度的计算原理同公式 (2) 。

2.3 试验设计分析方法

2.3.1 响应面分析法

响应面分析法 (Response surface methodology, RSM) 是实验条件寻优的方法, 该法主要采用数学与统计学相结合, 考虑多因素 (自变量) 影响下对实验结果的影响。其原理是通过多个确定性实验, 来模拟实验因素与目标函数的极限状态曲面, 从而很容易地进行可靠性分析。响应面法针对多变量试验来说具有耗时短, 所需费用、试剂及实验材料少等优点, 因此用这种方法对实验条件进行优化时效率较高。其中响应面方法有中心组合设计 (Central Composite, 包括通用旋转组合设计、二次正交组合设计等) 、BOX设计 (Box-Behnken设计) 、二次饱和D-最优设计 (D-optimal设计) 、均匀设计、田口设计等。

本文采用通用旋转组合设计进行实验安排, 考察n个因素 (xi, i=1, 2, 3, …, n。) 的不同水平对啤酒废酵母提取液中谷胱甘肽含量 (yi, i=1, 2, 3, …, n) 、蛋白质 (zi, i=1, 2, 3, …, n) 含量的影响, 由m组实验可得2 m组数据 (x1, x2, …, xn, y1) , (x1, x2, …, xn, z1) ;…; (x1, x2, …, xn, ym) , (x1, x2, …, xn, zm) , 在数学分析上用泰勒展开式模型来进行非线性拟合, 一般二次的泰勒展开式就能满足收敛, 同时生物科学变量间的特点也遵循以下规律[32]:

因此可求得考察因素与GSH含量和蛋白质含量的回归方程:^y=f (x) , ^z=f (x) 。在热水法提取啤酒废酵母中的谷胱甘肽的时, 以pH (x1) 、提取温度 (x2) 、提取时间 (x3) 、料水比 (x4) 为自变量、分别以GSH含量 (y) 和蛋白质含量 (z) 为因变量拟合二次函数得:

其中如果系数ai、bi、…、0i (i=1、2) 经过检验可用, 不仅能全面掌握自变量和因变量的关系, 而且能求出方程的极值点, 即确定了GSH含量最高值和对应的最优条件因素取值。

2.3.2 正交试验设计

正交实验设计 (orthogonal experimental design) 是利用正交表的形式来安排多因素的不同水平的试验设计。正交试验设计的特点是用部分水平试验组合代替全部水平试验组合, 进行试验点的安排, 试验数据经过分析挑选最优水平组合 (例如最优配方、最优工艺条件) 。

3 响应面法优化热水法提取啤酒废酵母中的GSH

3.1 啤酒废酵母含水量分析和GSH提取步骤

3.1.1 啤酒废酵母含水量分析

本文所用啤酒废酵母来自成都市某啤酒厂, 啤酒废酵母形貌如图2所示。

啤酒废酵母的含水量分析如表2所示。

取4个样的含水量的平均值作为啤酒废酵母的含水量, 即为90.35%。

3.1.2 热水法提取废酵母中GSH的步骤

准确称取预处理的啤酒废酵母于250mL的烧杯中, 根据料水比加入相应的去离子水, 再用浓硫酸调节至所需的pH值, 将烧杯放置在一定温度的恒温水浴锅中, 在180r/min的条件下提取一定时间。提取后混合液冷却至室温, 转移至离心管中, 在2500r/min条件下离心20min, 将上清液装入试剂瓶中及时测定提取液中GSH和蛋白质含量。提取完后的固体废物转移至烧杯中, 放入60℃的烘箱内烘干至恒重, 装入样品袋中, 置于干燥皿中备用。

3.1.3 标准曲线

(1) GSH标准曲线。采用四氧嘧啶法测定提取液中GSH的含量, 标准系列的配置和测量结果如表3所示。

标准曲线见图3所示。

由图3可知标准曲线方程为y=0.003x+0.044, R2=0.998, 在测定提取液中的GSH时, 取0.5mL样品进行测量, 对照标准曲线方程计算提取液中GSH的含量。若样品吸光度测量值超出标准曲线范围, 应增加提取液体积或者稀释后再进行测定。

