重组新城疫病毒

重组新城疫病毒（精选10篇）

重组新城疫病毒 第1篇

1 材料

1.1 细胞和病毒

稳定表达T7聚合酶的BSR-7细胞系,由Karlklausconzelmann博士惠赠,培养基为含10%胎牛血清及1μg/mLG 418的DMEM;新城疫病毒LaSota疫苗株,由哈尔滨兽医研究所人畜共患病实验室保存,接种9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔扩增后-70℃冻存,备用;H 9N 2禽流感病毒001、002、003、004分离株,由哈尔滨兽医研究所流感参考实验室提供;鸡抗新城疫病毒高免血清,由哈尔滨兽医研究所人畜共患病实验室制备。

1.2 试剂和仪器

Taq酶、T4DNA连接酶及其他限制性内切酶,均购自宝生物工程(大连)有限公司;磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphateTransfectionKit)、Trizol以及反转录试剂盒,购自Invitrogen公司;荧光显微镜为LeicaDM IRB,购自Leica公司。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

H 9N 2病毒HA基因调取序列引物H 9-up和H 9-low(由哈尔滨兽医研究所流感参考实验室提供),根据H 9N 2HA基因序列分析结果设计合成1对引物:上游引物H 9HA-PF 5′-GACTGTTTAAAC TTAGAAAAAA T ACGGGTAGAA CCAGTTGTGCCACCATGGAAACAGTAT CACTAATAAC-3′;下游引物H 9HA-PR 5′-GCGCGTTTAAACTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3′(黑体字母表示酶切位点,加框字母表示基因起始信号和结束信号,斜体字母表示Kozak序列,下划线字母表示病毒特异序列)。以引物H 9HA-PF和H 9HA-PR进行PCR反应,在HA基因ORF的5′端引入PmeⅠ限制酶识别序列和新城疫病毒自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAGAAAAAA)及转录起始序列GS(ACGGGTAGAA),在HA的ORF的3′端引入PmeⅠ限制酶识别序列,并确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数,扩增出HA片段预期长度为1 750bp。

2.2 HA基因序列的调取与序列分析

取H 9亚型禽流感病毒接种SPF鸡胚收取的病毒尿囊液250μL,利用TrizolRNA提取试剂提取病毒基因组RNA,以随机引物产生病毒基因的cDNA。以H 9-up和H 9-low为引物在Pfu高保真DNA聚合酶的作用下进行PCR反应。

PCR产物经琼脂糖凝胶回收、纯化,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序后选取1株病毒HA基因平端克隆到pBlueScript载体的EcoRⅤ位点,克隆产物为pBS-H 9HA。

2.3 表达HA基因重组基因组全长cDNA的构建

以pBS-H 9HA为模板、H 9HA-PF和H 9HA-PR为上、下游引物进行PCR扩增,在HA基因两端引入PmeⅠ酶切位点,再连入pBlueScript载体的EcoRⅤ位点,克隆质粒经PmeⅠ处理,回收HA片段,并与同样经PmeⅠ酶切的pBRN-FL-PmeⅠ[1]连接,构建表达HA基因重组基因组全长cDNA克隆。

2.4 病毒的拯救及扩增

取BSR-7细胞接种于35mm 6孔细胞培养板内,当细胞生长达50%～80%单层时,转录质粒及辅助质粒pBRN-FL-H 9HA、pBSNP、pBSP和pBSL分别以5μg、2.5μg、1.25μg、1.25μg共转染BSR-7细胞(采用CaPO4转染试剂盒,操作按试剂盒说明书进行);转染8～12h后弃去转染混合物,用含10%DMSO的PBS液休克细胞2.5min,加入完全DMEM过夜孵育,第2天换成无血清培养基,并加入TPCK(1μg/mL)继续孵育2～3d后收获培养物上清液,用0.22μm孔径滤器过滤后接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔;接种后的SPF鸡胚继续培养3～5d,取鸡胚尿囊液50μL按常规方法进行新城疫病毒的血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验;收获HA试验及HI试验结果阳性的尿囊液,-70℃冻存,并按常规方法分别于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种进行传代,并进行EID50及鸡胚生长动力学的测定。

2.5 HA表达检测

拯救病毒用9～10日龄SPF鸡胚传代,收获病毒尿囊液,分别取50μLDMEM 110-4稀释的病毒液接种生长于24孔细胞培养板的BSR-7细胞,37℃孵育1h;然后用DMEM洗涤3遍,加入完全DMEM继续培养,24h后以3%多聚甲醛固定细胞,以H 9N 2高免鸡血清为一抗、FITC标记抗鸡荧光抗体为二抗进行间接免疫荧光检测,荧光显微镜下观察HA蛋白在感染细胞中的表达结果。

3 结果

3.1 HA基因的调取结果

4株H 9N 2禽流感病毒RT-PCR结果见图1虽然有非特异性条带出现,但仍以HA基因预期大小的片段为主。

1.H 9N 2禽流感病毒001分离株;2.H 9N 2禽流感病毒002分离株;3.H 9N 2禽流感病毒003分离株;4.H 9N 2禽流感病毒004分离株;M.DL2 000Marker。

回收PCR产物并进行测序。序列分析结果表明,4株病毒实际为2个克隆株,H 9N 2禽流感病毒001、003分离株的核苷酸同源性为100%,002、004分离株的核苷酸同源性为99%,而001、002分离株之间的核苷酸同源性为94%。根据测序结果选取001片段为模板,经PCR扩增后连入EcoR V处理的pBlueScript,转化后质粒的电泳结果见图2。

1～9.连接H 9N 2HA基因的pBlueScript;pBS.pBlueScript空质粒。

3.2 HA基因重组新城疫病毒全基因组的构建结果

以pBS-H 9HA为模板,以H 9HA-PF、H 9HA-PR为上、下游引物进行PCR扩增,回收的DNA片段连入pBlueScript载体的EcoRⅤ位点,命名为pBS-PmeⅠ-H 9HA,克隆质粒经StuⅠ和SpeⅠ酶切产生约750bp的条带,经PmeⅠ酶切可以得到1 750bp的条带,结果见图3。

1～4.StuⅠ/SpeⅠ酶切产物;5.质粒对照;M.DL2 000Marker;6～9.PmeⅠ酶切产物。

克隆质粒经PmeⅠ处理,回收HA片段,并与同样经PmeⅠ酶切的pBRN-FL-PmeⅠ连接,将表达HA基因重组基因组全长cDNA克隆质粒命名为pBRN-FL-H 9HA,质粒经XbaⅠ酶切获得3 508bp/4 347bp/12 514bp的片段,经BglⅡ酶切获得520bp/941bp/6 786bp/12 122bp的片段,见图4。电泳结果证明获得了阳性克隆质粒。

