nm23基因范文

nm23基因范文（精选5篇）

nm23基因 第1篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院放疗科1994～2001年治疗的鼻咽癌患者66例,其中,男53例,女13例;年龄最大85岁,最小25岁,平均(42.28±13.15)岁;有远处转移和无远处转移的患者分别为33例;临床分期:Ⅰ期1例,Ⅱ期18例,Ⅲ期31例,Ⅳ期16例;在所有患者中,46例有颈淋巴结转移,20例无颈淋巴结转移;病理分型:65例为低分化鳞状细胞癌,1例为鳞状细胞癌2级。

1.2 主要试剂

兔抗人单克隆抗体nm23,免疫组化二步法试剂盒(KIT-9801)、单克隆抗体(即用型MAB-0129),鼠抗人Ki67、L多聚赖氨酸(GLU-0040)。进行苏木精-伊红染色切片组织学证实。

1.3 方法

通过门诊进行复查、查看病历、电话或信件调查等方式,收集符合标准的病例。纳入标准:在我院放疗科进行的第一次放射治疗,这些患者必须由我院完成其鼻咽部的病理活检及病理诊断并且保存有原始病理组织蜡块。在治疗前已完成对鼻咽部得CT扫描检查,存在有T、N、M的原始分期,放疗量为NPDT 6 800～7 200 CGy,未进行化疗。阳性对照采用已知的阳性片,空白对照采用PBS代替一抗,组织学参照可运用苏木精-伊红染色。

1.4 结果判定标准

Ki67表达阳性的判定:对细胞核着色时呈现棕黄颜色,在显微镜下观察,常选取5个高倍镜视野,在每个高倍镜视野下对100个肿瘤细胞进行观察,阴性判断标准为总的阳性率<5%,判断为“+”的标准为阳性率在5%～20%之间,判断为“++”时阳性率应在21%～40%之间,判断为“+++”需满足阳性率在41%～75%之间,>75%判定为“++++”。nm23表达阳性的判定:胞浆着色,判定标准同Ki67,鼻咽癌分期采用92福州TNM分期法。

1.5 统计学方法

用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析,采用秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Ki67、nm23的表达均与年龄、性别无关。鼻咽癌伴远处转移组中,Ki67的表达明显高于无远处转移组(z=-5.395,P<0.001),而nm23的表达明显低于无远处转移组(z=-3.866,P<0.001)。Ki67表达随临床分期的增高而增高,呈正相关(r=0.268,P=0.029<0.05)。Nm23的表达随临床分期的增高而降低,呈负相关(r=-0.246,P=0.040<0.05)。Ki67和nm23的表达与T分期无相关性(r=0.177、-0.130,均P>0.05)。Ki67、nm23的表达在有无淋巴结转移组中差异均无统计学意义(z=-1.498、-0.901)。Ki67与nm23的表达呈负相关(r=-0.327,P=0.007)。见表1。

3 讨论

Ki67、nm23基因是学者们近年研究得较多的癌基因,在很多医院病理科对乳腺癌、肝癌等作常规检测,对鼻咽癌尚需进一步循证。在人体内Ki67基因位于10q25(ter)上,研究显示有丝分裂活动与它有紧密的关系,除G0期以外它表达于细胞周期中的其他所有时期,Ki67蛋白在有丝分裂完成后迅快降低溶解。Ki67是双链的分子结构,只在增殖的细胞表达。其高表达是细胞增殖活跃的重要标记,对肿瘤的转移及预后有影响。Ki67的表达作为反映肿瘤恶性程度的指标早已被很多学者公认。Nm23基因是Steeg等在筛选7个k-1735小鼠黑色素瘤细胞株时,用消减杂交法分离到的能抑制转移的CDNA的克隆,这一克隆即nm23。它定位于17q21.3,编码17KD蛋白。其表达水平与肿瘤的侵袭性和转移倾向均有相关,其主要功能:(1)抑制细胞微管系统异常聚合,防止减速分裂时纺锤体异常,而导致的非整倍体肿瘤细胞形成,同时可降低肿瘤细胞的侵袭性和转移能力;(2)阻断G蛋白介导的生长信号传导,从而抑制肿瘤细胞的生长[4],很多学者认为它是反应肿瘤预后良好的指标。