(2) 蛋白质标准曲线。采用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质, 标准系列及结果如表4所示。

蛋白质标准曲线如图4所示。

由图4所示标准曲线方程为y=0.006x-0.045, R2=0.999, 在测定提取液中的GSH时, 取0.05mL样品进行测量, 对照标准曲线方程计算提取液中蛋白质的含量。若样品吸光度测量值超出标准曲线范围, 应增加提取液体积或者稀释后再进行测定。

3.2 单因素试验

3.2.1 pH值对GSH提取的影响

在温度、时间和料水比不变 (分别为65℃、5min、0.25g/mL) 的条件下, 加入浓硫酸调节溶液的pH值, 在不同的pH值条件下提取啤酒废酵母中的GSH和蛋白质, 结果如图5所示。

由图5可知当pH值为2时, GSH含量最大, 随着pH值的不断增加, GSH和蛋白质的提取量不断降低, 主要由于浓硫酸的添加量变少, 啤酒酵母的细胞破裂数量减少, 从而酵母细胞内的GSH、蛋白质没有得到有效释放。同时pH值的增大, 提取过程中GSH氧化程度也加大, 从而使提取液中GSH含量降低。

3.2.2 温度对GSH提取的影响

当pH值、时间和料水比保持不变 (分别为2min、5min、0.25g/mL) , 考察温度分别为40、50、60、70、80、90℃时, 提取液中GSH和蛋白质含量的变化情况。实验结果如图6所示。

由图6可知, 随着温度的升高, GSH的提取量不段增加, 当增加温度升高到60℃时, 提取液中GSH的含量最高, 同时蛋白质的含量也最高, 继续升高提取温度, GSH的含量几乎保持恒定, 而蛋白质由于温度的升高而逐渐降低, 主要由于温度升高蛋白质将发生变性, 从而含量降低。

3.2.3 提取时间对GSH提取的影响

保持pH值、温度和料水比不变且分别为2℃、60℃、0.25g/mL, 考查在提取时间分别为0、5、10、15、20、30min条件下, GSH、蛋白质提取量的变化, 如图7所示。

根据图7得知, 随着提取时间增加, GSH的含量在不断增加, 蛋白质的含量也不断增加。当提取时间为5min时, GSH的提取量达到最大, 增加提取时间GSH的提取量几乎保持不变。

3.2.4 料水比对GSH提取的影响

当pH值、温度、时间分别保持为2℃、60℃、5min时, 在料水比分别为0.05、0.25、0.45、0.65、0.85、1g/mL条件下, 研究啤酒废酵母提取液中GSH、蛋白质含量变化情况, 如图8所示。

根据图8知, 随着料水比的增加GSH的提取量增加后降低, 蛋白质的提取量不断降低。当料水比为0.2g/mL时, GSH的提取量最高。

3.3 响应面分析

在单因素实验基础上, 确定影响GSH提取因素的取值范围, 采用Design-expert 6.0软件进行GSH提取优化实验的设计。

3.3.1 中心组合设计因素水平

通过单因素实验分析, 选取pH值 (x1) 、提取温度 (x2) 、提取时间 (x3) 、料水比 (x4) 四个因素作为自变量, 采用响应面法中的中心组合设计对谷胱甘肽的提取工艺条件进行优化, 具体的因素水平确定如表5所示。

3.3.2 响应面设计实验结果分析

(1) 实验结果。应用design expert 6软件, 根据表5实验条件得到实验安排及结果如表6所示。

(2) 响应面法分析谷胱甘肽响应面方程及方差分析。通过Design expert 6.0对谷胱甘肽提取效果与各因素进行回归拟合, 得到如下方程:

该回归方程中自变量对因变量 (影响因素对响应值) 的影响的显著性用F检验进行判断, 其中p值大小表示显著性的高低, 当p<0.01为高度显著 (用“**”表示) , 当p<0.05为显著 (用“*”表示) , 方程的回归分析如表7所示。

表7直观反映了各因素及其交互作用对响应值 (GSH提取量) 的影响, x1、x2、x3、x4对模型的影响为高度显著, 同时x2、x3的二次方对模型的影响也为高度显著, x1、x2的交互对模型的影响也为高度显著。模型项p<0.0001说明响应值与x1…回归的关系是极显著。

