T-载体的构建

T-载体的构建（精选11篇）

T-载体的构建 第1篇

1 材料和方法

1.1 材料

pEGFP-N1购于Clontech,Top10菌株购于北京天为时代。DNA marker和限制性内切酶 (包括EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ)购于TakaRa公司,PfxDNA聚合酶、Superscript Ⅲ First-Strand synthesis superMix、T4 DNA连接酶购于Invitrogen公司。 PCR 产物纯化试剂盒、DNA 胶回收纯化试剂盒为Promega产品。PCR 引物序列:T-钙粘蛋白基因F (上游引物,5’端含有EcoR Ⅰ酶切位点):5’ CCGGAATTCATGCAGCCGAGAACTCCGCT 3’ 29bp,R(下游引物,5’端含有BamHⅠ酶切位点):5’ CGCGGATCCTCACAGACAAGCTAAGCTGAAG 3’ 31bp。内对照人β-actin 引物F:5’ CCTCGCCTTTGCCGATCC 3’ 18bp,R:5’ GACTGACTACCTCATGAAGATCC 3’ 23bp,其合成及目的基因测序由上海生物工程技术有限公司完成。Millipore 纯水器为Millipore 公司产品 、低温高速离心机为Heraeus 公司制造、DU800 核酸蛋白分析仪为Backman 公司制造 、凝胶成像仪为Bio-Rad公司制造。

1.2 方法

1.2.1 T-钙粘蛋白cDNA的获得

首先用Trizol液氮研磨法[6]从人子宫平滑肌(由承德医学院附属医院病理科提供)提取总RNA。而后逆转录反应,用甲醛变性并琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA,确定无降解后,取总RNA 10μg,Oligo(dT) 20和Annealing Buffer各2μl,加无RNase/DNase水到16μl,混合后65℃孵育5min,然后立即置于冰上进行操作,取其10μl加入SuperScriptTMⅢ/ RNaseOUTTM 2μl,混匀之并短暂离心,50℃孵育50min.,85℃5min终止反应,然后置于冰上,迅速离心,每管中加入1μl RNase H,37℃孵育20min。而后进行PCR扩增,反应体系有双蒸水39μl 、10AccuPrimeTM pfx Reaction Mix 5μl 、引物F和R 各1.5μl 、模板cDNA 2μl 、Pfx DNA 聚合酶 1μl 。反应条件:95 ℃,变性2min ;95 ℃30s、60℃30s、68℃ 2min30s ,共34 个循环;68 ℃ 再延伸10min,而后取PCR 产物2μl置于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

1.2.2 pEGFP-N1和目的基因的双酶切[7]

分别将pEGFP-N1(200ng/μl) 10μl和已纯化目的基因PCR 产物(50ng/μl) 20μl各依次加入10K Buffer 5μl、 EcoRⅠ 和BamHⅠ各1μl,混合后加双蒸水至总容量为50μl,pEGFP-N1 质粒37 ℃酶切2h,目的基因37 ℃酶切1h,而后上述两种产物均各取2μl纯化,胶回收后产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 目的基因连接入载体pEGFP-N1[7]

使用TaKaRa 连接试剂盒将目的基因(T-钙粘蛋白基因)和pEGFP-N1通过相同双酶切粘性末端使二者进行连接,连接反应体系为T-钙粘蛋白扩增后的酶切回收产物11.5 μl加入5T4 DNA连接酶缓冲液1.5μl和pEGFP-N1酶切回收产物1μl,而后加入T4 DNA 连接酶1μl,16℃反应10h。

1.2.4 重组真核载体的转化、扩增及表达筛选[7]

将上述连接产物转化至Top10新鲜感受态大肠杆菌中,接种于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基37℃培养16～24h , 4℃放置数小时,重组质粒细菌菌落为白色,未重组的为蓝色,挑取白色菌落培养扩增,而后限制性内切酶分析提取并纯化质粒。

1.2.5 重组真核载体中目的基因的鉴定[7]

挑取平板培养基上生长的阳性菌落,应用质粒抽提试剂盒(Promega 公司)抽提pEGFP-N1/T-cadherin 重组质粒, 而后对其进行EcoRⅠ/BamHⅠ和EcoRⅠ/SalⅠ的双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时对所提重组质粒进行PCR鉴定,其所用上下游引物反应体系和条件以及电泳同上。之后选取酶切及PCR鉴定正确的菌落,送交上海生物工程技术有限公司进行测序以确保重组质粒pEGFP-N1/T-cadherin 中插入了正确的目的基因序列及读码框架。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取情况

用Trizol 液氮研磨法提取的人子宫平滑肌组织总RNA,通过甲醛变性,1%琼脂糖凝胶电泳观察rRNA的带形来估计mRNA的完整性。本实验中琼脂糖凝胶的浓度为1%。可清楚看到28S、18S和5S rRNA带形(Fig.1)。说明RNA没有明显降解,可用其反转录合成cDNA。

2.2 T-cadherin-cDNA片段扩增产物的的获得

以从子宫平滑肌组织中提取的总RNA反转录出的cDNA为模板,用上下游引物进行RT-PCR,而后34个循环的PCR扩增,其产物在琼脂糖凝胶电泳中除有625bp的β-actin条带外,还有2 000bp和2 500bp之间有1条呈明显条带,其大小为2.142kb(Fig.2),为T-cadherin-cDNA片段。

2.3 pEGFP-N1/T-cadherin的构建

回收并纯化PCR产物后,将其与pEGFP-N1均进行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,之后用T4连接酶将二者进行连接,产物电泳可见在7 500bp附近有一条带,即为pEGFP-N1/T-cadherin,(Fig.3)说明T-钙粘蛋白真核表达载体构建成功。

2.4 PCR产物的克隆及鉴定

将pEGFP-N1/T-cadherin转化Top10,挑取白色菌落培养扩增。提取质粒,经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化,分离纯化、电泳分别得到2.142kb和4.68kb的片段(Fig.4)。T-钙粘蛋白基因含有SalⅠ酶切位点,限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切后电泳,分别得到了显示在短于2 000bp 和在5 000bp DNA Marker附近的两条明显的条带(Fig.4第3泳道),证明重组质粒有T-钙粘蛋白基因插入。将有2 142bp片段插入的pEGFP-N1/T-cadherin真核表达载体送上海生物技术公司测序,重组质粒图谱的测序结果如Fig.5显示,结果证实插入片段为T-钙粘蛋白的cDNA,其序列与GeneBank(NM_001257)报道的99%一致。

1. T-cadherin cDNA; 2. β-actin; M: D15000+2000 DNA ladder.

1. pEGFP-N1 ; 2. pEGFP-N1/T-cadherin ;M: D15000+2000 DNA ladder.

1. pEGFP-N1/T-cadherin(BamHⅠ); 2.pEGFP-N1/T-cadherin(EcoRⅠ/BamHⅠ); 3.pEGFP-N1/T-cadherin(EcoRⅠ/SalⅠ); 4.D15000+2000 DNA ladder; 5,6. PCR product from the recombinant plasmid.

3 讨论

T-钙粘蛋白是一种新型的钙粘蛋白分子,它不仅在细胞与细胞间的粘附、识别起作用,而且在维持正常的细胞表型中也起重要作用。T-钙粘蛋白在多种人类肿瘤中表达减少,因此人们推测这种基因的功能或许是作为一种肿瘤抑制基因。又有研究发现T-钙粘蛋白在皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤中的重新表达能抑制肿瘤细胞的生长,降低体外培养的肿瘤细胞的侵袭潜能[8,9]。因此,探讨T-钙粘蛋白是否对肿瘤有作用,对于肿瘤的治疗研究,药物开发具有重要意义,这也就成为本研究的的出发点。

T-钙粘蛋白基因在肿瘤组织表达减少,而在正常组织中以血管组织、平滑肌组织中表达较高[10],而其中平滑肌组织更易于mRNA的提取,子宫平滑肌组织易于获得,因此本试验选择了人子宫平滑肌组织进行总RNA的提取,本实验中应用Trizol 液氮研磨法提取的总RNA[6]获得了成功。

RT-PCR是克隆cDNA常用的方法,可以从微量的mRNA逆转录扩增得到特异的片段。本研究用敏感性和特异性均较高的RT-PCR方法,获得了T-钙粘蛋白的cDNA。本实验依据已知的基因序列合成的上游引物为29bp,并在其5’加入了EcoRⅠ酶切位点;合成的下游引物为31bp,在其5’加入了BamHⅠ酶切位点。设计引物时还考虑了上下游引物的GC含量相似,其保证它们的Tm值差别不大。并且所设计的引物与模板中互补的序列为20bp左右,这样提高了PCR产物的特异性。这些措施对本实验获得的结果起到了有益的作用。

本实验所扩增得到的特异性片段为2 137bp,其所含碱基数量多片段较长,应用PCR方法扩增较为困难,并且其特异性较差,余昆等[7]应用PCR方法扩增小鼠survivin 基因,其长度仅438kb,为了扩增出长达2 137bp的T-钙粘蛋白基因,本研究中改变了PCR的条件,首先用Pfx DNA 聚合酶代替TagDNA 聚合酶,反应体系中不含DMSO、甘油、甲酰胺、硫酸铵,变性、退伙时间均由20s增至30s,尤其延伸由20s增至2min30s,扩增循环数也由25次增至34次,最后延伸由5min增至10min才得到了目的片段,与预期片段大小基本相符,基因测序与预期片段99%一致。

为了进一步研究T-钙粘蛋白功能将其基因片段定向插入到真核表达载体中,重组成T-钙粘蛋白真核表达质粒。质粒pEGFP-N1真核表达载体在哺乳动物细胞中高表达,具有卡那霉素抗性,编码一种增强的绿色荧光蛋白(Excitation/emission=488/507nm),为筛选节省了时间,真核细胞筛选应用G418,选择该质粒较为理想[11];T-钙粘蛋白基因片段长达2 142bp,其插入到真核表达载体pEGFP-N1中后,可能影响其在原核和真核细胞中的扩增,但是通过该实验发现,其在原核中的扩增并未受到大的影响,在转化入大肠杆菌16～24h后即可见到阳性克隆,与余昆等[7]的挑取阳性克隆的时间相近。阳性克隆经EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定以及进行PCR扩增鉴定,初步鉴定为T-钙粘蛋白 cDNA。将测序结果与GeneBank中的T-钙粘蛋白基因序列用pubMed上的blast 软件进行比对,比对结果该片段与文献和GeneBank(NM_001257)上发表的序列一致性达99%。表明已经成功构建了重组pEGFP-N1/T-cadherin真核表达质粒。