3.3 HA基因重组新城疫病毒的拯救结果

表达H 9HA基因的新城疫病毒全基因组克隆转染细胞,取上清液接种于鸡胚后收获鸡胚尿囊液,血凝(HA)试验结果呈阳性,不同鸡胚的HA效价介于911新城疫病毒免疫血清血凝抑制试验分析同样呈现阳性结果。收获病毒阳性尿囊液作为拯救病毒rNDV的F1代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示,F1代拯救病毒基因组cDNA与用于转染的重组cDNA克隆序列完全一致,和预期相符。结果表明,通过反向遗传操作技术,利用新城疫病毒LaSota疫苗株基因组cDNA克隆成功地拯救具有感染性的重组子代病毒rL-H 9HA。

1～6.XbaⅠ酶切产物;M 1.T14Marker;M 2.λ/HindⅢ;M 3.DL2 000Marker;7～12.BglⅡ酶切产物。

3.4 rL-H 9HA外源基因的表达结果

新城疫病毒LaSota疫苗株能一过性地感染体外培养的哺乳动物细胞。重组病毒rL-H 9HA鸡胚尿囊液接种24孔细胞培养板培养BSR-T7细胞,24h后间接免疫荧光(A组、D组以抗新城疫病毒血清为一抗,B组、E组以抗H 9N 2禽流感病毒为一抗,C组、F组以SPF鸡阴性血清为一抗)检测结果见图5。根据镜下表达强阳性绿色荧光蛋白的细胞数量确定H 9HA蛋白在拯救病毒内获得了正常表达。

A～C.rLaSota感染组;D～F.rL-H 9HA感染组。

3讨论

笔者选择免疫效果良好的1株新城疫病毒La Sota弱毒疫苗作为构建重组新城疫病毒活载体疫苗的亲本株表达H 9N 2HA基因,以期进一步评估重组活载体疫苗的免疫保护效果。结果表明:重组新城疫病毒复制能力强、生长滴度高。由此可见rLaSota是非常具有应用前景的活病毒疫苗载体系统。

参考文献

新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达 第2篇

新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达

目的:高水平表达新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)标准强毒F48E8株的.F基因和HN基因.方法:利用PCR方法扩增出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)标准强毒F48E8株的去掉N端信号肽和C端跨膜区的F基因和HN基因并将其克隆到原核表达载pET30a上,得到重组质粒rpET30a-NDV/F和rpET30a-NDV/HN,转化到受体菌Rosetta-gamiTM2感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测.结果:表达的F蛋白大小约为40kD,HN蛋白大小约为51kD左右,符合预期结果.Western blot分析表明,能与抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应.结论:重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达.说明了去除F和HN基因N端信号肽和C端跨膜区的必要性.

作 者：冉旭华 闻晓波 赵喜红 刘长凤 RAN Xu-hua WEN Xiao-bo ZHAO Xi-hong LIU Chang-feng 作者单位：黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆,163319刊 名：生物技术 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：18(3)分类号：Q786关键词：新城疫病毒(NDV) F蛋白 HN蛋白 原核表达

重组新城疫病毒 第3篇

关键词：新城疫病毒;基因Ⅵ型;鸽;致病性;鸡源

中图分类号： S855.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0208-03

收稿日期：2014-05-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：31440083）;江苏省科技支撑计划（编号：BE2012366）;江苏农牧科技职业学院科研项目（编号：YB201006）。

作者简介：胡新岗（1974—），男，安徽宿州人，硕士，副教授，从事动物医学专业的教学、科研及高职教育管理研究。Tel：（0523）86158089;E-mail：gxh008@qq.com。

通信作者：吴 双，博士，副教授，研究方向为动物传染病防控与流行病学。E-mail：jswushuang@sina.cn。

新城疫（Newcastle disease，ND）是一种急性、高度传染性疾病，已知能自然或人工感染新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的鸟类超过了250种，现在已经被国际兽疫局（OIE）列为法定应报告的传染病[1]。鸽子是介于家养和野生中间状态的禽类，在新城疫传播中起到重要的桥梁作用，而鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副黏病毒（pigeon paramyxovirus type 1，PPMV-1）引起的一种高度接触性传染病，是严重危害养鸽业的主要疫病之一[2]。大多数学者认为，PPMV-1是鸡NDV的一种变异株[3]，该病毒首次于1981年在鸽体内被分离到，其中基因Ⅵ型NDV被认为是引起20世纪80年代初期新城疫第3次大流行的主要毒株，并在世界范围内陆续在鸽系野禽中流行[4]。

诸多分子流行病学研究表明，基因Ⅵ型NDV主要在鸽群中分离到，并且鸽群中分离到的NDV主要是基因Ⅵb亚型，与当前世界上流行的优势基因Ⅶd亚型并不一致[5-6];此外，对鸡而言，鸽体内分离的强毒NDV一般被认为是中等毒力病毒，这在一定程度上表明基因Ⅵb亚型NDV对其他家禽的传播能力相对有限[7-8]。因此可以认为，基因Ⅵb亚型NDV非常特殊、生物学意义重大，但是目前对基因Ⅵb亚型病毒的研究开展得还不够深入，多局限于基因组序列测定、分析和主要蛋白的表达等层面。本试验研究鸽源、鸡源基因Ⅵ型NDV对鸽的致病性，并分析鸽感染2种病毒后的临床诊断症状、病理变化、排毒规律等差异，以期了解它们在病毒携带和传播中的作用，对于基因Ⅵ型NDV的研究和控制具有一定的现实指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株 基因Ⅵb亚型鸡源NDV ZJ3、基因Ⅵb亚型鸽源NDV WX-10-07-Pi均由农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、纯化和保存。ZJ3、WX-10-07-Pi均为对鸡中等毒力毒株，鸡胚半数致死量ELD50（0.1 mL接种剂量）毒价分别为108.50、108.14。

1.1.2 鸡胚及试验动物 非免疫鸡胚购自扬州市某非免疫鸡场，自行孵化到所需日龄。2月龄非免疫美国白羽王鸽，购自江苏省江都市飞亚肉鸽养殖基地。经测定，试验前所有试验动物体内均无NDV和禽流感病毒抗体。

1.1.3 运输液 运输液的配制是根据OIE推荐的配方[9]并稍作调整：用pH值为7.2的磷酸缓冲盐（PBS）溶液配制运输液，溶液中各种抗生素的剂量分别为青霉素10 000 U/mL，链霉素 10 mg/mL，庆大霉素250 μg/mL，卡那霉素250 μg/mL;最后用10mol/L浓度的NaOH溶液调节pH值，使运输液的pH值为7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 分组设计 将20羽2月龄的美国白羽王鸽分成2组，每组10羽，另取5羽作为阴性对照组隔离饲养，专人负责。试验组鸽每羽滴鼻、点眼接种含1×106个ELD50病毒尿囊液。阴性对照组鸽接种同剂量的PBS。