图9~图13表示了各因素对GSH提取量的相应情况。

(3) 响应面法对谷胱甘肽提取液中蛋白质含量的分析。通过Design-expert 6.0对GSH提取液中蛋白质的含量的分析得出蛋白质含量的方程模型如下:

对方程 (7) 进行方差分析, 分析结果如表8所示。

根据相应方差分析表中p值的大小, 可以看出, 啤酒废酵母提取GSH过程中, pH值、提取温度、料水比等对提取液中蛋白质含量的影响显著, pH值与料水比的交互作用对蛋白质的含量也有高度显著影响。同时根据模型值P值大小表明所得方程对蛋白质的提取量高度显著, 因此可用此方程来计算一定提取条件下的蛋白质提取含量。

(4) 验证性试验。分别对GSH的回归方程的x1、x2、x3、x4求一阶导数, 可得如下4个方程:

当倒数为零时, 求出的x1、x2、x3、x4对应的y值最大, 也即是啤酒废酵母提取GSH的最佳提取条件。因此令方程 (8) ~ (11) 为零得:x1=1.6、x2=61.8、x3=11.4、x4=0.39, 即GSH提取的最佳工艺条件为:pH值为1.6、温度为61.8℃、提取时间为11.4min、料水比为0.39g/mL。

在此最佳工艺提取条件下, 通过三组平行实验, 验证该条件的GSH和蛋白质提取结果的可靠性, 实验结果如表9所示。

实验验证结果说明, 实验值与预测值吻合度高, 相对误差小, 证明模型计算的值与优化实验的测定值是一致的。同时, 所得GSH最优提取条件下, 蛋白质的提取量不高, 有利于GSH的提纯等后续工艺进行。因此回归方程为啤酒废酵母细胞内的GSH的提取提供了一个较好的模型, 可将此模型应用于GSH的提取工艺中。

4 小结

(1) 分析来自成都某啤酒生产厂的啤酒废酵母的性质, 测定啤酒酵母的含水量为90.35%。

(2) 利用单因素试验分析pH值、温度、提取时间、料水比对GSH、蛋白质提取量的影响, 分析得出:GSH最佳提取条件范围为, pH值1.5~2.5, 温度50~70℃, 提取时间5~15min, 料水比0.2~0.5g/mL。

(3) 利用Design-expert 6.0中的响应面分析法和GSH的最佳实验条件范围进行实验设计。根据实验结果:从啤酒废酵母中提取GSH的最佳实验条件为pH值为1.6、温度为61.8℃、提取时间为11.4min、料水比为0.39g/mL。根据预测模型计算出啤酒废酵母中活性炭的最佳提取值可达7.829mg/g。

(4) 通过实验验证预测模型得出的最佳实验条件的GSH提取量值, 最佳提取条件下进行的三组平行试验的平均值为7.823mg/g, 表明实际值与预测值大小基本一致, 说明所得模型很好地反映了GSH的提取情况, 可用于指导实践工作。

参考文献

[1]Luc F., Pascal B.A., Georges D..Water, wastewater and waste management in brewing industries[J].Cleaner Production, 2006 (14) :463~471.

[2]中国啤酒委员会国际啤酒网:http://www.chinaibeer.com//.

[3]孔明, 姚茹华.啤酒废酵母综合利用的探讨[J].广州食品工业科技, 2003, 19 (2) :59~62.

废酵母菌 第4篇

酵母多糖是从酵母细胞壁中提取的大分子碳水化合物的聚合物, 主要成分是β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖包括 (1, 3) β-D-葡聚糖与少量的 (1, 6) 连接葡萄糖和其他支链[1]。甘露聚糖通常以共价键和蛋白质结合, 称为甘露糖蛋白[2]。