摘要：目的:克隆出人T-钙粘蛋白基因,并应用pEGFP-N1构建其重组真核表达载体。方法:Trizol液氮研磨法提取出人子宫平滑肌组织总RNA。设计一对分别含有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点的人T-钙粘蛋白基因上下游引物。利用Pfx DNA聚合酶高保真RT-PCR扩增cDNA,并将其连接到pEGFP-N1的多克隆位点,然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果:提取的人子宫平滑肌组织总RNA可清楚看到28S、18S和5S rRNA带形。反转录出的cDNA为2.142kb,将其与pEGFP-N1均进行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,之后用T4连接酶将二者进行连接,产物电泳可见在7 500bp附近有一条带,即为pEGFP-N1/T-cadherin,双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确。结论:重组真核表达载体pEGFP-N1/T-cadherin构建成功,为下一步研究人T-钙粘蛋白基因在黑色素瘤中的作用奠定基础。

关键词：人T-钙粘蛋白,pEGFP-N1,pEGFP-N1/T-cadherin,真核表达载体,黑色素瘤,基因克隆

参考文献

[1]Ciatto C,Bahna F,Zampieri N,et al.T-cadherin structures reveal anovel adhesive binding mechanism[J].Nature Structural&MolecularBiology,2010,17(3):339-347.

[2]Tang Y,Dai Y,Huo J.Decreased expression of T-cadherin is associ-ated with gastric cancer prognosis[J].Hepato-Gastroenterology,2012,59(116):1294-1298.

[3]Kyriakakis E,Maslova K,Philippova M,et al.T-Cadherin is an aux-iliary negative regulator of EGFR pathway activity in cutaneous squamouscell carcinoma:impact on cell motility[J].Journal of Investigative Der-matology,2012,132(9):2275-85.

[4]Ellmann L,Joshi MB,Resink TJ,et al.BRN2 is a transcriptional re-pressor of CDH13(T-cadherin)in melanoma cells[J].Laboratory In-vestigation,2012,92(12):1788-1800.

[5]刘海燕,段昕所,金小平,等.恶性黑素瘤中T-钙粘蛋白的表达[J].中国麻风皮肤病杂志,2009,25(3):163-165.

[6]杨智,程春凤,黄昕艳,等.Trizol法提取新生小鼠脑组织总RNA优化比较[J].中风与神经疾病杂志,2012,29(2):155-156.

[7]余昆,苟欣,杨华安,等.小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定[J].生物技术,2009,19(6):1-4.

[8]陆海涛,孙立新,陆洁,等.T-钙黏蛋白对黑素瘤侵袭力的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2011,25(5):329-332.

[9]Pfaff D,Philippova M,Buechner SA,et al.T-cadherin loss inducesan invasive phenotype in human keratinocytes and squamous cell carcinoma(SCC)cells in vitro and is associated with malignant transformation of cuta-neous SCC in vivo[J].British Journal of Dermatology,2010,163(2):353-363.

[10]Andreeva AV,Kutuzov MA,Tkachuk VA,et al.T-cadherin is loca-ted in the nucleus and centrosomes in endothelial cells[J].AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology,2009,297(5):C1168-1177.

pSITITIN载体的构建及表达 第2篇

pSITITIN载体的构建及表达

目的构建能阻断Wistar大鼠肌联蛋白表达的siRNA载体,为研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化的过程中肌小节结构蛋白之间的相互关系打下基础.方法针对Wistar大鼠TITIN N2B区设计并构建重组质粒pSITITIN,针对人β-ACTIN设计并构建重组质粒pSIACTIN,利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养1周的新生大鼠心肌细胞和经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导后2周的`MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白的表达.结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞和经5-aza处理后的MSCs后,肌联蛋白的表达均减弱(P<0.01);而转染pSIACTIN后不影响肌联蛋白的表达.结论 pSITITIN具有确切阻断肌联蛋白表达的效果.

作 者：张小飞 陈沅 田杰 ZHANG Xiao-fei CHEN Yuan TIAN Jie 作者单位：重庆医科大学儿童医院心血管内科,重庆,400014刊 名：第三军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE年，卷(期)：28(7)分类号：Q782 R394-33 R394.2关键词：骨髓间充质干细胞 RNA干扰 肌联蛋白

T-载体的构建 第3篇

关键词：杨树;EBP1基因;克隆;表达载体;构建;基因序列分析;蛋白同源性比对

中图分类号： Q943.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0014-03

收稿日期：2014-05-25

基金项目：天津市高等学校科技发展基金（编号：20120619）;天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCQNJC15000）。

作者简介：李 慧（1981—），女，河北廊坊人，硕士，讲师，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：lihui@tjau.edu.cn。

通信作者：阎国荣，博士，教授，主要从事植物资源学研究。E-mail：yanguorong@eyou.com。

自然界中植物种类繁多、形态各异，其中器官大小是造成植物形态多样性的主要因素之一。不同植物间器官大小可能存在显著差异，但就同一物种内相同基因型的不同植物个体而言，在相同的生长环境下它们的器官大小基本一致，表明植物各器官最终大小的形成受到严格的遗传调控[1]。因此，近年来从不同植物中挖掘参与器官大小发育调控的基因或转录因子并揭示其调控机制的研究备受关注，并已在拟南芥和一些农作物如水稻、玉米、油菜、番茄、马铃薯等中取得了长足的研究进展[1-2]。有研究发现，在外界生长条件一致的情况下，植物各器官的最终大小在细胞水平上受细胞数量和大小的协同控制[3]。因此，分离、克隆参与调控植物细胞数量和大小的基因并阐释其功能是揭示植物器官大小发育控制机制的关键。目前，在拟南芥等草本植物中已有多个相关基因和转录调控因子被成功分离和克隆。有研究表明，AINTEGUMENTA（ANT）[4]、ANGUSTIFOLIA3（AN3）[5]、GROWTH-REGULATING FACTOR5（AtGRF5）[5]、GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）[6-7]、JAGGED（JAG）[8]、STRUWWELPETER（SWP）[9]、SWELLMAP1（SMP1）[10]、KLUH（KLU）[11]、EBP1[12]及Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size（ARGOS）[13-14]等主要通過正向调控细胞增殖能力控制器官内细胞数量，进而影响器官大小。这些基因的异位过表达可通过延长细胞增殖时间导致植物器官变大，而突变则会导致植株器官整体变小。另外，还有一些基因通过调控细胞大小来影响器官的大小，如ARGOS-LIKE（ARL）[15]、ROTUNDIFOLIA3（ROT3）[16]、AtGRF1/2[17]、BIGPETAL[18]、AtTOR[19]、ORGAN SIZE RELATED1（OSR1）[20]等，其中拟南芥中EBP1被证实对植物细胞数量和大小均能发挥正向调控作用[12]。拟南芥EBP1是和人类的ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成相关，该基因在进化上具有较高的保守性。目前除在拟南芥外，在沙冬青和马铃薯中也有该基因序列的相关报道，但该基因在其他植物中的功能仍未知，特别是在木本植物中，尚未有该基因的相关报道。因此，本研究对杨树中EBP1基因进行克隆，并对其表达载体进行构建。相关研究对进一步揭示杨树EBP1的功能具有重要意义，同时对采用基因工程等手段提高林木产量和品质具有潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑杨（Populus nigra），种植于南开大学校园内;pEASY-T1载体，购于北京全式金生物技术有限公司;植物表达载体pBI121、农杆菌LBA4404，均由笔者所在实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 黑杨总RNA提取及反转录 采用改良的CTAB法提取黑杨叶片总RNA，以Oligo dT（18）为逆转录引物，在 M-MLV 作用下逆转录成cDNA。

1.2.2 引物设计及同源克隆 以拟南芥及其他草本植物中已经报道的EBP1基因DNA及cDNA序列为种子序列，利用Blast序列比对软件搜索杨树基因组及EST数据库，获得杨树中候选EBP1基因序列。随后根据筛选、获得的杨树中EBP1候选序列设计引物，进行扩增，并对扩增结果进行测序验证。进一步对NCBI数据库中收集的杨树EBP1相关EST序列进行分析，结合测序结果，对杨树中EBP1基因全长cDNA序列进行克隆及序列分析。

1.2.3 杨树EBP1表达载体构建及分子鉴定 根据已获得的杨树EBP1候选基因全长cDNA序列，设计带有酶切位点的全长cDNA扩增引物，对EBP1全长cDNA进行扩增及 T-A 克隆。挑取含有杨树EBP1全长cDNA的阳性克隆，放大培养并提取质粒，通过双酶切获得带有黏性末端的EBP1全长cDNA序列。进而与经过相同双酶切的植物表达载体pBI121采用T4连接酶进行连接，最终获得EBP1重组表达载体。将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞，在LB+卡那霉素（Kan）板上筛选阳性克隆进行菌液PCR和酶切验证，进而获得插入方向和序列完全正确的阳性克隆。随后将该阳性克隆放大培养，采用质粒提取试剂提取重组质粒，并采用冻融法将该重组质粒导入农杆菌LBA4404感受态细胞，在YEB+链霉素（str）+利福平（Rif）板上筛选阳性克隆进行菌液PCR验证。

nlc202309040443

2 结果与分析

2.1 杨树EBP1基因的克隆

根据序列同源性分析结果，设计引物对EBP1-1F：5′-ATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和 EBP1-1R：5′-TTCCTAGACGGCGGTGG-3′，以黑杨cDNA为模板对杨树中EBP1候选基因进行克隆。扩增结果显示，黑杨中EBP1候选基因全长cDNA约为1.2 kb（图1）。将获得的cDNA通过T-A克隆方法，连入pEASY-T载体，挑取阳性克隆进行测序。测序结果显示，杨树中EBP1基因全长cDNA序列长度为1 215 bp，将其命名为PtEBP1。