1.2.2 临诊症状 接种后每天早晚定时观察2次，持续观察30 d，记录试验鸽的临床症状及发病死亡情况。

1.2.3 喉头和泄殖腔排毒检测 接种后每天定时采集泄殖腔棉拭子及喉头棉拭子，将棉拭子放入四抗PBS中，保存于-20 ℃。每份棉拭子接种3枚9～11日龄非免疫鸡胚，每 12 h 观察1次鸡胚，观察120 h。弃去24 h内死亡的鸡胚，将24 h以后死亡及120 h以后未死亡的鸡胚置4 ℃冰箱过夜后收集尿囊液，测定其血凝价。

1.2.4 病理切片 分别于接种后4、7、14 d，每组随机取2羽鸽子（对照组取1羽），进行病理解剖，记录剖解变化情况。采集气管、肾脏、脾脏、肺脏、肝脏、胰腺、回肠、十二指肠、胸腺9种组织，用10%福尔马林固定，按常规制作石蜡组织切片，苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察病理组织学变化。

2 结果与分析

2.1 臨诊症状

病毒接种后3 d，WX-10-07-Pi、ZJ3感染组仅表现出轻微的精神状态不佳。WX-10-07-Pi组于接种后4 d粪便呈现墨绿色;接种后6 d精神不振、食欲减退，大部分病鸽表现出翅膀悬垂或向两侧分开，两脚麻痹、不能站立;接种后10 d出现眼睑发炎、呼吸困难、咳嗽;在观察期后期，出现轻微的震颤神经症状。ZJ3组在感染后7 d粪便呈水样稀粪;接种后9 d粪便呈墨绿色黏性稀粪;接种后12 d眼睑发炎、眼睛半睁半闭，呼吸困难，出现神经症状;接种后15 d左右，出现典型的神经症状，呈“观星姿势”;接种后20 d起神经症状有所缓解。在1个月的试验期内，试验组鸽发病率为100%，WX-10-07-Pi、ZJ3组均未见死亡，所有耐过的病鸽精神尚好，但明显消瘦;阴性对照组鸽无异常表现。

nlc202309040057

2.2 病理解剖学变化

WX-10-07-Pi感染组在接种后5 d脾脏轻微肿大，肝边缘有出血点，气管环轻微出血;鸡接种后11 d气管环严重出血。ZJ3感染组鸽在接种后3 d脾脏肿大，表面有针尖至粟粒大的灰白色的坏死结节或伴有出血点，肝脏稍肿;接种后 4 d 胰腺萎缩，肝脏边缘、表面及心叶有出血点和出血纹，气管充血、出血;接种后6 d肝脏呈土黄色。

2.3 泄殖腔和喉头排毒检测

每个泄殖腔棉拭子接种3枚9～11日龄非免疫鸡胚。结果发现，ZJ3感染组的泄殖腔棉拭子中没有检测到病毒，而WX-10-07-Pi感染组的泄殖腔棉拭子中病毒分离率较高，结果见表1。由结果还可见，ZJ3组在接种后的1～4 d能检测到喉头间断性排毒，WX-10-07-Pi组在接种后1至 5 d 检测到喉头持续排毒。

表1 病毒 WX-10-07-Pi感染后3～17 d泄殖腔棉拭子分离病毒结果

接种时间（d） 阳性鸽数（羽） 幸存鸽数（羽）

4 0 10

5 5 8

6 4 8

7 3 8

8 4 6

9 5 6

10 4 6

11 4 6

12 5 6

13 2 6

14 1 6

15 2 4

16 0 4

17 0 4

注：由于ZJ3感染組的泄殖腔棉拭子中未检测出病毒，因此未在表中列出。

2.4 病理组织学变化

接种后，WX-10-07-Pi组鸽的脾脏、肺脏、十二指肠发生了明显的病理组织学变化，ZJ3组的组织学病变主要为脾动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数量减少、十二指肠绒毛黏膜层及固有层局部坏死脱落;对照鸽未见异常变化。具体组织病变详见图1至图6，图7至图9为对照组肺、十二指肠、脾脏组织切片。

3 结论

不同宿主源基因Ⅵb亚型NDV同时感染鸽的试验研究数据目前还比较缺乏，在本试验中，用鸡源毒株ZJ3、鸽源毒株WX-10-07-Pi分别感染美国白羽王鸽，均未引起感染鸽的死亡;ZJ3感染组出现疾病症状比WX-10-07-Pi感染组晚，但是临床症状比WX-10-07-Pi严重许多，尤其是相关的神经症状更为明显，试验结果与相关文献报道鸡源强毒

NDV感染鸽未表现出任何临床症状不一致[10]。大体病变结果表明，肝脏和脾脏是最先观察到的病变部位，随着病程发展，更多的脏器出现病变，但其出现比例和严重程度都不算很高。大体病变最明显的区别是ZJ3感染组中肝脏呈现土黄色的病例较多，有个别病鸽虽然临床诊断症状相当严重，但大体病变却并不显著，与文献报道的一致[11]。

尽管2株病毒对鸽的致病性相当，但是ZJ3感染组泄殖腔却没有检测到排毒，WX-10-07-Pi感染组的泄殖腔棉拭子中病毒分离率较高;喉头排毒检测结果表明，鸽源毒株WX-10-07-Pi带毒时间长且排毒率明显高于ZJ3感染组。这在一定程度上表明，鸽源NDV更容易在鸽群中传播。此外，病鸽多种组织器官出现明显的组织损伤，主要见于消化系统和免疫系统，但是出现病变的比例和严重程度都不高。WX-10-07-Pi组的肺脏发生组织学病变，而ZJ3组的肺脏正常，在一定程度上说明WX-10-07-Pi对鸽的呼吸道亲嗜性较强。

从临床症状、泄殖腔的排毒时间以及泄殖腔的病毒检出率可以部分看出，同为基因Ⅵb亚型，鸽源NDV比鸡源NDV更易在鸽群中传播。这些结果一定程度上验证了目前在我国，Ⅵb亚型是鸽群中所特有的基因型，且鸽源分离株绝大多数属于该亚型的结论。

参考文献：

[1]Alexander D J. Newcastle disease[M]//Saif Y M，Barnes H J，Glisson J R，et al. Diseases of poultry. 11th ed. Ames：Iowa State University Press，2003：64-87.

[2]Alexander D J. Newcastle disease and other Paramyxoviridae infections[M]//Calnek B W，Barnes H J，Beard C W，et al. Diseases of poultry. Ames：Iowa State University Press，1997：541-569.

[3]Alexander D J，Russell P H，Parsons G，et al. Antigenic and biological characterization of paramyxovirus type Ⅰ isolates from pigeons—an international collaborative study[J]. Avian Pathol，1985，14（3）：365-376.