3.1 Ki67、nm23表达与临床因素的关系

根据国内外的研究[2,5],肿瘤的生存、复发、增生、浸润、转移等与Ki67的表达有很重要的关系。根据Cher的研究得出:Ki67的表达和前列腺癌同时伴随骨转移有关,在发生骨转移的患者中Ki67的表达较高[6]。nm23的低表达与肿瘤的发生、发展、转移、预后有关[7]。笔者的研究亦显示:鼻咽癌中Ki67和nm23的表达在有远处转移组和无远处转移组中有显著差异(P<0.001),远处转移组中Ki67高表达而nm23低表达。由于Ki67高表达和nm23低表达者容易发生远处转移,因此检测鼻咽癌患者病理标本的Ki67、nm23,可以预测患者发生远处转移的可能性,这对临床干预和靶点药物的研制提供有益的思考的方向。

国内外很多学者认为Ki67、nm23的表达与肿瘤临床分期相关,Zheng等[4]的研究结果指出Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌组织中Ki67的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期的癌组织(P<0.05)。国内研究亦得出类似结果[2]。Hailat等[6]发现nm23蛋白表达水平与神经母细胞瘤的分期呈负相关。有一些学者持有自己的观点,Roland等[7]认为,头颈肿瘤的分期与Ki67的表达无必然的联系。Oretti等[9]认为:nm23的表达与非小细胞肺癌的临床分期无关,本组资料显示鼻咽癌组织中Ki67的表达与临床分期呈正相关(r=0.268,P=0.029<0.05),nm23的表达与临床分析呈负相关(r=0.246,P=0.040<0.05)。这对临床实践具有指导作用,而笔者的病例数少,有待进一步循证。

有研究显示:Ki67表达与一些原发病灶的大小成正比,比如黑色素瘤[10],Ki67表达与其原发灶的大小呈正相关。鼻咽癌的特点有,发生部位较隐蔽,肿瘤所在的地方空间很小周围腔隙多,很难准确地计算原发病灶的大小。原发灶的情况在某种程度上可以通过鼻咽癌T分期来反映。本文研究表明:Ki67、nm23的表达与T分期无明显相关(P>0.05),与国内部分学者的研究结果类似[11,12]。分析其原因可能有:(1)在进行CT扫描时,鼻咽图像和NPC病灶范围没有完全相吻合,从而导致了原发病灶不能真实的反映;(2)收集的病例数少;(3)远处转移病例在总病例中占的比例较高;(4)在进行肿瘤恶性程度的评判时会涉及诸多问题,肿瘤的恶性程度无法用单纯而简单的T分期来说明;(5)可能与鼻咽癌92分期中T分期的不合理有关。目前临床已广泛采用经大量回顾性研究及MRI图象扫描为基础的08分期。

关于局部淋巴结的转移,大部分学者认为与Ki67、nm23的表达有关。有淋巴结转移者Ki67的表达率高[13],无淋巴结转移者nm23的表达率高。本组资料中Ki67、nm23的表达与有无淋巴结转移在统计学上无明显意义。可能的原因有:(1)采集的病例数少;(2)总病例数中,远处转移患者在总病例中占有很高的比例;(3)鼻咽癌92分期中N分期的不合理性;(4)其他未知原因。

3.2 总结

本研究中Ki67 nm23的表达与有无远处转移有关、与临床分期有关而与单独的T、N分期无关[Ki67的表达与临床分期呈正相关(r=0.268,P<0.05),nm23的表达与临床分期呈负相关(r=-0.246,P=0.040<0.05)],是因为总分期比单独的T、N分期更能反应肿瘤的特性。其二者的表达呈负相关,说明二者联用能更好地反应肿瘤的增殖浸润和转移特性。这个论点一旦成立将对临床实践具有指导作用,值得我们进一步思考和研究。

nm23基因 第2篇

1 资料与方法

1.1 临床病例资料:

收集我科2008年初至2010年底收治的74例行胃癌根治性切除手术的病例, 男性患者48例, 女性患者26例, 平均年龄为 (55±10) 岁。高、中分化癌38例, 低分化组 (包含印戒细胞癌及黏液腺癌) 36例。病理分期 (TNM分期) :Ⅰ、Ⅱ期26例, Ⅲ、Ⅳ期48例。浸润深度:浆膜内层29例 (包括肌层、黏膜下层、黏膜层) , 浆膜 (外) 层45例;肿瘤病灶直径<5厘米34例, ≥5厘米40例;无转移15例, 有淋巴结转移59例。5年以上生存期20例 (27%) 。

1.2 免疫组化染色、结果判读:

采用链菌素亲生物素蛋白-过氧化酶法, DAB显色, 试剂盒产自California Biotech Inc.按说明书进行操作。

nm23和cerb B-2以胞质和 (或) 胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。p53以细胞核和 (或) 胞质呈清晰的棕色为阳性。随机5个高倍视野, 阳性癌细胞数≤25%为阴性表达 (低表达) , >25%为阳性表达 (过表达) 。1.3统计方法:采用SPSS 20.0对数据进行统计分析, 进行χ2检验, P<0.05有统计学差异。

2 结果

p53、nm23、cerb B-2表达与临床病理特征的关系 (表1) 。p53、nm23、cerb B-2的联合表达与预后指标的关系 (表2) 。表达异常:nm23低表达, p53、cerb B-2过表达。

3 讨论

在胃癌的发生、进展过程中, 伴随着抑癌基因、癌基因和肿瘤转移抑制基因的一系列的改变。而抑癌基因的失活比癌基因的活化更常见, 其作用也更重要[1]。

p53基因是公认的抑癌基因, 其野生型基因具有抑制细胞异常生长分化的作用。而丧失调控功能的突变型p53基因编码的蛋白不仅失去抑癌活性, 反而能促使正常细胞癌变, 使得p53由抑癌基因转变成癌基因。我们的研究发现p53基因在胃癌浸润浆膜 (外) 层病例中呈高表达, 说明其在胃癌细胞增殖、发展过程中起到重要作用 (表1、2) 。

nm23基因是肿瘤转移抑制基因, 由Steeg[2]在1988年分离并发现。nm23基因编码蛋白主要功能是参与生成三磷酸核苷, 进一步影响G蛋白介导的信号传导通路和微管聚合状态, 进而调节细胞代谢功能, nm23基因编码蛋白在肿瘤细胞的分化、增殖以及转移侵袭中起重要作用。我们的研究发现nm23表达率在有淋巴结转移病例低于无淋巴结转移病例, 浸润浆膜 (外) 病例低于浸润浆膜内病例, Ⅲ、Ⅳ期病例低于Ⅰ、Ⅱ期病例, 5年以下生存期病例低于5年及以上生存期病例, 提示nm23的高表达对胃癌的浸润、转移和发展具有抑制作用 (表1、2) 。

Cerb B-2是具有酪氨酸激酶活性的原癌基因, 其结构与表皮生长因子受体相似, 可与表皮生长因子配体结合, 促进肿瘤细胞的分裂、增殖, 是预后不良的一个重要指标。我们的研究发现, cerb B-2阳性表达病例中, 浆膜 (外) 浸润病例为86.7%, 低分化病例为91.7%, TNMⅢ、Ⅳ期病例为85.4%, <5年生存期病例为79.6%, 明显高于cerb B-2基因编码蛋白阴性表达病例 (P<0.05) , 说明cerb B-2基因编码蛋白阳性表达的胃癌患者容易发生淋巴结转移, 分化程度低, TNM分期晚, 预后不良, 故cerb B-2表达可作为评估胃癌患者预后的指标 (表1、2) 。

胃癌的发生、进展是多步骤、多阶段的, 过程中伴随着多个抑癌基因失活和原癌基因激活。我们的研究发现, 通过测定74例胃癌组织标本中p53、nm23、cerb B-2的基因编码蛋白表达, 结果提示p53、cerb B-2阳性表达、nm23阴性表达在胃癌的淋巴结转移率、分化程度、TNM分期、肿瘤浸润深度、5年生存期上具有统计学差异, 说明测定p53、nm23、cerb B-2的基因编码蛋白可作为评估胃癌预后的指标。同时发现p53、nm23、cerb B-2表达中, 多基因 (2个及以上) 异常表达占病例数一半以上, 并且多基因表达异常组中低分化者、浸润浆膜 (外) 者、TNM分期较晚者、低于5年生存期者明显高于单一 (或无) 基因表达异常组 (P<0.05) , 说明p53、nm23、cerb B-2基因在胃癌的发生以及癌细胞浸润、转移中起协调作用。联合测定p53、nm23、cerb B-2的基因编码蛋白表达对评估胃癌患者的预后比单独测定单一指标更有价值, 可作为评估胃癌患者预后的重要指标。

参考文献

[1]李延青, 欧阳建东, 袁俊华, 等.与肿瘤转移有关的几个因素[J].山东医药, 2008, 48 (1) :7-10.