2.2 杨树PtEBP1的生物信息学分析

根据测序结果，对获得的PtEBP1进行进一步的序列分析。同源性比对结果显示，PtEBP1与已报道的沙冬青和马铃薯EBP1基因具有较高的同源性，其中与沙冬青EBP1蛋白序列的同源性为89%，与马铃薯EBP1蛋白同源性为87%（图2）。保守结构域分析结果显示PtEBP1含有1个PA2G4-like-domain，这个结构域属于APP_MetAP超家族（图3）。由此推测杨树PtEBP1基因应属于转录因子APP_MetAP超家族的一个成员。

2.3 PtEBP1表达载体的构建

为对PtEBP1的功能及作用机制进行探究，本试验进一步对PtEBP1植物表达载体进行构建。首先通过对PtEBP1的序列分析，结合pBI121载体酶切位点信息，确定选用XbaⅠ和SacⅠ对pBI121载体进行切割;随后设计带有XbaΙ和SacⅠ切割序列的引物PtEBP1-F：5′-TCTAGAATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和PtEBP1-R：5′-GAGCTCCTAGACGGCGGTGG-3′用于扩增PtEBP1，将扩增序列通过T-A克隆方法导入pEASY-T1质粒，挑取阳性克隆并提取质粒，对质粒进行XbaⅠ和SacⅠ双酶切消化处理后，获得带有双酶切位点的目的片段，与经过同样双酶切的pBI121的载体进行连接（图4）。

上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，PCR检测显示阳性重组克隆中含有1.2 kb的目的片段;阳性重组克隆进一步经过XbaⅠ和SacⅠ双酶切后也能产生1.2 kb的目的片段（图5）。这表明杨树EBP1基因已成功构建入植物转基因表达载体pBI121中。

2.4 农杆菌LBA4404中表达载体的菌液PCR鉴定

采用冻融法将已构建好的表达载体pBI121-PtEBP1转化农杆菌（LBA4404）感受态细胞，在含有链霉素和利福平的YEB固体培养基上进行筛选。随机挑取4个阳性克隆进行菌液PCR，PCR扩增产物均为1.2 kb（图6），证明表达载体已成功转入农杆菌中。

3 结论与讨论

EBP1是拟南芥中和人类ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成有关，可以同时控制细胞的分裂和延伸，从细胞数量和体积2个方面同时调控植物器官大小。EBP1基因以剂量依赖型方式调节植物器官大小，同时也以生长素依赖形式对细胞周期调节因子進行调控[12]，该基因与蛋白合成密切相关，并参加调控细胞周期，在调节植物器官大小方面具有重要意义。

杨树是重要的用材和绿化树种，具有经济和生态双重价值。但和其他绝大多数木本植物一样，杨树生长周期也较长，遗传背景复杂，很难在短时间内创造出大量突变体。因此，长期以来对杨树等木本植物器官形态建成及生长发育调控机制等基本问题的研究远远落后于拟南芥等草本植物。而2006年杨树全基因组测序的完成[21]及随后不断丰富完善的杨树及其近源种的EST数据信息，为采用生物信息学手段结合反向遗传学策略探究杨树生长发育机制等基本问题提供了一条有效途径。

本研究通过克隆获得的杨树PtEBP1基因应属于转录因子APP_MetAP超家族的一个成员。通过蛋白同源性比对发现，杨树PtEBP1与已报道的与沙冬青、马铃薯的EBP1蛋白同源性高达89%、87%。同时，本研究已将杨树PtEBP1基因构建入植物转基因表达载体pBI121中，并成功转入农杆菌LBA4404中，为进一步开展杨树中EBP1类转录因子的功能研究、深度解析杨树生长发育优势形成的分子基础奠定了重要的基础。

参考文献：

[1]Krizek B A. Making bigger plants：key regulators of final organ size[J]. Current Opinion in Plant Biology，2009，12（1）：17-22.

[2]Mizukami Y. A matter of size：developmental control of organ size in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（6）：533-539.

[3]Breuninger H，Lenhard M. Control of tissue and organ growth in plants[J]. Curr Top Dev Biol，2010，91：185-220.

[4]Mizukami Y，Fischer R L. Plant organ size control：AINTEGUMENTA regulates growth and cell numbers during organogenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（2）：942-947.

nlc202309040443

[5]Horiguchi G，Kim G T，Tsukaya H. The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，2005，43（1）：68-78.

[6]Kim J H，Kende H. A transcriptional coactivator，AtGIF1，is involved in regulating leaf growth and morphology in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101（36）：13374-13379.

[7]Lee B H，Ko J H，Lee S，et al. The arabidopsis GRF-INTERACTING FACTOR gene family performs an overlapping function in determining organ size as well as multiple developmental properties[J]. Plant Physiology，2009，151（2）：655-668.

[8]Dinneny J R，Yadegari R，Fischer R L，et al. The role of JAGGED in shaping lateral organs[J]. Development，2004，131（5）：1101-1110.

[9]Autran D，Jonak C，Belcram K，et al. Cell numbers and leaf development in Arabidopsis：a functional analysis of the STRUWWELPETER gene[J]. EMBO Journal，2002，21（22）：6036-6049.

[10]Clay N K，Nelson T. The recessive epigenetic swellmap mutation affects the expression of two step Ⅱ splicing factors required for the transcription of the cell proliferation gene STRUWWELPETER and for the timing of cell cycle arrest in the Arabidopsis leaf[J]. Plant Cell，2005，17（7）：1994-2008.

[11]Anastasiou E，Kenz S，Gerstung M，et al. Control of plant organ size by KLUH/CYP78A5-dependent intercellular signaling[J]. Developmental Cell，2007，13（6）：843-856.

[12]Horvath B M，Magyar Z，Zhang Y X，et al. EBP1 regulates organ size through cell growth and proliferation in plants[J]. EMBO Journal，2006，25（20）：4909-4920.

[13]Hu Y X，Xie O，Chua N H. The arabidopsis auxin-inducible gene ARGOS controls lateral organ size[J]. Plant Cell，2003，15（9）：1951-1961.

[14]Wang B，Zhou X C，Xu F，et al. Ectopic expression of a Chinese cabbage BrARGOS gene in Arabidopsis increases organ size[J]. Transgenic Research，2010，19（3）：461-472.

[15]Hu Y，Poh H M，Chua N H. The arabidopsis ARGOS-LIKE gene regulates cell expansion during organ growth[J]. Plant Journal，2006，47（1）：1-9.

[16]Kim G T，Tsukaya H，Uchimiya H. The ROTUNDIFOLIA3 gene of Arabidopsis thaliana encodes a new member of the cytochrome P-450 family that is required for the regulated polar elongation of leaf cells[J]. Genes & Development，1998，12（15）：2381-2391.

[17]Kim J H，Choi D S，Kende H. The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2003，36（1）：94-104.

[18]Szecsi J，Joly C，Bordji K，et al. BIGPETALp，a bHLH transcription factor is involved in the control of Arabidopsis petal size[J]. EMBO Journal，2006，25（16）：3912-3920.

[19]Deprost D，Yao L，Sormani R，et al. The arabidopsis TOR kinase links plant growth，yield，stress resistance and mRNA translation[J]. EMBO Reports，2007，8（9）：864-870.

[20]Feng G，Qin Z，Yan J，et al. Arabidopsis ORGAN SIZE RELATED1 regulates organ growth and final organ size in orchestration with ARGOS and ARL[J]. New Phytologist，2011，191（3）：635-646.

[21]Tuskan G A，Difazio S，Jansson S，et al. The genome of black cottonwood，Populus trichocarpa （Torr. & Gray）[J]. Science，2006，313（5793）：1596-1604.

论企业思想政治教育载体的构建 第4篇

关键词：企业,思想政治教育,教育载体

1 思想政治教育载体的内涵

“载体”一词本是科技术语, 原意是指传递或运载某种物质的工具。载体这一概念最早出现于化学领域, 后来广泛应用于科学技术的各个领域, 20世纪90年代被引入到思想政治教育领域, 并形成了“思想政治教育载体”这一概念, 受到了学界的高度重视。

在研究思想政治教育载体的过程中, 关于思想政治教育载体的界定问题, 学者们普遍认为必须包含三个基本要素, 一是能够承载物质的物质, 二是能够为主客体所用, 三是主客体可以借此产生互动, 但是概念界定的观点不尽相同。

有的学者认为, 思想政治教育载体是指在思想政治教育过程中能承载并传递思想政治教育信息、内容的形式和手段。有的学者认为, 思想政治教育载体就是能承载、传导思想政治教育内容或信息, 并能为思想政治教育主体所运用、且主客体可借此相互作用的一种实体物质或某一具体活动形式。有的学者认为, 思想政治教育载体是指在实施思想政治教育的过程中, 能够承载、传递思想政治教育因素, 能为思想政治教育主体所运用、且主客体可借此相互作用的一种思想政治教育活动形式。有的学者认为, 教育载体是连接教育主体与教育客体之间的桥梁和纽带, 是思想政治教育的基本要素之一。有的学者认为, 思想政治教育载体是指在思想政治教育过程中承载和传递思想政治教育信息, 能为思想政治教育主体所操作并与思想政治教育客体发生联系的一种物质存在方式和外在表现形态, 它是联系教育主体和客体的中介之一。

这些认识从不同的角度揭示了教育载体的内涵, 对广大教育工作者有启迪作用, 对深化这一概念的理解奠定了基础。笔者认为, 教育载体在思想政治教育活动中连接着其他教育要素, 担负桥梁作用, 是实现教育目的、任务、目标与内容的手段与形式, 是一种载体中介。在思想政治教育过程中, 起着传输、增效、互动和检测作用, 因此, 思想政治教育载体是教育落到实处的关键环节。

思想政治教育载体是不断变化发展的。过去, 我们较多地运用开会、办学习班、文体活动、报刊等载体开展思想政治教育。目前, 在继承这些传统做法之外, 还大量运用各种管理载体、活动载体、文化载体、大众传媒载体、网络载体等。

2 企业思想政治教育载体的构建

为切实增强企业思想政治工作的针对性和时效性, 企业政工人员应研究如何改进原有载体, 以及创造和利用新的载体, 以顺应时代发展要求, 做好市场经济和信息社会条件下的思想政治教育工作。