[4]Kaleta E F，Alexander D J，Russell P H. The first isolation of the avian PMV-1 virus responsible for the current panzootic in pigeons ？[J]. Avian Pathology，1985，14（4）：553-557.

[5]Liu X F，Wan H Q，Ni X X，et al. Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985—2001[J]. Archives of Virology，2003，148（7）：387-1403.

重组新城疫病毒 第4篇

1 材料

鸡用重组冻干型干扰素、毒株、鸡胚, 市购;新城疫病毒F48E10 (新城疫强毒株) , 由山东绿都生物科技有限公司提供;1日龄SPF鸡胚, 由济南斯帕法斯家禽有限公司提供。

2 方法

2.1 新城疫病毒F48E10的复苏及血凝效价、ELD50的测定

将冻干保存的新城疫病毒F48E10在无菌条件下用生理盐水稀释100倍, 接种10日龄SPF鸡胚10枚, 0.2 m L/枚, 弃去24 h内死亡鸡胚, 收获24~60 h死亡鸡胚的尿囊液, 经无菌检验及血凝效价检测合格后冷冻保存, 备用。

取96孔细胞培养板, 在第1~11孔分别加入25μL PBS, 第1孔再加入收集的病毒尿囊液25μL, 依次倍比稀释, 第10孔吸出25μL弃去, 1~11孔分别加入红细胞悬液25μL, 振荡, 20 min后观察结果。

将收获的鸡胚尿囊液做110-5~110-10的倍比稀释, 每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚, 每枚鸡胚于尿囊腔接种0.1 m L, 共30枚鸡胚。接种后弃去24 h内死亡鸡胚, 记录接种后24~72 h内死亡鸡胚的情况。采用Reed-Muench法计算病毒的ELD50, 计算公式:lg ELD50=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数。

2.2 鸡用重组冻干型干扰素的稀释及接种分组

精密称定鸡用重组冻干型干扰素0.256 g, 加生理盐水溶解定容至10 m L, 使其浓度为25.6 mg/m L, 依次倍比稀释至12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 mg/m L。鸡用重组冻干型干扰素的稀释及接种分组情况见表1。

2.3 鸡用重组冻干型干扰素的体外抗病毒试验

将9日龄鸡胚随机分为8组, 分别为第1组、第2组、第3组、第4组、第5组、第6组、第7组和第8组, 第1~7组经尿囊腔接种, 接种浓度和剂量见表1, 每组接种10枚, 作用24 h, 建立抗病毒状态;第8组为生理盐水对照组, 经尿囊腔接种生理盐水, 0.1 m L/枚, 接种10枚。

24 h后对已建立的抗病毒状态的鸡胚接种新城疫病毒F48E10, 0.1 m L/枚[110-6.5稀释度 (100倍ELD50) ], 逐日观察鸡胚死亡情况。

3 结果与分析

3.1 新城疫病毒F48E10的复苏

鸡胚在36~48 h内全部死亡, 收集死亡鸡胚尿囊液后, 分装至2个青霉素小瓶内, 分别用于测定血凝效价和ELD50。

3.2 新城疫病毒F48E10血凝效价的测定结果

经测定, 红细胞凝集至第8孔, 即复苏病毒液的血凝效价为28。

3.3 ELD50的测定结果

24 h内未见鸡胚死亡, 48小时时仍未见鸡胚死亡;在48~72 h之间, 110-7稀释度组5枚鸡胚全部死亡, 110-8稀释度组死亡4枚鸡胚, 110-9稀释度组死亡1枚鸡胚, 各组鸡胚死亡情况见表2。

按照Reed-Muench法计算病毒的ELD50, 结果lg ELD50=-8.5, 表示该病毒液做110-8.5稀释后, 每枚鸡胚接种0.1 m L, 可以使50%的鸡胚发生死亡。即本试验测得的ELD50为10-8.5/0.1 m L。

3.4 鸡用重组冻干型干扰素的抗病毒效果 (结果见表3)

枚

由表3可知:攻毒后60小时, 第8组10枚鸡胚全部死亡;第1组死亡2枚, 保护率为80%;第2组, 死亡1枚, 保护率为90%;第3组, 死亡2枚, 保护率为80%;第4组, 死亡3枚, 存活率为70%;第5组, 死亡5枚, 存活率为50%;第6组, 死亡6枚, 存活率为40%;第7组, 死亡8枚, 存活率为20%。攻毒后72小时, 鸡胚均死亡, 没有发现鸡用重组冻干型干扰素具有延迟新城疫病毒增殖时间的作用。说明鸡用重组冻干型干扰素剂量达到1.28 mg/枚以上时, 其对新城疫病毒F48E10鸡胚具有90%的保护率, 接种剂量超过或低于1.28 mg/枚时保护率均有所降低, 说明鸡用重组冻干型干扰素含量的高低和鸡胚的保护率呈正相关关系。

4 讨论

干扰素是一类具有广泛生物学活性的蛋白质, 具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用, 是机体防御系统的重要组成部分[8]。近年来, 关于采用鸡胚法对干扰素进行新城疫抑制效果研究的报道较多。2006年, 韦琴[9]用鸡α干扰素对10日龄SPF鸡胚进行试验, 攻毒后72小时对照组鸡胚全部死亡, 其中未经纯化的包涵体蛋白0.08 mg/枚组和0.16 mg/枚组存活率为50%, 无论剂量多少存活率均降低。易林[10]研究了鸡α干扰素新城疫病毒F48E9对10日龄鸡胚的感染保护情况, 结果发现, 接种干扰素的鸡胚平均死亡时间都比阳性对照组晚, 同时接种干扰素和100倍EID50新城疫病毒液组和先接种100倍EID50新城疫病毒液、30 h后接种干扰素组的平均死亡时间不同, 同时接种干扰素和病毒液的鸡胚死亡时间比先接种病毒后接种干扰素的存活时间要长一些;接种干扰素后能延长感染鸡胚的死亡时间, 且干扰素接种的时间不同, 死亡时间也不同。

在本试验中, 以鸡用重组冻干型干扰素接种9日龄SPF鸡胚, 作用24 h后, 使10日龄鸡胚建立免疫状态, 再以新城疫病毒F48E10感染。鸡胚试验结果显示, 重组冻干型干扰素浓度在一定范围内具有很好的抗新城疫病毒F48E10的效果, 抗病毒活性随着干扰素含量的增加而升高, 每枚鸡胚接种1.28 mg, 保护率能达到90%, 当接种剂量超过1.28 mg时, 对鸡胚的保护率下降, 说明重组冻干型干扰素对鸡胚的存活率也有一定影响。

参考文献

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重组新城疫病毒 第5篇

为了探索新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)基因对人肺癌细胞SPC-A1的`作用及机制,将含有HN基因的重组质粒pVHN经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,通过MTT方法检测细胞活力;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色分析肿瘤细胞凋亡;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(△ψm)和活性氧水平变化;流式细胞仪分析MHC-Ⅰ分子表达;底物染色反应检测caspase-3活性.结果重组质粒pVHN转染人肺癌细胞SPC-A1 48 h后,细胞活力明显降低;AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化;与空质粒对照相比,线粒体△ψm下降(P<0.01),活性氧水平升高(P<0.05);细胞表面MHC-I分子表达上调(P>0.05);caspase-3活性增强(P<0.01).以上结果提示,新城疫病毒HN基因能够上调SPC-A1细胞表面MHC-Ⅰ分子表达,并通过上调ROS水平,下调线粒体△ψm,进而激活caspase-3,最终诱导人肺癌细胞凋亡.