nm23基因 第3篇

关键词：鼻咽癌,螺旋CT机,nm23-H1,癌组织侵袭

0 前言

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是发病率居首位的头颈部恶性肿瘤,具有高度的侵袭性和转移性,好发于中国南部,特别是广东,为世界发病率最高的地区[1]。CT扫描能够准确判断NPC病变部位和累及的范围。许多研究表明,nm23-H1表达异常与肿瘤转移密切相关,但其与NPC的CT表现的关系在国内少见报道。为此,我们对nm23-H1蛋白表达情况与CT扫描癌组织侵袭程度的相关性进行了研究。现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集我院2008~2010年,经病理确诊为鼻咽低分化鳞癌患者,活检前64排螺旋CT检查结果及活检NPC组织标本62例。其中男性46例,女性16例,年龄38~64岁,平均年龄51岁。

1.2 64排螺旋CT扫描方法

采用Aquilion64排螺旋CT扫描机。扫描条件:120 kV,200 m As,层厚0.5 mm。62例患者均行横断扫描,从硬腭水平向上至鞍底平面,同时加扫颈部。层厚和层间距均为3 mm。根据64排CT所见鼻咽癌侵袭程度分为3组:(1)局限于鼻咽腔8例,见图1;(2)侵袭咽旁间隙无骨质破坏组27例,见图2;(3)侵袭颅底伴骨质破坏组27例,见图3。

1.3 一般组织学处理

活检标本均经10%福尔马林常规固定、脱水、包埋,4μm厚石蜡切片,经脱蜡、水化、3%H2O2处理。

1.4 主要试剂与方法

(1)主要试剂。本实验采用鼠抗人nm23蛋白单克隆抗体及免疫组织化学SP配套试剂盒,均购自上海长岛生物技术有限公司。

(2)免疫组化检测。进行nm23-H1免疫组织化学染色(SP法),操作步骤按说明书进行。已知阳性的乳腺癌组织切片标本为阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 结果判定

nm23-H1蛋白定位于细胞的胞浆或核周,呈棕黄色。根据阳性细胞数和显色强弱分为:(1)阴性(-):nm23-H1阳性细胞<10%;(2)阳性(+):nm23-H1阳性细胞11%~29%;(3)阳性(++):nm23-H1阳性细胞30%~59%;(4)阳性(+++):nm23-H1阳性细胞>60%。

1.6 统计学处理

对NPC组织中nm23-H1蛋白的表达与其CT所示侵袭程度的关系,应用SPSS10.0系统软件,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果(表1)

由表1可以看出,随CT侵袭程度的加深,NPC组织中nm23-H1蛋白的表达水平呈降低趋势。

3 讨论

恶性肿瘤侵袭程度的发生机制与多基因改变、多条信号转导通路的参与、多种转录因子调控相关,其中nm23-H1蛋白与之密切相关。大多数文献研究认为NPC是我国发病率、病死率较高的一种恶性肿瘤[2]。NPC作为低分化、高转移的恶性肿瘤,其侵袭发生早而使患者预后较差。nm23-H1定位于染色体17q21.3,含有5个外显子和4个内含子,由152个氨基酸组成,并含亮氨酸重复序列、α螺旋和碱性结构域[3]。nm23基因可由基因缺失及突变而失活,在肺癌、胃癌、卵巢癌等肿瘤中均有报道[4,5,6],在神经母细胞瘤中,nm23-H1的亮氨酸拉链模序与转移潜能增加直接相关[7]。nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因,因其表达产物核苷二磷酸激酶(NDPK)参与细胞的信号传递、微管组装,从而可特异性地抑制肿瘤转移[8]。因此,nm23-H1基因与肿瘤的生物学行为、预后等关系备受人们的关注。本研究结果显示NPC组织中nm23-H1蛋白的表达水平与其CT显示不同侵袭程度各组中差异有显著性(P<0.05)。提示,NPC组织中nm23-H1蛋白的表达水平随其侵袭程度的加深而降低,呈负相关。其可能机制有3点:(1)nm23-H1蛋白在癌组织中表达量减少,从而影响核苷二磷酸激酶(Nucleoside Diphosphate Kinase,NDPK)的活性和功能,nm23 NDPK异常时,GTP(三磷酸鸟苷)合成减少,引起微管聚合受阻,进而导致纺锤体形成障碍而产生非整倍体细胞以及染色体畸变,同时破坏细胞正常形态结构,改变细胞的粘着和迁移能力,结果促进了NPC的发展以致使NPC侵袭程度加深导致其预后较差;(2)nm23 NDPK发生变化时,信号无法由细胞外传至细胞内,引起细胞生长紊乱,从而促进NPC的发展以致使NPC侵袭程度加深导致其预后较差;(3)nm23 NDPK异常时,可使细胞运动发生变化,引发NPC的转移和浸润。

综上所述,随着NPC发展和侵袭程度加深的发生,癌细胞抑癌蛋白nm23-H1的表达量减少,逐渐失去对癌细胞生长、转移的抑制,从而使患者预后较差。NPC组织中nm23-H1蛋白表达水平与其CT所示不同侵袭程度密切相关,因此,nm23-H1蛋白的检测,可作为NPC预后不良的标志。

参考文献

[1]周丹,何进才.鼻咽癌血清或血浆标志物研究进展[J].实验与检验医学,2012,30(1):38-39.