(1) 加强管理载体, 发挥管理的规范功能。

管理载体是指寓思想政治教育内容于管理活动之中, 将思想政治教育与管理有机结合起来, 实现思想政治教育中有管理, 管理中有思想政治教育。运用管理载体, 有利于理顺人们的思想情绪, 得到管理对象的理解与支持, 体现管理的人性化特质;有利于保证管理目标和思想政治教育目的的双重实现, 有效解决思想政治教育和管理工作“两张皮”现象。

依托管理载体, 开展企业思想政治教育, 一方面要建立健全和执行各项规章制度来引导、协调、约束和规范职工的行为, 使之养成良好的行为习惯;另一方面要实行思想政治工作岗位和目标管理责任制, 把软任务变成硬指标, 将思想政治工作渗透到企业生产经营的全过程, 形成与生产同研究、同规划、同部署、同落实、同检查、同考核、同奖励的良性循环运转模式。

(2) 创设活动载体, 发挥活动的催化作用。

活动载体是指教育者为达到一定的思想政治教育目的, 有计划、有组织地开展各种活动, 寓思想政治教育的内容于活动之中, 使受教育者在活动中受到教育, 提高思想道德素质。活动载体具有目的性、参与性、实践性、趣味性等特点。其具体形式多样, 在企业, 有野外团队体验活动、参观学习活动、文艺体育活动、创优评先活动、技能竞赛活动、精神文明创建活动等等。

活动载体是思想政治教育载体系统的一种重要形态, 具有独特的价值与优势, 一是有利于实现思想政治教育内容的生动化、形象化、具体化, 促进教育客体的直接感知, 实现对教育内容的理性理解与感性认识的有机结合, 能更好地消化教育内容;二是有利于促进教育主体和教育客体的双向交流, 有效调动教育客体自我教育的积极性, 使之在活动中正确认识自已、评价自己, 自觉进行自我调节、自我控制, 收到“无教之教”的效果;三是有利于教育客体主体化, 即教育客体在活动中受到教育、使自己的思想道德素质提高的同时, 又以自己的行动感染着、教育着其他的参与者或未直接参加活动的众多的人们。运用活动载体开展思想政治教育, 应加强对活动的指导, 把握活动的主题方向, 围绕企业的中心工作, 紧贴职工的实际。

(3) 规划文化载体, 发挥文化的渗透功能。

文化载体是指能承载企业文化的事物, 寓思想政治教育内容于文化建设之中, 通过增长知识与提高素质, 以提高职工的思想认识和觉悟水平。文化载体建设主要在硬件和软件两个方面。硬件是指企业的物质文化环境。企业要从彰显企业核心价值观的角度出发, 完善企业文化设施, 加强企业园区和职工生活小区建设, 合理营造人文氛围, 发挥企业文化的思想政治教育功能。

软件主要是指企业的精神文化。企业文化是企业理念内容的高度浓缩和概括, 最能反映出时代要求和企业的发展要求, 有利于统一思想、协调行动、凝聚人心、鼓舞士气, 使企业成为一个有战斗力的团体。运用文化载体, 实现文化活动与思想政治教育的完美结合, 在职工中培育企业的核心理论和价值观, 树立企业观念和形象, 使职工将企业文化的精髓和实质内化于心, 外化为行, 增强对企业的认同感和凝聚力, 发挥团队作用, 创造最佳业绩。

(4) 运用传媒载体, 发挥传媒的辐射作用。

大众传媒载体, 是指向教育客体提供思想政治教育信息、进行正确舆论引导的大众传播媒介, 如报纸、杂志、书籍、广播、电视、电影等。大众传媒载体具有覆盖面广、传递迅速、影响力强等特点。利用大众传媒载体开展思想政治教育, 首先必须保证大众传媒旗帜鲜明地坚持邓小平理论、“三个代表”重要思想和科学发展观, 坚持党的路线方针政策和社会主义方向。其次应注意发挥各种传媒的不同优势, 取长补短, 形成综合效应, 全方位开展思想政治教育。第三, 应积极引导教育客体参与传播过程, 实现传播者和受众之间的有效互动, 以增强思想政治教育的效果。第四, 克服大众传媒的局限性, 努力消除大众传媒的负面影响。

(5) 开拓网络载体, 发挥网络的阵地作用。

网络载体是指利用互联网开展思想政治教育。网络载体是载体系统的一种最新形式, 具有开放性、交互性、及时性和平等性等特点。网络给企业思想政治教育带来了有利条件:一是网络为开展思想政治教育提供了充足的教育资源;二是有助于迅速、准确地了解职工的思想情绪和他们关心的热点问题, 增进相互沟通, 开展富有针对性的思想政治教育活动;三是参与主体的平等性缩短了人们的心理距离, 有助于增强思想政治教育的亲和力和说服力。

利用网络开展思想政治教育。一是建设好融思想性、知识性、趣味性、服务性为一体的企业思想政治教育网站 (页) ;二是加强网络舆论引导, 牢牢把握思想政治教育的主动权;三是开展网络道德教育, 增强职工的政治意识、法制意识、责任意识、安全意识和自律意识, 构筑抵制不良冲击的“防火墙”;四是建立健全网络思想政治教育的管理体制, 加强网络思想政治教育的管理;五是建设一支既具有较高政治理论水平、熟悉思想政治工作, 又掌握网络技术的专兼职网络思想政治教育者队伍。

思想政治工作的载体是多种多样的, 我们应该根据时代特征, 因地制宜, 根据不同情况灵活地选择不同的教育载体, 对传统载体加以改进, 努力实现并使用新载体, 以求达到最好的教育效果。

参考文献

[1]汪大喹.论高校思想政治教育载体建设[J].现代教育科学, 2009, (1) .

[2]郧在延.浅析思想政治教育载体的含义及分类[J].中南民族大学学报:人文社会科学版, 2005, (12) .

[3]王升臻.思想政治教育载体内涵、功能与形态刍议[J].广西青年干部学院学报, 2007, (9) .

T-载体的构建 第5篇

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的.CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO.利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功.

作 者：孙瑞芬 安玉麟 张鹤龄 兰海英 王静 程继东 刘力萍 SUN Rui-fen AN Yu-lin ZHANG He-ling LAN Hai-ying WANG Jing CHENG Ji-dong LIU Li-ping 作者单位：孙瑞芬,安玉麟,兰海英,刘力萍,SUN Rui-fen,AN Yu-lin,LAN Hai-ying,LIU Li-ping(内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古,呼和浩特,010031)

张鹤龄,ZHANG He-ling(内蒙古大学,生命科学学院,内蒙古,呼和浩特,010021)

王静,程继东,WANG Jing,CHENG Ji-dong(内蒙古农业大学,农学院,内蒙古,呼和浩特,010019)

虚拟项目：构建中职项目教学新载体 第6篇

【关键词】虚拟项目 教学载体 计算机应用基础

项目究竟是真实的好还是虚拟的好，可以说是众说纷纭、莫衷一是。虚拟项目和真实项目作为两种不同的教学载体，本身并无优劣之分，虚拟项目也并非是真实项目无法实现之后退而求其次的选择，而是一种基于现实课堂生态，着眼真实学生生活，为着教学目标实现的上佳选择。

一、知识负载更为适切

一个项目多大才合适，可能没有人能完全说清楚，因为这与项目的呈现结果——“产品”有关系。“产品”结构复杂、工艺繁杂、知识负载多，项目就大；“产品”结构单一、工艺简单、知识负载少，项目就小。可见，项目的大小并非取决于教师的主观意愿，而是由“产品”本身决定，一旦“产品”决定，项目也就基本确定。在此基础上，再将相关的教学目标（知识与技能、过程与方法、情感态度价值观）融入项目中，形成依附于“产品”存在的知识负载，这种融入有时是自然的，有时却是一种强行移植。

例如，在苏教版“计算机应用基础”学习领域一：“令人称奇的小机器——计算机基础知识简介”的项目1-2“操作Windows（4课时）”中，作者设计了一个项目——安装和卸载一款杀毒软件，并将Windows文件（夹）的管理、控制面板的管理、病毒的防与杀等知识点嵌入项目中。这是一个真实的项目，项目的特征较为分明，内容也很充实，但项目的知识负载安排较为牵强，试想，我们安装和卸载一款杀毒软件真的需要用到这么多知识负载吗？真的有这么繁杂吗？对于学生来说，安装一款软件往往是找到其中的install.exe（或setup.exe），然后一直点“下一步”，直至完成，而卸载也更为“傻瓜”。把这么多知识负载镶嵌于一个看似真实的项目中，学生却丝毫没有真实的情绪情感体验。

笔者在教学时扬弃了这一真实的项目，将整个项目解构成四个虚拟项目：一是“北国风光”，主要知识负载为图形界面及其操作方法；二是“室内寻宝”，主要知识负载为文件（夹）的相关操作；三是“破译密码”，主要知识负载为控制面板管理；四是“维护家园”，主要知识负载为安装和卸载软件、系统维护、查杀病毒。这样既保证项目教学目标的全覆盖，又使知识负载与虚拟项目更为适切。一方面变一般项目的“单一制”为虚拟微型项目的“联邦制”，四个微型虚拟项目相对独立，而四个虚拟微型项目的合成又完整地体现了大项目“操作Windows”的总体要求；另一方面通过解构与重构，也使项目的知识负载与虚拟项目更加紧密地融合在一起。

既然虚拟项目性本“虚拟”，那项目的知识负载也可“虚构”，教师也就有了更大的对教材进行二次开发的空间，从而使项目的知识负载更为得体合身。

二、教学情境更贴实际

真实项目以真实工作情景为依托，以工作任务引领知识、技能和态度，通过完成典型产品或服务，学习相关知识，获得某工作任务所需要的综合职业能力。真实工作情景是否就是学生需要的情景？是否一定能保证学生广泛而密集的参与？是否一定能保证项目教学的高效？应该说，这种情景更多地指向中职生今后的工作实际，是指向未来的，这对中职生巩固专业思想、理解专业文化、形成专业自觉是有益的，但这种情景很少考虑中职生当下的情绪情感体验，与中职生“急功近利”的短视心理和“活在当下”的处世哲学也不完全合拍，因此，对于一些公共基础类课程不宜过度采用。