作 者：连海 金宁一 李霄 陈立刚 张静敏 管国芳 孙丽丽 李雪梅 郑洪玲 崔英姬 LIAN Hai JIN Ning-Yi LI Xiao CHEN Li-Gang ZHANG Jing-Min GUAN Guo-Fang SUN Li-Li LI Xue-Mei ZHENG Hong-Ling CUI Ying-Ji 作者单位：连海,LIAN Hai(解放军军事医学科学院解放军基因工程重点实验室,长春,130062;吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春,130062)

金宁一,李霄,陈立刚,张静敏,管国芳,孙丽丽,李雪梅,郑洪玲,JIN Ning-Yi,LI Xiao,CHEN Li-Gang,ZHANG Jing-Min,GUAN Guo-Fang,SUN Li-Li,LI Xue-Mei,ZHENG Hong-Ling(解放军军事医学科学院解放军基因工程重点实验室,长春,130062)

崔英姬,CUI Ying-Ji(吉林大学农学部图书馆,长春,130062)

肉鸡感染新城疫病毒的诊断 第6篇

关键词：肉鸡,新城疫病毒,诊断

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,ND)引起的一种多病型的高度接触性、急性、烈性传染病[1],具有传播速度快、发病率和死亡率高等特征[2],是规模养殖场最容易发生的病毒传染病之一,我国每年都有发病报道。新城疫病毒对所有家禽都易感,各种年龄和性别的鸡都易感[3]。病鸡和带毒鸡可以做为病毒传播来源,受感染的鸡在感染发病后的口和鼻分泌物中都可排出病毒,病毒感染后康复的鸡也可以传播病毒[4]。新城疫病毒感染一年四季都能发生,以春季多发,2016年3月,某规模肉鸡饲养场饲养的肉仔鸡发生了一起疑似新城疫病毒感染病例,经临床诊断和病毒分离鉴定最终确诊为由新城疫病毒感染所致。

1临床症状观察

2016年3月,某规模肉鸡饲养场发生一起肉仔鸡感染发病的情况,病鸡表现食欲下降,精神萎靡,极少走动,翅膀下垂,眼半闭半睁,病鸡有咳嗽,呼吸困难,常常张口呼吸,粪便稀薄,呈黄绿色,发病后2~5 d死亡,病死率达60%左右。

2病理剖检

取病死鸡剖检可见全身粘膜和浆膜出血,淋巴系统肿胀、出血和坏死为主要特征。消化道和呼吸道病变明显,腺胃粘膜水肿,腺胃乳头出血、溃疡、坏死;小肠和盲肠有大小不等的出血点,盲肠扁桃体肿大、出血和坏死;气管出血和坏死;肺有淤血和水肿,脑膜充血和出血。

3病毒分离

取病死肉鸡的气管等病变组织按1∶3比例加入灭菌生理盐水研磨,12 000 r/min离心15 min,取上清液加青链霉素和卡那霉素(各2 000单位/m L)作用6 h后,接种10日龄SPF鸡胚,0.1 m L/胚。每日照胚观察鸡胚死亡情况,24 h以内的死胚弃去,鸡胚集中死亡时间在24~72 h,收获死亡鸡胚的尿囊液,进一步做分离株病毒的相关鉴定。

4分离毒株的血凝试验

测定病毒分离时采集的尿囊液对1%鸡红细胞的凝集性:采集2只公鸡的抗凝血,混合后置于15.0 m L离心管中,加灭菌生理盐水10 m L,1 500 r/min离心10 min,弃去上层液体,再加入灭菌生理盐水10 m L,1 500 r/min离心10 min,重复操作2次后弃去上层液体。将下层红细胞配成1%鸡红细胞悬液。在96孔微量血凝板中一横排加上25μL灭菌生理盐水,第一个孔加上25μL分离毒尿囊液,做倍比稀释到横排的倒数第二孔,弃去25μL混悬液,每孔加25μL1%鸡红细胞悬液,微量振荡器震荡混合,放室温20 min观察血凝结果,分离毒尿囊液的血凝价为29。

5中和试验

将分离毒尿囊液与等量抗新城疫病毒阳性血清作用1 h后,接种SPF鸡胚10枚,24 h以内的死胚弃去,24~120 h无鸡胚死亡,观察120 h后所有鸡胚尿囊液做血凝试验。结果显示,中和后的SPF鸡胚尿囊液血凝试验结果均为阴性,说明分离毒可以和新城疫阳性血清发生特异性反应,分离毒为新城疫病毒。

6动物回归试验

将分离毒尿囊液作106倍稀释后,腿部肌肉注射2月龄SPF鸡10只,0.1 m L/只,同时取10只SPF鸡注射灭菌生理盐水作为对照,3 d后攻毒组试验鸡开始发病,表现精神萎靡、食欲下降、眼半闭半睁、咳嗽、呼吸困难、张口呼吸等症状,至攻毒后5 d,10只鸡全部死亡,剖检死亡鸡可见典型的消化道和呼吸道病理变化。对照组10只鸡全部健康,无不良临床表现。

7综合诊断结果

根据养殖场发病肉鸡的临床症状和病理剖检症状,结合实验室的病毒分离、血凝试验、中和试验、动物回归试验结果,综合判定该养殖场发生了新城疫病毒感染,对该养殖场采取病鸡隔离饲养,饲养场严格消毒处理,紧急接种新城疫疫苗加强免疫,疫情得到有效控制。