[2]曾益新.鼻咽癌分子遗传学研究成果简介[J].中国科学基金,2006,4(4):233-235.

[3]范红渠,周卫兵.nm23-H1基因抑制肿瘤侵袭转移机制的研究进展[J].中国临床研究,2010,23(12):1143-1144.

[4]梅同华,李长毅,黄爱龙.非小细胞肺癌nm23-H1等位基因缺失与淋巴结转移关系的研究[J].第三军医大学学报,2005,27(12):1266-1268.

[5]周丹秋,李敏,吕元.C-erbB-2、nm23与胃癌生物学特性的关系研究[J].临床检验杂志,2005,23(1):28-30.

[6]施红旗,胡日文,楼善贤,等.p53和nm23在卵巢癌中的表达及意义[J].实用肿瘤学杂志,2005,19(4):269-271.

[7]Steeg PS,Horak CE,MillerKD.Clinical-translational approaches to the nm23-H1metastasis suppressor[J].Clin CancerR es,2008,14(16):5006-5012.

nm23基因 第4篇

宫颈癌的发病机制复杂,目前尚不完全清楚,现有的研究表明宫颈癌的发生、发展是由宫颈不典型增生(轻到中到重)、原位癌、早期浸润癌、浸润癌的连续发展过程,是一个多基因参与的多步骤的复杂过程,其中抑癌基因功能的丧失和癌基因的表达是其细胞癌变的分子基础。已发现的数个抑癌基因中,Survivin,nm23,NS-398等抑癌基因与宫颈癌关系密切。本文就这几个抑癌基因在宫颈癌领域的研究作一综述。

1 Survivin结构特点与抑癌机制

1.1 survivin结构

是新近发现的一种凋亡抑制蛋白(inhibitor of poptosis proteins,IAP)家族的新成员,是迄今发现最强的凋亡抑制因子。具有参与细胞周期调控及调节细胞有丝分裂等多种生物学作用。在几乎所有常见肿瘤中,survivin都有表达。已证实survivin作用于各个凋亡途径的汇集点,即直接抑制终末效应蛋白caspase-3和caspase-7,而发挥其抑制肿瘤细胞凋亡的作用。

Abrosini G等首先在人类基因组库中筛选克隆出survivin基因,survivin基因定位于17825,位于靠近端粒的位置,编码含有142个氨基酸,分子量为16.5ND的胞浆蛋白[1]。Survivin是IAP家族中结构最简单的蛋白分子,只有一个BIR序列,而梭基末端没有锌指结构而代之以螺旋缠绕区。人类survivin基因具有独特的蝶形邻结样二聚体结构,单体包含N-端锌指区、连接片段、长的C-端螺旋、4个a螺旋及3个0折叠。二聚体连接主要通过连接片段和N-端,a4螺旋。N-端锌指区与杆状病毒IAP重复区2(baculovirus IAP repeat 2,BIR2)有类似结构,survivin BIR2基序包含3个a螺旋和3个p折叠[2],其中半肮氨酸(Cys)和组氨酸(His)残基Cys57,Cys60,Cys84,His77与锌离子鳌合,B工R2基序的完整性是survivin抑制细胞凋亡的重要前提。另外,survivin有2个剪接变体:survivin Ex3和survivin 2B,前者缺乏外显子3,而后者保留部分内含子2作为隐蔽的外显子,2个剪接变体导致相应的蛋白质结构发生显著的变化,包括BIR结构域的改变。细胞转染试验证实[3]:Survivin Ex3保留抗凋亡特性,而survivin-2B抗凋亡功能显著下降,使得结果不可靠。