例如，在苏教版“计算机应用基础”学习领域二：“广袤无垠的e空间——Internet的利用”的项目2-5“检索网络资料（4课时）”中，作者采用的是使用搜索引擎查找、搜集有关计算机技术发展历史的资料，并据此撰写一篇500～800字的有关计算机发展史的博文，向读者简单介绍计算机技术发展的主要阶段和关键人物。在发展学生技能的同时，让学生了解计算机发展史的相关知识。这种纯知识、技能倾向的项目教学目标，没能有效地关照“情感态度价值观”层面，同时，项目一旦被知识、技能所裹挟，就难以生成具有足够吸引力的、趣味性的教学案例（载体），课堂将陷入“技术层面”难以自拔，学生的学习积极性难以有效释放。

笔者在教学时，进一步优化教学情景：有道是“五岳归来不看山，黄山归来不看岳”，同学们，语文课本上徐迟的《黄山记》你们都学过了吧，你们到过黄山吗？你们想去黄山吗？今天我们就一起去领略一下黄山的“奇松、怪石、云海、温泉”。然后让学生搜索有关黄山的文字、图片、视频，并在同学们的经验介绍中了解、比较、感悟各种下载方式的优劣及各种搜索策略的适用场合，从而实现又快又准的下载和搜索。这种看似虚拟的情景带给学生的却是真切的体验，是从学生的心灵需求出发，紧贴学生的生活实际，教师的教学意图被“隐藏”了，学生在尽情的“网游”中体验着祖国的大好河山，“技”似乎被忽略了，但学生却又是在“技”中论“道”，如此，教学更为开放、更富人文气息和精神情怀。

既然虚拟项目性本“虚拟”，那教学情景的创设也可“随意”，教师可以跳出技术的樊篱，通过与学生的充分协商，达到“此中有深意，欣然已忘形”的理想境界。

三、项目本性更合品性

虚拟项目的本性是虚拟，似乎是“假”的、虚构的、不真实的，它不可能以真实的“产品”为依托。一些公共基础类课程如“计算机应用基础”和一些专业基础类课程，它们的品性是“基础”而非“专业”，难以产生具体的“产品”，难将工作流程作为教学进程。如此，虚拟项目的本性与这些基础课程的品性是完全契合的，这种契合是一种理性的相互依附，更是一种自然生态，这也使虚拟项目成为公共基础类课程和部分专业基础课程的上佳教学载体。

例如“计算机应用基础”项目1-2中的“文件（夹）的操作和管理”，内容繁杂、知识点众多，有重命名、移动、复制、粘贴、共享、属性设置、删除、快捷方式、搜索等，这些Windows的常规操作难以生成一个真实的项目，难以形成相关的“工作（艺）流程”，即便能生成一个真实的项目，能创造出相关的“工作（艺）流程”，也是一种强行植入，会引起“排异反应”。在项目设计时，如果我们遵循真实项目的惯性思维，苦觅“产品”、苦思“工作（艺）流程”，势必“山重水复疑无路”，如果我们把视角投向虚拟项目，势必豁然开朗，迎来“柳暗花明又一村”的项目教学前景。

笔者在教学时设置了一个虚拟项目——“室内寻宝”，整个项目流程包括三个环节：一是寻藏宝图，学生通过这一环节获得藏宝图；二是根据藏宝图来寻宝，学生通过这一环节获得宝物；三是藏宝和互寻，学生通过这一环节获得项目合格证。每一环节都以游戏、闯关为主要形式，将相关的知识负载融入每一关中，学生可以自行选择不同难度系数的游戏进行闯关，在闯关的过程中知识与技能目标悄然实现。这种“润物细无声”的教学更合规律、更趋自然，也更为和谐。这也使传统的“教项目”“学项目”演变成“玩项目”“应用项目”，实现了项目教学的提档升级。为了避免使课堂陷入“技术层面”，笔者设计了“藏宝和互寻”环节，通过自我藏宝和同学互寻，学生在游戏中感悟、提升，形式上是游戏，表面上是寻宝，实质上是知识与技能的深入应用。

虚拟项目既然性本“虚拟”，我们显然应该“随性”而不是“逆性”，在“随性”中实现与“基础”的对接，在“随性”中实现项目教学的持续超越。

四、项目实施更为灵动

虚拟项目也是项目，具备项目的一般特征，即必须要遵循一定的“项目流程”，必须要有一定的“项目成果”来展现。但虚拟项目并不一定恪守项目固有的范式，也不一定恪守项目教学的固有步骤，教学实施更为灵动。这一方面是因为虚拟项目往往与微型项目伴行，往往一个连续的教学周期（1～2课时）就会有“成果”显现，而且期间还伴随着很多的“副产品”，有利于中职生积极心理的累积；另一方面虚拟项目往往与游戏相伴行，项目的实施过程就是学生的游戏、闯关过程，学生的学习积极性、主动性得以有效释放，课堂必将涌动精彩的生成。

例如“计算机应用基础”课程中，作者采用的大多是任务驱动和项目驱动。无论是项目的任务分解，还是学习领域的项目划分，都留下了“驱动”的痕迹。学生是被动的，是被赶着动的，如果每堂课学生都能自动，那中职课堂将是一幅怎样的情景。变任务驱动、项目驱动为游戏自动，这是一种理想的呼唤。在此基础上，让学生自主分层，避免不分层和教师的强行分层，这就需要教师充分挖掘教学资源，对教材进行适度的二次开发，形成以游戏为主要形式的微型项目群。

笔者在“计算机应用基础”课程的教学过程中，针对项目教学目标对原有项目进行微型游戏化改造，并多次在省、市以上公开课中执教，取得了较好的效果。如在学习领域四：精打细算的巧助手——“EXCEL软件的使用”中的项目4-3：“统计零用钱支出数据（4课时）”，根据项目学习目标，对教材的项目资源进行必要的整合，分解为四个小项目：1.测测你的零用钱（EXCEL地址与公式）；2.算算你的零用钱（EXCEL函数）；3.明明白白零用钱（EXCEL图表的建立与使用）；4.合理用好零用钱（EXCEL图表的分析与修改）。通过对零用钱使用情况的现场匿名调查，将产生的数据源作为分析的依据，将每个微型项目的教学流程分为“入门”“进阶”“综合闯关”三个游戏环节，学生在享受快乐游戏的同时收获着“产品”——“项目合格证”。这也使项目的成果不再单一，而是更为丰富，更为过程化。

爱因斯坦曾说过，教育应当使提供的东西，让学生作为一种宝贵的礼物来享受，而不是作为一种艰苦的任务去负担。虚拟项目带给中职生的不仅是宝贵的礼物，更多的是还中职生以个性解放和精神自由。

【参考文献】

[1]马成荣.计算机应用基础[M].江苏教育出版社，2011.

[2]崔志钰.合理用好零花钱[J].江苏教育（职业教育），2011（7/8）：63-66.

[3]崔志钰.微型项目：打造高效计算机专业课堂[J].高职教育研究，2012（1）：17-18.

[4]崔志钰.错位学习：重构中职生学习隐秩序[J].江苏教育（职业教育），2011（3）：32-33.

[5]陈灵.项目教学基本特征的研究——高职“电子商务应用”教学改革与实践[J].职业时空，2012（2）：32-34，37.

[6]戴卫民.基于虚拟项目驱动的人文公共基础课建设思路探讨——以沟通与演讲课程为例[J].中国职业技术教育，2011（2）：77-80.

*本文为江苏省职业教育课程改革第一期重点课题“职教课改视野下中职生错位发展的理论与实践研究”（编号：ZCZ58）和江苏省教育科学“十二五”规划重点自筹课题“错位发展视野下中职基础课程项目多样化的实践研究”（编号：C-b/2011/02/48）的阶段性成果。

楼道文化——构建和谐社区的新载体 第7篇

关键词：楼道文化,和谐社区,新载体

楼道文化作为一种新兴的文化现象, 至今尚无官方和权威的定义。笔者的认识是:楼道文化不是简单的楼道装饰, 而是以特定楼道的居民为活动主体和受体, 以楼道及其周边空间为载体和展示区, 以多种文化形式和丰富内容为活动含量的群众性文化活动和文化空间。这种文化是包括居民思想、才艺、行为的大文化, 它既是个体文化的表达和家庭文化的集聚, 又可以组合成为群体文化、小区文化和社区文化。表现形式有宣传、教育、培训、科普、文化、体育和娱乐等各种活动, 涵盖政治、经济、文化这三大社会支柱的方方面面, 蕴含极其丰富多彩的内涵。

一、楼道文化的时代特征

楼道文化作为和谐文化的组成部分, 是以人为本的新兴和发展的群众文化, 具有和谐核心的文化符号和标志。罗北社区的楼道文化建设也具有以人为本的和谐特征、多元共存的和谐形式和潜移默化的和谐功能, 是提升社区文化、建设和谐社区的新载体。

(一) 以人为本的和谐特征。

文化是人的思想、行为的表达, 也是人类物质、精神生活的总和。所以, 文化具有以人为本的和谐特征, 楼道文化同样也体现这一特征。楼道文化的创作者、参与者、接受者都是同一个对象, 也就是说主体和客体都是社区居民。根据这一特征, 罗北社区在开展楼道文化建设时充分体现了以人为本、群众的事情群众办的理念, 让居民成为楼道文化建设的主角, 改变以往社区活动靠上级布置、社区包办、干部当说客、居民当看客的被动现象。社区组织召开了楼道文化建设献计会, 给居民发放了征求意见表, 发动居民出谋划策, 确定方案。在实施过程中, 就居民动脑动手, 积极参与。朝晖苑的居民就创作了250余件艺术作品, 把楼道妆扮的五彩缤纷, 充满艺术气氛, 为居民提供了展示才艺的平台, 实现了作者和观众的互动, 社区和居民的联动, 使楼道的每一位居民都参与其中, 体现了以人为本的和谐特征。