8讨论

本研究通过对养殖场发病肉鸡的临床症状和病理剖检症状观察,结合实验室的病毒分离,血凝试验和中和试验结果,综合判定该养殖场发生了新城疫病毒感染。病毒分离鉴定是疾病诊断最常规和可靠的试验方法,通过对该养殖场采取病鸡隔离饲养,加强禽舍保温防寒,加强饲料营养,饲养场采取严格消毒处理,对全群鸡采取紧急接种新城疫疫苗加强免疫,疫情得到有效控制。鸡舍一旦出现新城疫强毒感染,就很难净化疾病[5],所以对于新城疫的综合防控,应采取坚持科学畜牧制度,坚持自繁自养,坚持疫苗免疫接种,防止新城疫强毒发生。虽然疫苗接种后可能会出现一些鸡病情加重,加快死亡,但对未感染和未发病的鸡群有很好的保护,由于鸡群普遍接种新城疫疫苗免疫接种,鸡苗中存在新城疫的母源抗体,所以鸡群首免日龄过小可能会出现免疫失败,母源抗体对新城疫的免疫有很大影响,母鸡接种新城疫疫苗后,可将抗体通过卵黄传播给雏鸡,一般情况下,雏鸡在3日龄时抗体滴度最高,之后逐渐下降,有母源抗体的雏鸡对病毒有一定抵抗力,这常常导致疫苗接种的干扰作用,母源抗体在7日龄消失,可以进行新城疫的首免;也可以在1日龄时使用灭活疫苗免疫,灭活疫苗受母源抗体的干扰少,或者使用灭活疫苗与活苗同时免疫,活苗对灭活疫苗有一定促进作用,在有条件做血凝试验的鸡场也可以根据HI试验结果免疫,在HI效价为23时接种效果最好。了解鸡群的免疫状况有助于鸡群免疫程序的制定和完善,为健康养鸡保驾护航。

参考文献

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新城疫病毒分子生物学研究进展 第7篇

近年来, 随着分子生物学技术的成熟, 根据NDV基因的核苷酸和氨基酸顺序对NDV分离株进行分类逐渐成为NDV分子流行病学研究的热点。Toyoda等首先根据NDV F或HN全基因两种核苷酸序列分别对60年代前流行于世界各地的NDV分离毒株绘制进化树, 结果将分离的11个毒株分为A、B、C三组, 这说明F和HN基因的变异具有很强的正相关性。Yang等在1997年根据HN基因头部保守区的382 nt核苷酸片段对1884~1995年分离于流行台湾的14株NDV分离株进行系统发育进化分析, 证明1995年分离株明显由1984年进化而来, 而且揭示这些毒株与日本和马来西亚分离毒株很相关。1998年匈牙利学者Lomniczi等根据F基因47-435间的389个核苷酸序列对1992~1996年流行于西欧国家的51株NDV分离株进行了分析, 发现以此绘制的进化树与酶切位点分布所反映的毒株间遗传关系一致。从而建立了对NDV分离株进行遗传学和生物学鉴别的简单方法。并进一步将NDV划为7个基因型, 分别解释了其来源和流行病学特征, 发现每一类型的毒株具有相同的流行病学特性, 也可能具有共同的起源。Herczeg等在分析了90年代以来南非一些国家及欧洲等地34个分离株, 鉴定出两个新的基因型, 即Ⅶb和Ⅷ, 并将原来的基因Ⅶ命名为基因Ⅶa。34株NDV有28株属于Ⅶb, 与近年来南部非洲及南欧的ND爆发有关。另六株为基因Ⅷ, 与南部非洲ND的爆发有关。

近20年以来发生于亚洲、中东、非洲及欧洲等地的ND被认为构成了ND的第四次大流行, 主要以基因Ⅶ型为主, 同时还有基因Ⅵ型和Ⅷ型的存在。在国内严维巍等于2000年首次报道了基因Ⅶ型NDV在中国大陆的存在。曹殿军等根据NDV F基因编码区1-374位核苷酸序列分析, 绘制了NDV系统发育树, 将68株NDV分为9个基因型 (30株为国内分离株) 。其中, Ⅰ-Ⅳ是早己存在的基因型;Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ为新发现的基因型, 特别是基因Ⅸ是我国特有的基因型。通过进化树分析得出, 基因Ⅶ型NDV是引起我国新城疫发生的主要病原。吴艳涛等比较了26个从华东和新疆地区分离的NDV毒株和28个参考毒株的F基因47-420 nt核苷酸序列的同源性, 并绘制了遗传发育树, 发现我国ND的流行具有自身的规律性, 我国现阶段NDV的流行株以基因Ⅶ为主 (53.8%) , 但也有基因Ⅵ (34.61%) 和Ⅸ (11.5%) 型毒株, 基因Ⅸ型毒株为我国特有的基因型。我国的基因Ⅶ型不是以国外报道的基因Ⅶa型、基因Ⅶb型为主的基因型, 而是新的基因亚型。基因Ⅵ型毒株也以新发现的Ⅵf和Ⅵg为主, 而不是以国外报道的Ⅵa和Ⅵb型为主。尹燕博等在2002年通过对国内NDV流行分离株的遗传变异分析, 表明国内曾经流行和正在流行的NDV共有5个基因型, 近几年来正在流行的NDV有4个基因型。其中有30株分离株为Ⅶ型, 是主要的流行毒株;有3株分离株为Ⅵ型;有7株分离株为Ⅱ型;有1株分离株为III型;至于F48E9, 与所有分离的NDV均有较大差异, 暂列为Ⅸ型。王学理等通过对从吉林省分离的鹅源新城疫NA-1株分析, 发现NA-1株F基因具有基因Ⅶ型NDV的典型特征, 与鹅源新城疫SF02株、YG97株以及鸡源分离株NL-NDV、CHI/85、Taiwan95等毒株亲缘关系较近, 用HN基因绘制的遗传进化树和F基因的相一致。

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定 第8篇

1 材料

1.1 病料

从广东顺德地区某鸽场发病鸽中采集病死鸽的肺脏、肾脏、脾脏器官作为病料。

1.2 SPF鸡胚

9～11日龄SPF鸡胚, 由永顺生物制品有限公司提供。

1.3 试剂

NDV及减蛋综合征病毒 (Egg drop syndrome virus, EDSV) 的标准阳性血清, 农业部动物疫病防控重点开放实验室提供;禽流感病毒 (Avian influenza virus, AIV) H5、H7、H9标准阳性血清, 国家动物流感参考实验室提供;Trizol、M-MLV反转录酶、RNasin、dNTP, 购自Invitrogen公司;Premix Ex Taq, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。

2 方法

2.1 病毒的分离、鉴定

将采集的病料置于研磨器内磨碎, 用含双抗 (2 000 U/mL) 的生理盐水将病料进行1∶3稀释制成悬液, 冻融2次后, 3 500 r/min离心30 min;取上清液接种9～10日龄SPF鸡胚, 每胚0.2 mL, 置37 ℃温箱孵育, 弃去24 h内死亡鸡胚, 以后每12 h照胚1次, 将死亡胚置4 ℃冰箱过夜, 72 h后收集鸡胚尿囊液作血凝试验。将具有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与NDV、EDSV、AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7标准阳性血清进行血凝抑制试验, 具体操作程序按照世界动物卫生组织的国际标准方法[6]进行。

2.2 病毒F基因特异性片段的扩增及序列测定

2.2.1 引物的设计

参考GenBank中鸽源新城疫病毒序列设计1对针对F基因的特异性鉴定引物 (由上海英骏生物公司合成) , 序列为上游引物5′-CAAATTAGAAAAAACACG-3′, 下游引物5′-GCAACCCCAAGCGC-3′, 大小约为450 bp。