Survivin是至今发现抗凋亡作用最强的基因。Tamm等研究表明,Caspase级联式激活并溶解蛋白质是凋亡发生的核心机制[4]。Survivin可直接作用于Caspase,主要通过粘附于活化的Caspase-3,Caspase-7,抑制Caspase-3,Caspase-7的活性,从而阻断凋亡的过程。Survivin过表达能抑制各种刺激所诱导的凋亡,如FAS,VitK3,Staurospor,VP16,TAXOL和某些细胞因子,阻止Fas,Bax,Caspase和肿瘤药物所诱导的凋亡。抗凋亡蛋白因子抑制Caspase下游末端效应因子,而对上游启动子无影响,实验表明,survivin能抑制由Fas/Caspase-8和Bax/细胞色素C诱导的Caspase活化和凋亡,这也说明survivin是在凋亡通道汇聚点的部位起作用,即Caspase末端效应因子Caspase-3,Caspase-7。

1.2 Survivin与宫颈癌

Survivin呈明显的聚集分布,除胸腺和生殖腺外,它在分化成熟的组织细胞中不表达,而当细胞发生转化或恶变时又重新表达,survivin可在胚胎组织和人类多种肿瘤组织中表达。本研究结果在3 0例正常子宫颈组织中,survivin表达均为阴性,符合survivin在正常组织中不表达的实验预期,与其他相关研究结果一致。

在子宫颈上皮内瘤样变(CIN)(子宫颈癌前病变)中检测到了survivin基因的表达,但CIN-Ⅰ与CIN-Ⅱ中survivin的表达无明显差异,分析原因可能有以下几点:(1)由于CIN-Ⅰ及CIN-Ⅱ是子宫颈病变的早期,其病变有可逆性,survivin表达本无差异;(2)由于CIN-Ⅰ及CIN-Ⅱ的划分是人为进行,不排除部分切片划分有误的可能;(3)由于CIN-Ⅰ及CIN-Ⅱ为一连续的病变过程,一张切片可能同时存在CIN-Ⅰ及CIN-Ⅱ,干扰了结果。将CIN-Ⅰ及CIN-Ⅱ合为一组后可以看出,随子宫颈病变的进展,从正常子宫颈到CIN-Ⅰ,CIN-Ⅱ,再到CIN-Ⅲ,survivin的表达逐渐升高,有显著性差异((P<0.05)。这说明survivin表达出现在细胞转化的早期,并促进细胞转化,与子宫颈上皮细胞的进一步恶变密切相关。survivin的表达与子宫颈CrN及子宫颈癌的发生密切相关,而且在子宫颈CIN向子宫颈癌转变的过程中扮演了重要角色。

2 nm23结构特点和抑癌机制

2.1 nm23基因

nm23基因为人类正常基因,定位于17号染色体长臂17q21。目前,已发现的人类nm23家族成员达到了9个,分别是nm23-Hl、nm23-H2、nm23-H3、nm23-H4、nm23-H5、nm23-H6、nm23-H7、nm23-H8、nm23-H9。根据氨基酸序列的同源性和蛋白产物结构功能分析,可将这些成员分为两组:第一组包括nm23-H1到nm23-H4,编码具有典型磷酸二核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDPK)活性的蛋白产物,氨基酸序列的同源性较高。其中,nm23-H1和nm23-H2两个的氨基酸序列的同源性达88%,但前者与肿瘤转移表型关系更为密切。第二组包括nm23-H5到nm23-H9,序列保守性不如第一组严格,一些成员还具有除NDPK外的独立功能结构域。

nm23是目前研究最多的一种肿瘤转移抑制基因,对nm23转移抑制分子机制的研究较多的集中在NDPK及组氨酸激酶活性上。对于其作用机制,目前认为,是通过编码产物二磷酸核苷酸激酶(NDPK)实现的。NDPK主要存在于胞质和胞膜上,胞质中的NDPK能把结合于蛋白质上的二磷酸核苷(NDP)磷酸化,成为三磷酸核苷(NTP),NDPK是细胞内NTP,GTP,ATP主要制造者,调节着细胞内能量池的大小,nm23等位基因发生突变、缺乏或表达异常可导致NDPK发生改变,一方面引起NTP产生不足,影响微管的聚合,使细胞减数分裂时纺锤体形成障碍,出现染色体畸变和非整倍体细胞,从而驱动肿瘤转移;另一方面通过影响细胞骨架而引起细胞运动,从而参与浸润、转移过程;再者,NDPK的改变可导致G蛋白介导的对细胞素信号反应的变化,引起细胞运动的改变,促进浸润过程[5]。