(二) 多元共存的和谐形式。

社区居民具有多元性, 社区教育和社区文化也具有多元性, 而居民住宅小区的楼道则是这些多元因素的集聚处和发散的, 这就赋予楼道文化建设多元共存的和谐形式。罗北社区的楼道文化建设以美化环境、展示艺术、宣传教育为起点, 在朝晖苑小区的20个楼道试点, 确定以党建工作、文化艺术、社区知识等为主题的10多项内容, 通过书法、美术、摄影、剪纸、花边、刺绣、干花、挂饰等艺术形式和艺术品来展示, 内容包括政治、文化、科普、艺术、生活等。在以上形式和内容中, 党员承诺、温馨提示、专题摄影、儿童画等创意都得到领导的认可和居民的盛赞。楼道文化建设之于社区文化建设不是起点也不是终点, 而是层次的结合点和提升的助推点。随着楼道文化建设的推进, 其形式已由静态发展为动态, 文化空间也不断拓宽, 在实现量的飞跃后, 充实了社区文化的形式和内容。目前, 罗北社区已有市民学校、党员培训网络, 再就业培训、科普宣传长廊健身路等10余种宣教文体载体, 有越剧社、腰鼓队、书法艺术、摄影创作组、老年体协等一支文化队伍, 大大丰富了居民的精神文化生活, 体现了多元文化共存的优势和效果。

(三) 潜移默化的和谐功能。

文化是推动人类社会发展的力量, 和谐文化是构建和谐社会的基础和动力, “社会主义核心价值体系是建设和谐文化的根本”。按以上定义推断, 我们不难发现, 社会文化在构建和谐社区中有着重要的作用和功能, 罗北社区在楼道文化建设的实践和效果也印证这一点。先进、科学、健康的楼道文化具有以下四种功能。一是示范导向功能, 先进的楼道文化紧跟时代步伐, 唱响主旋律, 发挥主流性、示范性的作用, 使居民在富教于乐、潜移默化中接受文化价值、认同文化背景, 倡导正确的世界观、人生观、价值观和行为方式, 二是宣传教育功能:丰富的楼道文化蕴含正确的思想观念、道德伦理、价值取向、精神追求和行为准则, 对居民起到宣传教育作用。如在宣传正确的社会主义荣辱观时, 社区越剧社创作了《八荣八辱要牢记》的文艺节目, 进小区、楼道演出, 收到了良好的教育效果。三是交流沟通功能:互动的楼道文化活动引到居民走出家门、走出封闭, 在交流和互动中畅开心扉, 互相交流, 相互了解, 增进友情, 实现和睦。四是愉悦身心功能:健康的楼道文化不但能丰富居的精神文化生活, 也能倡导健康的生活方式, 使居民在参与文艺、体育活动中充实生活、健身强体。

二、楼道文化的发展构想

楼道文化还很年轻, 有着漫长的成长道路和广阔的发展突间。楼道文化植根于社区这片土地, 每一位群众文化工作者、社区工作者和广大居民都有责任保护它, 促使它健康成长。对此, 笔者就如何发展楼道文化这一命题, 从前瞻性、宽泛性、独特性这三个角度提出若干构想。

(一) 具有前瞻性, 体现战略目光。

要把楼道文化建设提升到战略的高度来认识和重视, 将建设楼道文化列入社区的一把手工程和议事日程。从长远和战略的观点来看, 制订与上级单位和区域性发展战略相适应的文化发展规划。明确楼道文化建设的指导思想、目标任务、工作重点和具体措施。要建设一支指导队伍, 要注重调研, 了解居民的文化需要, 设计楼道文化的载体, 指导群众文化团队的活动。要组织一支活动队伍, 在稳定原有文化队伍的基础上, 根据群众的要求组建新的活动队伍, 使居民的精神文化生活变得更加丰富多彩。

(二) 具有宽泛性, 体现全民理念。

楼道文化建设不但要保证质的提升, 还要保证量的扩容, 做到全面覆盖、全员参与。全面覆盖是指要把楼道文化建设覆盖到全部有条件的小区、楼群和楼道。特别要利用小区整治改造等机会实施楼道文化建设, 让绚丽多彩的文艺之花、文明之花盛开在社区的每一个楼道。全员参与是指动员和引导社区的每一位居民积极投身楼道文化建设。要了解居民的兴趣爱好, 在举办各类活动时组织他们积极参与。特别是在举办楼道文化节、邻居节、文艺晚会、体育健身比赛、电影晚会等大型活动时, 组织尽可能多的居民参与或观看。

(三) 具有独特性, 体现品牌意识。

在开展楼道文化建设的实践进程中, 各社区都积极设计抓手, 创新载体、搭建平台, 创建出许多群众喜闻乐见、效果显而易见的活动形式和内容, 打造了一系列文化精品和活动品牌, 形成了丰富的社区文化资源。深入开展楼道文化建设要做深、做好打造品牌、利用资源这篇文章。既要在共性中提炼个性, 做到一社区一品牌, 在楼道文化建设丰富多彩的形式和内容中选择那些具有自己社区特色的、创新的部分, 加以精心打造, 形成独创的楼道文化品牌。

T-载体的构建 第8篇

关键词：细胞核因子-κB,胰腺癌,基因,聚合酶链反应

细胞核因子κB(nuclear factor κB,NF- κB)属于核转录因子成员,参与炎症、免疫、细胞增殖与凋亡等多种病理生理过程。越来越多的研究证实NF- κB调控了与肿瘤形成相关的众多基因的表达和功能。在乳腺癌[1]、卵巢癌[2]、结肠癌[3]、肝脏肿瘤[4]、前列腺癌[5]等实体瘤的研究中已经发现了NF- κB异常活化,并且NF- κB的持续活化与肿瘤的发生、浸润、转移、耐药等诸多环节密切相关[3]。近来的研究发现胰腺癌细胞NF- κB也出现了异常的活化,并发现NF- κB可能是防治胰腺癌的一个极为关键的信号靶点[6]。胰腺癌预后极差,肿瘤复发与转移是影响预后最主要的问题。胰腺癌手术切除率低,对现有的放化疗明显抵抗,因此迫切需求探索新的治疗措施。近年来出现的靶向基因治疗在肿瘤治疗中已占有重要的战略地位,并成为肿瘤研究的热点。本实验在此前提下设计并构建针对靶基因人NF- κB的miRNA干扰载体,并为以后的进一步研究打下坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

Invitrogen miRNA设计系统;合成的oligos;BLOCK- iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP(表达载体试剂盒);DH5α 感受态细胞;T4 DNA ligase(T4 DNA连接酶),由上海 Invitrogen公司提供。

1.2 方法

根据靶基因设计并合成4对miRNA oligo,oligo序列,见表1。

干扰载体构建:将4对oligo各自退火成双链,然后用载体构建试剂盒BLOCK- iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP(Invitrogen 公司) 进行重组克隆,将4对双链的miRNA oligo各自插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2- GW/EmGFPmiR中,构建4个miRNA质粒,转化入感受态细胞DH5α。退火和连接的具体方法如下。

(1) oligo退火:

将4对合成好的oligo用ddH2O溶解成100μmolL-1,互补单链各取5 μl两两混合,建立表2的体系,将4份oligo混合物在95 ℃加热5 min,然后放置室温自然冷却20 min,形成双链oligo。

寡核苷酸退火体系:100 μmolL-1 top strand oligo5 μl,100 μmolL-1 bottom strand oligo5 μl,10oligo annealing buffer2 μl,ddH2O8 μl,total volume20 μl。

(2) 连接:

将退火的双链oligo继续稀释成10 nmolL-1 浓度,按表3给出体系在室温连接30 min。

酶连接体系5ligation buffer4 μl,pcDNA6.2- GW/EmGFP 2 μl,ds oligo(10 nmolL-1)4 μl,T4 DNA ligase(1 Uμl-1)1 μl,ddH2O9 μl,total volume20 μl。

(3) 转化:将上述连接反应转化DH5α感受态细胞。

-20 ℃下保存的100 mlDH5α感受态细胞置于冰上,完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。加入 5ml pUC19质粒,DNA浓度为10 pgml-1,轻轻混匀。冰上放置30 min,42 ℃水浴热激60 s,冰上放置2 min。 加400 ml LB培养液,37 ℃ 250 rmin-1振荡培养30 min。 室温下4 000 rmin-1离心5 min,用枪头吸掉400 ml上清液,用剩余的培养液将细胞悬浮。将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上,平皿在37 ℃下正向放置1 h,待接种的液体吸收进琼脂后将平皿倒置,培养过夜。

每个转化平板分别挑取4个克隆,用载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。

2 结果

针对靶基因构建的4个干扰质粒分别为:

经过比对,重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致,因此miRNA干扰载体的构建成功。

3 讨论

T-载体的构建 第9篇

1 构筑班级网上的德育平台让网络成为学生生活的家园

网络如同一张不断生长和扩展的大网, 伸向生活的每一个角落。面对网络对职业学校学生思想品德教育带来的挑战, 构筑起了多层次多功能的德育信息平台, 并用这张“德育之网”将学生、家长、班级、社会紧紧凝聚在了一起。

(1) 在“校园网”的栏目中, 将国内外教育的最前沿信息提供给学生;“班级学苑”记录班级德育的点点滴滴, 班级好人好事。以及各种晨会、班会、交流会、表彰会、社会综合实践等活动的惊影, 以陶冶情操, 谈心交流, 以相互沟通, 协商讨论。在空间和心理上主动亲近学生, 多鼓励、多表扬, 多实在的帮助、多真诚的指导, 多一点微笑、多一点期望。对学生来说:这不啻是冬日的阳光、雪天的薪火、炎夏的凉风、黑夜的灯火。做到了这些, 学生就会视班级如生活的家园、学习如生命、老师如亲人、同学如朋友, 就会感到心里热乎、心情舒畅, 自然会自觉地、努力地做好班级各项工作;“德育论坛”让班级学生广开言路, 献计献策, 探索有效开展班级德育的新途径、新方法, 利用班级网络实行人性化管理, 对学生生活体现出一种真切的“人文关怀”。

(2) 专门为家长、社会开辟了“家长班级”这一栏目。“健康小常识”、“心育之窗”让家长们可以掌握更多关于自己孩子的生理、心理知识;“亲子共赏”向学生、家长推荐适宜的好书、名画、名曲;“家庭自测”帮助和引导家长树立正确的家庭教育观;“专家指导”、“学习指导”为提高科学教育子女能力提出了有益建议, 不断利用网络提高家长的自身的素质。