2.2.2 病毒RNA的提取与RT-PCR

按照Trizol试剂说明提取病毒RNA, 加入适量的DEPC处理水溶解。RT反应体系按Invitrogen公司提供的M-MLV反转录酶的使用方法操作。50 μL PCR 反应体系:Premix Ex Taq 25 μL, 上、下游引物 (20 pmol/μL) 各0.5 μL, 反转录产物4 μL, 无菌三蒸水20 μL。反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共30 个循环;72 ℃ 8 min。取3 μL PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测分析, 剩余的PCR产物参照天根生化科技 (北京) 有限公司的普通DNA纯化试剂盒的说明书进行操作。

2.2.3 序列测定及分析

将纯化后的 PCR产物送往上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。将测得的序列提交NCBI BLAST SERVER进行联机检索, 同时应用DNAStar (Version 7.1) 软件包中的MegAlign软件分析其F基因裂解位点区112～117位的氨基酸序列特征。

3 结果

3.1 病毒的分离及鉴定结果

从病料中分离到有血凝性的病毒, 血凝效价达到9 lb;该病毒能被NDV标准阳性血清抑制, 而不能被EDSV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9 阳性血清抑制, 证明所分离病毒为新城疫病毒。

3.2 F基因特异性鉴定引物PCR扩增结果

利用针对F基因设计的特异性引物从分离病毒的RNA中扩增出1条约450 bp的条带, 与预期结果一致, 见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.以高纯水为模板的阴性对照;2.分离株F基因的PCR扩增产物。

3.3 F基因的序列测定及分析

将测得的F基因序列经DNAStar (Version 7.1) 软件分析, 发现其F1/F2多肽裂解位点氨基酸序列为112RRQKRF117;经NCBI BLAST SERVER联机检索, 结果显示F基因与GenBank中天津分离株AG/Tianjin/07的核苷酸序列相似性最高, 达到99%。综上所述, 该分离株鉴定为鸽新城疫病毒, 命名为Pigeon/Guangdong/SD54/2006。

4 讨论

从1926年新城疫被发现至今, 已发生过几次大流行, 其中第2, 3次大流行均与鸽有关。目前认为, 鸽新城疫起源于鸡新城疫, 是鸡新城疫长期适应鸽体并在鸽体内发生变异所导致的。两者在流行病学、发病症状、剖检变化等方面有很大的相似性, 但在发病率、死亡率以及死亡时间等方面有一定的差异。有研究发现, 鸽新城疫病毒的生物学特性不一定与其F蛋白裂解位点氨基酸序列以及对鸽的致病力表现一致[7,8]。鸽新城疫病毒可感染家禽, 且经鸡胚传代可增强其致病性。由于养鸽业流动性大, 特别是信鸽的饲养, 一旦发病, 容易造成病原的扩散而感染其他易感禽类, 甚至传播到多个国家, 并呈地方性流行。这与近年来新城疫流行病学特点发生的变化有一定的关系[9], 甚至可能在鸡群中引发新一轮的流行。

养鸽业在我国自开始至今已有30年的历史, 随着社会经济的不断繁荣, 生活品位的不断提高, 无论是肉鸽还是信鸽的饲养都得到了迅速的发展, 广东地区更是如此。禽类贸易的频繁发生, 再加上饲养管理与疾病防控技术水平不足, 给疫病的流行和传播提供了条件, 严重危害了养鸽业的健康发展。因此, 人们必须密切留意鸽新城疫病毒流行动态。

试验从发病鸽中分离得到的病毒经血凝试验、血凝抑制试验、F基因扩增及序列测定证明该分离株属于鸽新城疫病毒, 并命名为Pigeon/Guangdong/SD54/2006, 丰富了广东地区鸽新城疫病毒的流行病学资料。

摘要：为了对广东地区某鸽场疑似鸽新城疫病毒感染的鸽群进行病原学诊断, 试验采用血凝试验 (HA) 、血凝抑制试验 (HI) 、F基因扩增及序列测定等一系列综合试验对其进行病原学鉴定。结果表明:该分离株具有血凝活性, 且这种血凝性可被新城疫病毒 (NDV) 标准阳性血清抑制, 而不能被减蛋综合征病毒 (EDSV) 、禽流感病毒 (AIV) -H5、AIV-H7、AIV-H9阳性血清抑制;用针对NDV F基因设计的特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增, 可扩增出相应的目的片段;该分离株与天津分离株AG/Tianjin/07的核苷酸序列的相似性高达99%。说明该分离株为鸽新城疫病毒, 命名为Pigeon/Guangdong/SD54/2006。

关键词：新城疫病毒,鸽,广东

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重组新城疫病毒 第9篇

新城疫病导致鸡各组织器官出现广泛性病变, 其中以消化器官和免疫器官的病变最为严重。本试验通过制备新城疫病鸡的三个重要免疫器官胸腺、脾脏、法氏囊的石蜡切片, 来观察新城疫病毒引起鸡的免疫器官的病理变化。

1 材料与方法

1.1 试验动物

确诊新城疫病鸡2只。

1.2 试验器材

恒温水浴锅、干燥箱、染色缸、吸水纸、电热炉、石棉网、量筒、烧杯、纱布、线绳、生理盐水瓶、广口瓶、手术刀、手术剪、镊子、毛笔、滤纸、托盘、橡胶手套、固体石蜡、石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜、擦镜纸、数码相机等。

1.3 主要试剂

PBS缓冲液、蒸馏水、无水乙醇、二甲苯、甲醛、氯化钠、氯化钾、磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、苏木素、伊红、中性树胶等。

1.4 试验分组及取样

解剖已确诊的新城疫病死鸡, 取胸腺、脾脏、法氏囊置于10%中性福尔马林溶液。

1.5 组织病理切片的制备

按常规方法制备组织病理石蜡切片。取出固定于10%福尔马林溶液中的组织脏器, 按常规法分别进行脱水 (乙醇70%1h、85%1h、95%1h、95%1h、100%1h、100%1h) 、透明 (二甲苯15~20min) 、浸蜡 (56℃2~3h) 、包埋、切片 (4um) 及染色 (HE染色:二甲苯5min、乙醇100%3min、95%3min、85%3min、75%3min、苏木精3min、乙醇75%3min、伊红3min、85%3min、95%3min、100%3min、二甲苯5min、二甲苯5min) , 中性树胶封片。