2.2 nm23与宫颈癌

目前,对nm23-H1基因已进行了多方面研究。路平等应用免疫组织化学技术对90例不同宫颈组织中nm23-H1表达进行了比较性研究,结果显示,正常宫颈上皮组织、低度不典型增生(CINⅠ,CINⅡ)、组织中nm23-H1的表达率明显高于宫颈癌,在高度不典型增生和宫颈癌中,nm23-H1的表达率明显减少,此结果提示nm23-H1基因的低表达在宫颈鳞癌的发生发展过程中可能起着重要的作用。Chen等的研究进一步表明,低表达nm23基因与宫颈癌的不良预后有关[6]。张保华等应用免疫组织化学方法(SP)法检测nm23-H1基因在41例宫颈癌组织、17例宫颈上皮内瘤样病变CIN和10例正常宫颈组织中的表达,分析其与临床病理特征的相关性发现,nm23-H1基因在宫颈癌组织中的阳性表达率与CIN及正常宫颈组织相比,差异均具有显著意义(P<0.05);同时,nm23-H1的阳性表达与宫颈癌的临床分期、组织类型病理分级无相关性(P>0.05)[7]。

3 NS-398结构特点与抑癌机制

3.1 NS-398结构特点

环氧合酶-2(cyclooxygenase-2 COX-2)过度表达可以促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进肿瘤血管形成,在肿瘤发生及发展中起重要作用。由于COX-2在肿瘤细胞高表达及在肿瘤细胞增殖、分化和转移等方面的重要作用,为用COX-2抑制剂治疗肿瘤提供了理论依据。

对甲磺基硝基苯环乙醚(NS-398)是磺胺类制剂衍生物,是一种选择性COX-2抑制剂。研究表明,NS-398可抑制人子宫内膜癌[8]、直肠癌[9]、膀胱癌[10]等肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。但目前,NS-398对宫颈癌细胞的作用尚不清楚。Krysan等认为,COX-2主要通过增强survivin1基因表达,抑制肿瘤细胞凋亡。随着对细胞凋亡研究的深入,人们逐渐认识到诱导细胞凋亡是治疗肿瘤性疾病的一种有效方法和手段[11]。

3.2 NS-398与宫颈癌

近年研究表明[12,13],COX-2在宫颈癌组织表达上调,且COX-2表达高低与宫颈癌的治疗效果和预后密切相关[14]。COX-2属于诱导型环氧合酶,是前列腺素(prosta PGS)生物合成过程中的重要限速酶,在正常组织细胞中不表达或低水平表达,当受细胞因子、生长因子、癌基因、内毒素、肿瘤促进剂等因素刺激,COX-2表达急剧增加,其活性可增加数十倍,参与多种病理生理过程。

nm23基因 第5篇

1 材料与方法

1.1 材料

实验自2014年2月开始, 2014年7月结束。C6细胞由华中科技大学免疫学教研室提供;nm23-H2抗体;抗MMP-2抗体, HRP-羊抗兔Lg G等均购自武汉博士德生物有限公司, 纤连蛋白、新生小牛血清及常规生化试剂、仪器设备均由三峡大学分子生物学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

大鼠C6细胞常规培养, 待其进入对数生长期后, 调整细胞培养浓度为1104~1105/m L, 并按nm23抗体加入的浓度分为对照组 (0 mg/L) 、低浓度组 (20 mg/L) 和高浓度组 (40 mg/L) 3组。20 h后收集细胞样品, 并加入0.4 m LRIPA裂解液, 取上清备用。

1.2.2 Western Blot法检测C6细胞中MMP-2蛋白

样品行SDS-PAGE, 电转移于PVDF膜上, 常规封闭液处理2 h, 依次加入一抗 (抗MMP-2抗体1∶2 000稀释, 和羊抗兔二抗 (1∶3 000) , 室温作用1 h后显影。Image J软件检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数。

1.2.3 免疫组化法检测C6细胞中MMP-2蛋白表达

调整C6细胞浓度为1104/m L, 依次加入不同浓度的nm23-H2抗体, 后依次滴加MMP-2一抗 (1∶200 0) 、Ig G二抗, 于室温孵育1~2h。后加入SABC试剂, PBS漂洗后DAB显色, 切片在高倍镜下观察并计数。

1.3 统计方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理, 所有数据以均数±标准差 (±s) 表示, 进行t检验。

2 结果

2.1 Western blotting法检测nm23-H2抗体对C6细胞MMP-2蛋白表达量及磷酸化的影响

如图1~4所示, 不同浓度nm23-H2抗体对MMP-2的表达量及磷酸化均有明显抑制作用, 随着浓度的增加, 其对MMP-2蛋白表达及磷酸化的抑制作用呈增强趋势。