β-D-葡聚糖通常称为生物反应调节剂 (BRM) [3]。β-D-葡聚糖可以作为免疫应答, 抗癌, 造血调控, 保肝, 降低胆固醇以及降血糖活性[4,5,6,7,8]。β-D-葡聚糖也有抗氧化的作用和能会加速伤口愈合的作用[9,10]。细胞壁甘露聚糖也有粘接性能[11]和抗原变异[12]。鉴于多糖以上所有的特性和用途, 前人已有很多研究。但是大多数都是β-D-葡聚糖和甘露聚糖单独提取。我们提出了一个同时生产两种产品的新方法。这个方法过程简单, 高效和易于转换到大规模生产。

生产过程见图1。

1 实验

1.1 实验材料

固体含量为25%废酵母泥:南京同凯兆业生物技术有限公司提供。酶:沈阳诺维信生物技术有限公司。试剂均为国产分析纯。

1.2 分析方法

1.2.1 多糖的含量测定

采用苯酚硫酸法-与6%的苯酚浓度测定, 于490nm紫外吸收处测定总糖, 分别用葡萄糖和甘露糖为标准曲线定量[13]。

1.2.2 蛋白质的测定

通过凯氏定氮分析仪测定总氮 (福斯特卡托, 公司, 瑞典) 根据AOAC正式方法。由总氮含量乘以6.25计算蛋白质含量。

1.2.3 灰分的测定

干燥后的样品在600℃焚烧炉中测定灰分 (林德伯格/蓝色M, 美国) [14]。

1.2.4 含盐量的测定

用硝酸银滴定法测定盐, 用作指示剂铬酸钾。

1.2.5 红外光谱

β-D-葡聚糖和甘露聚糖红外光谱分析在Nicolet 380光谱仪中进行 (热电, 美国) 。样品KBr压片近似重量比为1:100[15]。

1.3 过程

1.3.1 预处理

由于废啤酒酵母浆包含一些杂质和无机离子。预处理是用蒸馏水洗涤混合物 (300g) 在室温下以5000 rpm搅动两次, 每次维持10分钟。每次洗涤后放置在温度4℃下冰箱中备用。

1.3.2 超声处理

预处理后的酵母细胞壁是加入0.02M柠檬酸盐缓冲液 (添加碱调整到p H=7.2) 得到的悬浮液中固体含量为15%。在室温下在超声波细胞破碎仪中 (jy92-ⅡDN新芝生物科技有限公司, 宁波) 进行超声, 程序设计为超声2s停2s持续10分钟。

1.3.3 高温高压提取

超声后将悬浮液放入压力为0.1MPa在高压蒸汽灭菌器中高压灭菌90min, 温度为121℃后冷却到30℃。不溶性残留物通过离心分离, 并将柠檬酸盐缓冲液与上清液 (SUP) 结合, 存储在4℃下。沉积物 (SED) 被用来提取β-D-葡聚糖。

1.3.4 β-D-葡聚糖的提取

(1) 碱处理。

通过正交法L9 (34) 优化提取条件。九种提取物分别在提取温度为50℃, 55℃和60℃, 提取时间分别为2h、3h、4h, 固液比为1/3, 1/4, 1/5 (W/V) 和Na OH浓度为2%, 3%, 4%下进行。表1显示了实验条件为β-葡聚糖的提取啤酒废酵母泥300g, 其中含有78.42%的水分。混合后冷却到室温, 不溶性残留物在室温15min 5000rpm条件下被离心分离, 用蒸馏水洗涤两次。丢弃上清液和收集沉淀物。

(2) 蛋白酶处理

碱处理后用不同的酶酶解, 目的是降低蛋白质含量和纯化多糖。用水稀释得到的悬浮液含有15% (W/W) 的固体含量。分别用木瓜蛋白酶 (P1) , 复合酶 (P2) 和中性蛋白酶 (N) 在各自的最佳条件酶解后, 悬浮液5000rpm离心10min。丢弃上清液, 收集湿产物。