2 结果与分析

2.1 胸腺的病理变化

胸腺小叶皮质区出血, 淋巴细胞坏死, 髓质区可见较多出血灶, 许多视野可见血浆渗出物、红细胞及变性坏死的其它细胞形成的炎症区域 (图1) 。

2.2 脾脏的病理变化

脾脏淋巴细胞严重变性坏死, 数量极度减少, 髓质部有程度不等的充血、淤血, 部分视野可见网状细胞变性、坏死 (图2) 。

2.3 法氏囊的病理变化

法氏囊滤泡内淋巴细胞、网状细胞严重变性坏死, 数量显著减少, 间质小血管扩张, 充血, 部分病例间质可见出血 (图3) 。

3 讨论

新城疫可引起全身性的病理反应, 对引起机体组织器官损伤也是全方位的, 各组织器官广泛出现病变, 其中以消化器官和免疫器官的病变尤为严重。

湖南省鸽新城疫病毒的分离与鉴定 第10篇

1 材料与方法

1.1 病料的采集及处理

病料来自湖南某养鸽场的疑似鸽新城疫病的病鸽。无菌采集其气管、肺加以研磨后, 按1:5的比例加入无菌生理盐水制成悬液, 离心取上清液, 微孔滤器过滤除菌, 加双抗各1000IU/ml, 4℃冰箱作用2h, 离心沉淀, 取上清液保存备用。

1.2 病毒的分离

SPF种蛋购自湖南生物药厂, 自行孵化至9～10日龄时, 取上述病料上清液接种5枚, 每胚0.2ml, 37℃温箱孵育, 弃去24h内死亡胚, 收集24～120h死亡鸡胚与活胚于4℃冰箱过夜, 次日收取尿囊液。

1.3 HA和HI试验

抗NDV阳性血清, Lasota毒株购自中国兽药鉴察所, 1%红血球和生理盐水按常规自制, HA及HI试验按常规微量法进行。

1.4 鸡胚中和试验

取ND阳性血清与等量100倍稀释分离毒, 置室温作用30min后, 接种5枚SPF鸡胚, 同时接种5枚不加血清的病毒液, 0.2ml/枚, 继续培养120h, 弃去24h内死亡鸡胚, 收获24h后死亡胚及120h活胚的尿囊液, 作HA测定。

1.5 动物回归试验

1.5.1 人工感染鸽试验

将分离毒鸡胚尿囊液1:10稀释, 肌肉注射5只非免疫鸽, 每只0.5ml, 观察30天, 记录发病、死亡情况, 30d时对未发病鸽采血清测定抗体, 确定是否感染, 设生理盐水注射对照组。

1.5.2 人工感染鸡试验

将分离毒鸡胚尿囊液1:10稀释, 肌肉注射42日龄SPF鸡5只, 每只0.5ml, 观察30d, 记录发病死亡情况, 30d时对未死亡鸡采血清测定抗体, 确定是否感染, 设生理盐水注射对照组

1.6 病毒的生物学特性测定

1.6.1 ICPI测定

按文献[7]方法进行, 将分离株鸡胚尿囊液以生理盐水稀释10倍, 脑内注射出壳后24～36h的SPF雏鸡8只, 每只0.5ml, 同时设4只对照 (其中2只脑注射生理盐水各0.05ml) , 隔离观察饲养8d, 记录正常、发病与死亡鸡的每日累计数, 正常鸡积分为0, 发病为1, 死亡为2, 最后计算ICPI。

ICPI= (8天累计发病数×1+8天累计死亡数×2) /8天累计鸡只总数

16.2 IVPI测定

按文献[7]方法进行, 将分离株鸡胚尿囊液以生理盐水稀释10倍, 翅静脉接种6周龄SPF鸡10只, 每只0.1ml, 同时设4只对照 (其中2只静脉注射生理盐水各0.1ml) , 隔离观察饲养10d。记录正常、发病、麻痹与死亡鸡的每只累计数;正常鸡积分为0, 发病为1, 麻痹为2, 死亡为3, 最后计算IVPI。

IVPI= (10天累计发病数×1+10天累计麻痹数×2+10天累计死亡数×3) /10天累计鸡只总数

1.6.3 MDT测定

按文献[7]方法进行, 将分离株尿囊液以生理盐水分别稀释成10-1～10-9, 每个稀释度分别接种9日龄SPF鸡胚8个, 每胚0.1ml, 置37℃继续孵化, 于接种后24h第一次照蛋, 弃去死亡, 以后每天照蛋两次, 记录胚死亡时间, 取尿囊液测定HA效价, 持续7d, 最后计算MDT。

MDT= (X小时死亡胚数×X小时+Y小时死亡胚数×Y小时……) /死亡胚总数

2 结果

2.1 病毒分离

最初接种的5枚SPF鸡胚, 接种后48～96h死亡3个, 测其尿囊液HA效价为22, 死亡胚充血、出血, 将尿囊液继续传代至第3代时, 死亡胚尿囊液HA在24～25, 死亡胚体磨碎后上清HA可达26, 分离毒尿囊液能被抗NDV阳性血清所抑制。

2.2 鸡胚中和试验

鸡胚接种经ND标准阳性血清处理的病料未见死亡, HA效价为20, 而接种未经处理病料的鸡胚于26～38h后全部死亡, HA效价为26～7, 结合病毒分离结果, 证明分离毒为NDV。

2.3 动物回归试验

经肌肉注射的5只非免疫鸽, 结果3d后全部发病, 至第10d全部死亡, 症状和病变与自然发病鸽一致, 而肌肉注射的5只SPF鸡, 没有发病和死亡, 接种30d测定血清HI抗体均为阳性, 即5只鸡均感染。

2.4 生物学特性测定结果

结果见表1

3 讨论

3.1本试验用SPF鸡胚从发病鸽群中分离到一株病毒, 盲传3代其HA效价达25～6, 说明该病毒增殖较快, 死亡胚尿囊液可被标准ND阳性血清所抑制, 结合鸡胚中和试验结果, 说明该分离毒为NDV。

3.2动物回归试验结果表明, 分离毒对鸽有高度的致病性, 而且试验鸽的症状和病毒与自然发病鸽表现一致, 而肌注SPF鸡, 只感染不见临床症状, 这与有关报道[7]的结果是一致的。

3.3病毒中和试验结果表明:鸡抗NDV血清能特异地中和该毒株, 说明鸡NDV与鸽NDV含有相同的抗原成分。动物回归试验中, 该分离毒对鸽有高致病力, 而不能引起鸡发病, 是否预示着该毒株已发生变异以及能否用鸡ND疫苗预防鸽ND, 有待进一步研究。

3.4生物学特性测定结果表明分离毒的MDT为99.8h, 相当于鸡NDV弱毒 (MDT﹥90[8]) ;ICPI为1.38, 相当于鸡NDV中等毒力 (ICPI为0.6～1.5[8]) ;IVPI为1.0, 相当于鸡NDV强毒株 (IVPI为以上[8]) , 这与有关报道[7]相一致, 说明该鸽NDV分离株在生物学特性上与鸡NDV表现出不同的特性。

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