(3) 以“青春年华”为题, 专门为同学们开设了活动版块。“名人聊天室”让同学们可以与教育名家座谈;“心灵聊天室”从理论、实践两方面给同学们展示心理健康的“秘密”;“规矩方圆”、“名篇推荐”让同学们学会更多做人的道理;自主论坛根据自己的兴趣, 选取自己喜欢的版块, 畅所欲言、倾诉心声, 尽享网上冲浪的乐趣。

2 构建学生冲浪学校“绿色网吧”让网络成为学生学习的乐园

现在, 网络对于学生的影响很大, 有许多学生因为过多接触网络而使自己的思想道德变质, 但网络也有积极的一面。全面禁止学生上网不是最佳的处理方法, 学生可以上网, 关键是要引导学生如何文明上网上文明网。平时, 我们就非常注意积累一些有利于青少年成长的网站的网址, 然后在学生上网时把这些网址推荐给学生。利用班会课把学生带到学校“绿色网吧”, 让学生在百度网站的搜索框内输入了这样的关键词“青少年犯罪与网络”, 当学生看到有几十几万的搜索结果时, 都惊呆了, 在他们眼中网络似乎是一颗毒瘤, 不可碰。又让学生看了其中的一些案件, 让学生谈自己的看法, 学生都表示以后上网要注意了。然后语重声长地告诫学生:不要沉迷于网络游戏, 不要上不健康的网站, 要遵守网络道德。这些活动对学生的心灵震撼比较大, 采取“疏”、“堵”结合的方法, 通过在校园网上安装过滤软件, 安排专人对网上信息进行筛选, 进行二次重组, 净化网络环境, 经常性地组织学生冲浪学校“绿色网吧”。在“绿色网吧”里, 同学们还可以浏览自己的军训剪影、欣赏学校艺术节节目、阅读名家作品、观看经典影片, 甚至上传自己的班级网页:向全校同学介绍本班强大的篮球队、同大家探讨神奇的天文之旅等等, 只要你愿意, 就可以把你所了解的丰富多彩、积极向上的内容上传到校园网中, 让更多的同学共同欣赏。有了这样的形式, 许多同学提高了学习的兴趣、拓宽了知识面, 一些性格内向, 不善交往的同学也成为了班级的网页明星, 变得自信而具有吸引力。在这样一片自由的有情有义的绿色天地里, 学生们充分感受到了网络给他们带来的温馨、愉快和满足, 无论是哲学小故事, 还是立志妙语, 都敲打着同学们的心灵, 让他们有所思, 有所悟。到目前为止, 由网络所引起的违纪行为没有了, 以前的爱好打电脑游戏的学生现在也不再玩了。

3 构建班级网络进行心理健康教育让网络成为学生成长的学园

在学生心理健康教育工作中, 由于师生特殊的角色限定, 学生很难向教师敞开心扉, 说出自己的真实想法, 而网络的隐蔽性则有效地弥补了这一不足, 通过角色隐藏, 保护了学生的隐私, 维护了学生的尊严, 使学生少了一分顾虑, 多了一分坦诚, 能够大胆地说出心里话。曾经我班级中有几位单亲家庭和一些外地学生, 他们内向、腼腆、听话, 自尊心很强, 但也很自卑, 学习波动较大。可他们也许只有自己心里才最清楚, 他们并不想这么“自卑”、这么内向, 他们也想像其他同学们一样, 开心的时候自由大笑, 而且能和其他的同学谈心, 交朋友。当网络大潮汹涌而至的时候, 他们中有的选择了上网聊天, 与现实相比, 他们愿意生活在网络世界中, 因为他们觉得只有在网络中他们才能做回真正的自己。对网络的沉迷使他们的学习成绩一落千丈, 精神状态也有所萎靡。发现了他们的这些变化。禁止上网?经验告诉我, 这不是个好方法, 因为粗暴的禁止只会将网络与他们拉得更近。解铃还需系铃人, 既然是网络让他们沉迷, 那么何不让网络使他们变得更加开朗呢?就这样, 在他们经常光顾的聊天室中又多了一个叫做“为自己开一扇窗”的过客。通过一次又一次的聊天, 真的为他们打开了一扇窗户, 透过这扇窗, 家长、同学们看到了更加开朗活泼的他们, 他们也看到了一个更加宽阔的世界, 他们不再自卑了, 学习也有了很大的进步, 他们当然是不知道, 因为他们所记得的只是那个存在于虚拟世界中的代号“为自己开一扇窗”。

通过对学生的有效引导, “让学生会上网, 上好网”, 利用校园网开设专项活动和心理健康教育等吸引学生、激发学生良好的上网动机, 提高了学生对信息时代相关问题的认识, 促进了学生对网络道德规范和行为准则的理解和内化, 也促进了学生的身心积极地向健康成长的方向转化, 网络真正成为职业学校德育工作的有效载体, 取得了理想效果。

摘要：在职业学校班级管理中, 学生管理是学校工作重中之中, 利用网络进行班级管理, 可以解决学生中存在的许多问题, 班级的许多学生管理方法就可以运用在网络上, 让网络成为学生生活的家园、学习的乐园、成长的学园。

T-载体的构建 第10篇

本文采用基因重组技术将黄绿荧光蛋白基因重组到穿梭质粒表达载体上,构建了含黄绿荧光蛋白基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体,为生防枯草芽孢杆菌基因标记以及菌株定殖的研究提供必备的实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本研究所用菌株与质粒见表1。

1.1.2 培养基与培养条件

大肠杆菌用LB培养基(蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母抽提物5g,水1000mL,pH7.0,121℃灭菌20min。),37℃培养震荡培养18h。

1.1.3 试剂

限制性内切酶,T4DNA连接酶,DNA回收试剂盒,化学试剂:自大连宝生物工程公司。

1.1.4 抗生素与溶液

氨苄青霉素(Amp),工作浓度50μg/m L;氯霉素(Cm),工作浓度10μg/m L。

溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0);

溶液Ⅱ:0.2mmol/L Na OH,1%SDS;

溶液Ⅲ:5mmol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5mL,双蒸水28.5mL;

TE:10mmol/L Tris.HCl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0);

RNase溶液:10mg RNase溶于1mL 10mmol/L Tris.HCl(p H7.5),15mmol/L Na Cl中,于100℃加热15min,冷却后保存于-20℃。

1.1.5 仪器

台式高速离心机LG15-W,北京医用离心机厂;电热恒温水浴锅HWS24,上海一恒科技有限公司;电热恒温培养箱WMK-02,南京电器厂;紫外分光光度计LINDA,日本岛津公司;电子分析天平AEL-160,日本岛津公司;凝胶成像系统UVP,英国Cambridge紫外仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒提取

采用碱裂解法[6]从大肠杆菌中提取pEYFP和pH-PS9质粒DNA。

活化含pEYFP和pHPS9质粒DNA的大肠杆菌,用-70℃保存的菌液划线接种于LB加相应抗生素固体平板上,37℃过夜培养;取单菌落转接于5mL LB+Cm(p HPS9)和5mL LB+Amp(pEYFP)液体培养基中,37℃过夜培养;按1%接种量再分别转接于50mL LB加相应抗生素的液体培养基中,37℃过夜培养。次日取50mL菌液,在4℃,4000r/min转数下,离心10min,弃去上清液,用2mL含10mg Lysozyme的溶液Ⅰ溶解菌体,室温放置5min,加入4mL溶液Ⅱ,温和倒置数次使其混合均匀,置于冰上10min,再加入3mL溶液Ⅲ,快速倒置数次于冰上10min,以13000r/min转数离心30min,向上清液中加入0.6倍体积异丙醇,室温放置15min,在12000r/min转速数下离心30min,加入0.5mL TE溶解沉淀,再加入RNA酶10μL,放入37℃水浴中反应1h,加入等体积酚、酚-氯仿、氯仿抽提,用100%乙醇沉淀质粒DNA,用70%冰冷的乙醇洗1次,沉淀干燥后,溶于50μL TE中,置于-20℃冰柜中备用。

1.2.2 双酶切反应[7]

先用Bam HI酶切pEYFP和pHPS9质粒DNA,10μL反应体积中含1～2μg pEYFP或pHPS9质粒DNA,1μL 10B buffer,1～2U Bam HI,加入ddH2O补足体积。将反应管放于30℃水浴中2h后,置于70℃水浴10min,终止酶反应。再用EcoRI酶切,在上述反应液中加入1～2U EcoRI,1μL 10H buffer,加入ddH2O补足体积至20μL,将反应管放于37℃水浴中2h后,置于70℃水浴10min,终止酶反应。用酚-氯仿抽提酶切后的pHPS9质粒DNA,乙醇沉淀,用ddH2O溶解沉淀。酶切后的pEYFP进行1%琼脂糖电泳,回收约714bp的EYFP DNA片段。DNA片段回收采用试剂盒。

1.2.3 连接反应

10μL反应体积中含有1μL 10倍连接缓冲液,2U T4DNA连接酶,适当浓度比的EYFP DNA片段与pHPS9质粒DNA,置于22℃水浴中连接4～6h,终止连接反应。

1.2.4 感受态细胞制作与转化

从平板上挑取E.coli.DH5α单菌落接种于5mLLB培养液中,37℃过夜培养,次日按1%接种量转接于50mLLB培养液中,在37℃水浴摇床中快速震荡培养至OD550=0.5。将培养液置于冰浴中10min之后,在4℃,5000r/min转速下离心5min,收集菌体,将菌体重新悬浮于25mL冰冷的50mmol/L Ca Cl2,10mmol/L Tris.HCl溶液中,冰浴中至少放置20min,在4℃,5000r/min转速下离心5min,将菌体再悬浮于2mL冰冷的50mmol/LCaCl2,10%甘油中,分成100μL体积一份,于4℃放置过夜后,立即放入-70℃冰箱中保存备用。

取100μL冷冻的感受态细胞放入冰浴中融化,加入20μL 50mmol/LCa Cl2,10mmol/L Tris.HCl溶液,再加入40～50ngDNA,混匀后,于冰浴中放置30min,立即放入42℃水浴中热刺激2min,取出后加入100μL LB培养液于37℃水浴中放置1h。取100μL培养液涂布于加有IPTG和X-Gal的LB平板上,然后将LB平板放置于37℃温箱中过夜培养。