(3) 洗涤和干燥

湿β-D-葡聚糖悬浮在95%乙醇混悬液中搅拌3h, 然后离心弃上清。用乙醇冲洗两遍, 在60℃下干燥。

1.3.5 提取甘露聚糖

(1) 浓度

在50℃-60℃下, 在旋转蒸发器 (re-52, 中国上海中国生化仪器厂) 超浓缩至原体积的1/2-1/3。完成后溶液冷却至室温。

(2) 透析

在室温条件下, 对蒸馏水透析适当时间后测定溶液盐度。

(3) 脱水

浓缩的溶液滴加三倍体积的乙醇搅拌, 然后储存在4℃下超过10h。

(4) 洗涤和干燥

用乙醇沉淀数次直到上清液透明, 甘露聚糖真空过滤, 并在60℃下干燥。收集的甘露聚糖是白色无定形粉末。

2 结果与讨论

2.1 预处理

预处理会损失去一部分多糖, 所以洗两次是最好的。通过物理或者化学的方法使完整的酵母通过自溶和渗透来提取酵母内容物[14]。葡聚糖和甘露聚糖产量如表2所示。

经过高温高压处理, 将混合物离心。这个过程可以有效地分离甘露糖蛋白和葡聚糖。此外, 高温高压处理能显著降低细胞壁[16]的机械强度, 这可能有助于下酶解。

Mannans-1 meant the SUP, the sample precipitated from, without dialysis.Mannans-2 meant the sample was precipitated from the dialysis SUP.a-refering to the weight of the starting material.b-determination after acid hydrolysis ofβ-D-glucans and mannans.c-calculation by total N*6.25.

2.2 β-D-葡聚糖的分离

2.2.1 碱处理

工艺中氢氧化钠可以去除一些不需要的成分如蛋白质, 脂类和多糖。温度, 提取时间, 料液比、Na OH浓度通常被认为是最重要的因素。优化的β-D-葡聚糖提取合适的提取条件可通过正交实验实现。表3显示了实验条件对碱提取结果的影响。因此, 表4列出了K, k、R值。

KiA=∑the amount of target compounds at Ai.kiA=KiA/3.RiA=max{kiA}-min{kiA}.

根据表4中R的数值, 以碳水化合物及粗蛋白平均百分比的影响分别是:B>A>D>C, A>D>C>B。由于蒸馏水相对便宜, 所以增加料液比有助于去除其他杂质, 因此, 我们选择C2为适用条件。Na OH浓度 (因子) 的确定的粗蛋白含量和高浓度碱易造成多糖[17,18,19,20]降解, 因此适用条件是D2。对于葡聚糖提取过程的最优参数组合为A3B2C2D2。即, 提取温度, 提取时间, 料液比、Na OH浓度分别为60℃, 3h, 1/4, 和3%。

2.3 甘露聚糖提取

2.3.1 浓度与透析

上清液 (SUP) 经过高温高压处理后收集, 在旋转蒸发器浓缩。由于SUP含有大量的盐, 如果超浓缩过度, 盐从溶液中析出, 造成多糖的损失, 因此, 2-3倍是适当的浓度。

经过蒸馏水透析一段时间, 盐从溶液中渗透到蒸馏水中。以碳水化合物和灰分的含量为评价指标。溶液盐度和其中碳水化合物和灰分含量的产品之间的关系如图2所示。

根据分析, 随着盐度的降低, 碳水化合物和蛋白质都相应增加, 灰分减少, 即在产品中的活性成分增加。如图所示, 灰分随着盐度的变化不断减少。但是, 盐度的变化从1.81%到0.06%, 9h内灰分下降仅为0.17%, 不利于工业化发展。因此, 溶液的适宜盐度为0.8%~1.2%。

2.4 产物定性

2.4.1 红外检测

在3384cm-1/3397cm-1, 2932cm-1/2922cm-1, 1644cm-1/1637cm-1处有明显的吸收带, 分别是-OH, C-H键和C=O拉伸吸收峰。在1200cm-1-950cm-1的是C-O振动吸收峰。最重要的约891cm-1处的吸收带说明葡聚糖是β-构型, 845cm-1处是α-吡喃环[21]端基异构体形式。在811cm-1和912cm-1处的特殊吸收说明M是α-甘露聚糖[22], 这从他们的单体单元和葡聚糖的特征谱带在1157cm-1, 1078cm-1, 1040和891cm-1处, 这表明链接为β构型。因此, 说明产物是β-D-葡聚糖和α-甘露聚糖。如图3所示。

3 结论