图1、2所示, 随着nm23-H2抗体浓度的升高, MMP-2蛋白表达量及磷酸化均呈下降趋势, 图3、4均为内参。注:1为对照组, 2为低浓度组 (20 mg/L) , 3为高浓度组 (40 mg/L) 。

2.2 Image J软件检测各组MMP-2、磷酸化MMP-2、β-actin蛋白条带平均光密度比值均数

随nm23-H2处理浓度的增加, MMP-2蛋白及磷酸化MMP-2/β-actin光密度比值呈下降趋势, 3组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

注:与对照组比较, *P<0.05;与低浓度组比较, △P<0.05。

2.3 免疫组化法检测nm23-H2抗体对胶质瘤细胞MMP-2表达的影响

随nm23-H2处理浓度的增加, 细胞MMP-2阳性细胞数减少, 且效果与剂量呈正相关。3组相互比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

注:与对照组比较, *P<0.05;与低浓度组比较, △P<0.05。

3 讨论

现已发现, Rho-GTPases/nm23是一种新近发现的脑胶质瘤信号通路, 该通路所涉及的蛋白表达量与细胞的恶性程度密切相关。已证实, 通路中的核心蛋白nm23-H2具有3种酶的活性作用:组氨酸蛋白激酶、二磷酸核苷激酶、3'-5'核酸外切酶活性[2]。对多个胞内外蛋白存在影响[3]。该结果显示, MMP-2表达量及其磷酸化程度随nm23-H2抗体浓度的增高呈降低趋势, 表现为剂量依赖性关系, 且差异有统计学意义 (P<0.05) 。目前研究认为, 在众多肿瘤的恶性生长过程中, MMP-2的激活是最关键的环节之一。其本身磷酸化的程度直接关系到蛋白的活性状态, 与MMP-2部分基团的甲基化同等重要[4]。在该研究结果提示MMP-2可能受nm23-H2上游的干扰和调控。免疫组化的结果显示:对照组MMP-2阳性细胞数为 (61.60±6.60) %, 低浓度组为 (31.00±5.94) %, 高浓度组为 (17.57±6.15) %, 3组相互比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。与Western检测结果基本吻合。国内外其他学者也发现, 当有效抑制nm23-H2活性后, 可明显抑制肿瘤细胞向周围组织的侵袭。由于nm23-H2在细胞内的浓度不同, 对肿瘤细胞中MMP-2的干预作用自然不同[5]。MMP-2在胞浆升的高表达往往提示肿瘤可能早期就已侵袭正常组织。其次, 在胶质瘤的生长微环境下, 随着MMP-2等蛋白表达的增强, 不仅可以增强细胞自身的侵袭性生长, 并可以诱导细胞基质的广泛破坏, 二者之间可以相互作用, 共同促进肿瘤细胞恶性生物学行为[6]。该实验研究也同样证明了这一点。

其他学者通过免疫组化等方法证实:nm23-H2与同家族的nm23-H1不同, 其关键点在于:nm23-H2可通过结合C-myc基因启动子中的NHE III1区域的G4序列, 从而激活C-myc[7,8]。通过后者进一步完成相应的生物学作用。该实验中, 将不同浓度的nm23-H2抗体与C6细胞共培养, 研究在Rho-GTPases/nm23通路中, nm23-H2所能发挥的作用。该研究证实, nm23-H2抗体通过对nm23-H2的抑制, 可以在一定程度上, 降低MMP-2蛋白的表达及磷酸化程度, 表明nm23-H2与MMP-2蛋白之间必然存在某种联系, 说明二者很有可能在上游蛋白水平存在调控机制, 基因水平的调控及转录后的修饰过程中可能存在影响, 有待我们后期进一步研究。

参考文献

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[2]李宗河, 何学令.腺病毒介导的nm23-h1对人恶性黑色素瘤A375体外抑制作用的研究[J].国外医生, 2012, 32 (6) :273-278.

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[4]管孝臣, 秦文星.肿瘤转移抑制基因的作用及临床意义[J].实用临床医药杂志, 2014, 15 (7) :142-144.

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[6]汤少鹏, 梁庆正.食管癌患者血清中MMP-2和MMP-9的含量及其临床意义[J].中国实用医刊, 2013, 40 (8) :35-37.

[7]吴立权, 郭振涛.脑胶质瘤细胞化疗耐药中p38MAPK信号通路的作用[J].肿瘤防治研究, 2014, 41 (7) :737-739.