1.2.5 阳性重组子筛选与鉴定

随机挑选单菌落,用煮沸法快提质粒DNA,先用1%琼脂糖凝胶电泳初筛DNA分子量大于质粒载体(pHPS9)的重组子DNA,再用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切方法进一步验证重组子。

2 结果与讨论

2.1 质粒DNA浓度与纯度

用LB培养液过夜培养,取50mL菌液离心收集菌体,按方法所述提取质粒DNA,用紫外吸收法测定DNA纯度,琼脂糖电泳法测定DNA分子量大小。50mL菌液可以获得30μg pEYFP DNA和26μg pH-PS9 DNA,经测定,其OD260∶OD280=1.76,琼脂糖凝胶电泳表明DNA分子量与理论值相符。结果见图2。

2.2 表达载体的构建

按照图1构建表达载体。将EYFP基因连接到穿梭质粒表达载体pHPS9多克隆位点区。

2.3 阳性重组子筛选与鉴定

10μL连接液转化100μL感受态细胞,涂2个LB+Cm平板,37℃培养18h。每个平板上均有200多个转化子,随机挑取10个转化子,提取质粒DNA,并用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切下与EYFP基因大小一致的DNA片段,证明该转化子为阳性重组子。结果见图2、3、4。

1:质粒p EYFP DNA;2:质粒p EYFP DNAEcoRⅠ/BamHⅠ双酶切M:λDNA/HindⅢMarker(23130、9461、6556、4361、2322、2027、564)

1-5:质粒p HPS9-EYFP DNAM:λDNA/HindⅢMarker

1:质粒pEYFP EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切2:质粒pHPS9-EYFP EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切

3 结论

利用DNA重组技术,成功地将黄绿荧光蛋白基因(EYFP)重组到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9上,获得了含EYFP基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9-EYFP,从而为生防菌株的基因标记提供了必要的材料。

摘要：质粒pHPS9为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体,本项研究采用基因重组技术将黄绿荧光蛋白基因EYFP重组到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9上,转化到感受态大肠杆菌中,获得含有pHPS9-EYFP质粒的阳性重组子。经双酶切和琼脂糖凝胶电泳验证,成功构建了能在枯草芽孢杆菌中表达的含有EYFP基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体,为生防菌株的基因标记提供了必要的材料。

关键词：黄绿荧光蛋白基因(EYFP),穿梭质粒,表达载体构建

参考文献

[1]姚震声,陈中义,陈志谊.绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究[J].生物工程学报,2003,19(5):551～555.

[2]殷幼平,袁训娥,李强.生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖[J].中国农业科学,2010,43(17):3555～3563.

[3]车建美,刘波,张彦.青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌(ANTI-8098A)的绿色荧光蛋白基因(gfp)转导及其生物学特性的变化[J].农业生物技术学报,2010,18(2):337～345.

[4]王金林,闵军,周晓东.加强型黄绿色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达[J].中山医科大学学报,2002,23(4):254～256.

[5]张淑梅,王玉霞,李晶.基因标记枯草芽孢杆菌BS-68A在黄瓜上定殖[J].生物技术,2006,16(4):73～74.

[6]都艳霞,沙伟,张梅娟.碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证[J].生物技术,2009,19(2)35～37.

T-载体的构建 第11篇

关键词：拟南芥；WRKY；转录因子；基因克隆；植物表达载体

中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1674-0432（2010）-09-0039-2

0 前言

植物转录因子的研究已经成为现今植物基因功能研究的一个重点。植物基因组中有相当的一部分基因是以家族形式出现，并参与因外界环境变化所导致的植物体内分子信号传递， 或诱导基因转录调控过程。在研究众多的转录因子中，WRKY转录因子是近年来研究较为广泛的植物特有的转录因子。该家族的cDNA最初从甜马铃薯、野燕麦、欧芹和拟南芥中克隆获得。这类转录因子名称来源于其蛋白含有高度保守的60 个氨基酸组成的WRKY结构域。WRKY蛋白可与含有(T)TGACC(A/T)(W盒，W-box)核心序列的DNA特异结合，并被证明能与自身启动子中的W盒结合来参与表达调控。在拟南芥中，WRKY家族共有74个成员，主要与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关。水稻中有100余个成员，主要分布在1号和5号染色体上。病原菌、伤害和植物激素类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达。WRKY类转录因子被证实除参与植物的抗病反应外，还影响植物的衰老、抗胁迫能力以及生长和发育。

本研究以丁香假单孢菌处理的拟南芥为植物材料，通过RT-PCR 技术，获得了拟南芥的WRKY35 基因cDNA序列，对其进行测序和分析，并将此基因构建到植物表达载体pBI121上，为提高植物的抗病性奠定了基础。

1 材料和方法

1. 1 试验材料

1.1.1 材料 本试验所用植物材料为哥伦比亚型拟南芥，由本实验室保存。基因克隆所用大肠杆菌(E.coli)菌株为DH5α，由本实验室保存。克隆载体pEASY-T1、植物稳定表达载体pBI121由四川大学惠赠。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、AMV反转录试剂盒、等均购自TaKaRa公司。Trizol RNA提取液、U2NIQ210 柱式质粒抽提试剂盒等购自上海生工生物工程公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 将拟南芥的种子进行表面消毒后，播种于MS固体培养基上，待长出2-3片真叶时，用0.5mM的水杨酸处理1h后取整个植株提RNA，-70℃保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成

根据网址www.arabidopsis.org公布的WRKY35基因的cDNA序列设计合适的引物WRKY35(1-1)sense、WRKY35（1-1）antisense，目的基因扩增出来后连接到克隆载体pEASY-T1上，然后在上下游引物分别添加Xba I和SacI酶切位点WRKY35(2-1)sense、WRKY35（2-1）antisense，引物由上海华大基因有限公司合成，序列如下：

WRKY35(1-1)sense:5-3:ATGGACAACTTCCAAGGA

WRKY35（1-1）antisense:5-3CAAAGGCAAATACCGTCA

WRKY35(2-1)sense:5-3:GCTCTAGAGCATGGACAACTTCCAAGGA

WRKY35（2-1）Antisense:5-3 CCGAGCTCGGCAAAGGCAAATACCGTCA

1.2.3 目的基因的扩增与克隆 以反转录产物cDNA为模板，WRKY35(1-1) sense和WRKY35(1-1) Antisense为引物，进行PCR扩增。PCR反应按以下体系进行，PCR反應条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸120s，32个循环；72℃后延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳分离后回收纯化，回收片段连接到pEASY-T1，并转化到感受态大肠杆菌DH5α中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，PCR鉴定出的阳性克隆送上海华大基因有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析 相似性比较及开放阅读框(ORF)分析用生物分析软件DNA MAN完成。

1.2.5 植物表达载体的构建 采用UNIQ210柱式质粒抽提试剂盒提取重组质粒DNA。然后以重组质粒DNA为模板以引物WRKY35(2-1)sense、WRKY35（2-1）antisense进行PCR扩增，扩增产物及植物表达载体pBI121分别经Xba I和SacI双酶切，回收目的片段和PBI121，用T4 DNA Ligase进行连接，连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选。挑取阳性菌落进行培养，提取质粒，采用双酶切和PCR 扩增法进行鉴定，阳性质粒命名为pBI-WRKY35，PCR鉴定出的阳性克隆再次送上海华大基因有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 WRKY35基因的克隆及序列分析

以拟南芥cDNA为模板，用所设计的特异引物扩增出约1300bp 的条带(图1)，将PCR 产物回收并进行连接克隆载体pEASY-T1然后转化到感受态大肠杆菌DH5α中。随机挑取10个菌落进行PCR扩增，均扩增出一条1300bp左右的条带(图2)。阳性克隆的测序结果表明，该片段长1362bp。开放阅读框(ORF)用生物分析软件DNA MAN 进行分析发现，该片段包含一个完整的编码序列(1-1314)，编码438个氨基酸，核酸的相似性比较用生物分析软件DNA MAN分析发现与网址www.arabidopsis.org公布的WRKY35基因的cDNA序列同源性达100%。

2.2 拟南芥WRKY35基因植物表达载体的构建与鉴定

用带有Xba I和Sac I酶切位点的引物WRKY35(2-1)sense、WRKY35（2-1）antisense以pEASY-T1质粒为模板做PCR扩增，回收扩增产物，并用Xba I和Sac I酶切PCR产物和载体pBI121，回收片段用T4 DNA Ligase连接，构建成重组质粒pBI-WRKY35。首先利用目的片段引物对该重组质粒进行了PCR扩增验证，得到一条长约1300bp片段(图3)。对该阳性菌测序，测序结果表明该序列与网址www.arabidopsis.org公布的WRKY35基因的cDNA序列同源性达100%，说明该植物表达载体构建正确。

3 讨论

研究表明，已克隆的WRKY转录因子二级结构均具有典型的转录调控因子结构的特点，即：N末端富含碱性氨基酸，属于核定位信号区；C末端富含酸性氨基酸，功能是作为转录激活区；中间是由60 个左右的氨基酸残基组成的WRKY结构域。

目前已克隆的WRKY转录因子基因大部分受病原菌、水杨酸、茉莉酸的诱导，但是也有例外，如WRKY23受高温诱导，WRKY25受高盐诱导。本试验以丁香假单孢菌处理的拟南芥为材料，获得了拟南芥WRKY35基因的cDNA编码序列，说明该基因受病原菌诱导，但其特异表达模式尚需进一步验证。该基因是否受其他逆境如盐分、低温的诱导，还有待于进一步研究。为进一步研究拟南芥WRKY35基因的功能及作用方式，本试验成功构建了该基因的植物表达载体pBI-WRKY35，目前该基因的转化工作正在进行。

参考文献

[1] Ishiguro S，Nakamura K.Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein，SPF1，that recognizes SP8 sequences in the 5? upstream regions of genes coding for sporamin and β-amylase from sweet potato. Mol Gen Genet，1994，244(6): 563-571.

[2] Rushton P J，Macdonald H，Huttly A K，et al.Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of a-Amy2 genes. Plant Mol Bio，1995，29(4):691-702.

[3] Rushton P J，Torres J T，Parniske M，et al.Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes.EMBO J，1996，15(20):5690-5700.