肝细胞增殖范文

肝细胞增殖范文（精选10篇）

肝细胞增殖 第1篇

骨形态发生蛋白(BMP)和其激活素膜结合抑制剂(BMP and activing membrane-bound inhibitor,BAMBI)与转化生长因子(TGF)超家族Ⅰ型受体结构相似,但其胞内缺乏丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。BAMBI与TGF超家族Ⅰ型受体易形成异源二聚体,阻断TGF-β和BMP的信号传递,所以又称为TGF超家族的伪受体[6,7]。而TGF-β可激活静息状态下的HSCs,导致细胞外基质不断产生和沉积[8],进一步促进肝纤维化的发展[9,10],因此BAMBI可能通过对TGF-β的调节在肝硬化发病过程中起到一定的作用。

近年来,微小RNA-520(miR-520)已被证明在多种细胞内发挥重要的生物学调节作用,如细胞增殖、凋亡、代谢等。邓玲等[11]研究表明,miR-520在胃癌组织中的表达显著上升,暗示其可能参与了胃癌的发生过程。在乳腺癌中,miR-520/373家族可以通过抑制TGF-β信号通路来抑制肿瘤细胞的进展及代谢[12];Kan等[13]研究表明,miR-520在肝癌中的表达显著上升,并且通过靶向调节哺乳动物类似基因(Smad)7促进癌症的发生,但其在肝硬化中的作用及其具体的作用机制尚未见报道。因此本研究旨在观察miR-520在肝硬化的发生发展过程中对HSCs增殖的影响,并进一步探索其潜在的作用机制,以期为肝硬化治疗提供新的靶点及理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SD大鼠30只,体重150～180 g,购自南京君科生物工程有限公司;四氯化碳(CCl4)分析纯购自北京化学试剂公司,使用前用精制橄榄油配成40%的CCl4油溶液。HSC-T6细胞购自上海赛默生物科技发展有限公司;DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、四甲基偶氮唑盐(MTT)等购自生工生物工程(上海)股份有限公司;Trizol,LipofectamineTM2000等购自Invitrogen公司;反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒等购自TaKaRa公司。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、TGF-β1、Smad3以及Smad7等一抗均购自Abcam公司。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 大鼠及肝硬化模型的建立

具体方法参照桂金秋等[14]所描述。第1天将CCl4原溶液(每100 g体重注射0.5 ml)于皮下注射于大鼠体内,然后每隔3 d每100 g体重皮下注射0.3 ml CCl4油溶液(40%油溶液),共持续6周。本研究取得了陕西省康复医院伦理委员会的批准,所有动物均在实验结束后实施安乐死。

1.2.2 HE染色

建模成功后,取大鼠肝脏组织用PBS溶液充分清洗,以100 g·L-1中性甲醛固定,石蜡包埋并切片,加入苏木精-伊红(HE)染色,于光镜下观察。

1.2.3 实时荧光定量PCR

按照Trizol法提取肝脏组织总RNA,利用反转录试剂盒进行cDNA的合成。并按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR,引物序列为:mmiR-520:5'-TCTACAAAGG GAAGCCCTTTCTG-3';BAMBI:5'-CCGTGCTGCTCACC ATGA-3',5'-ATACCTGTTTCCTTGTCCTGA-3';β-肌动蛋白:5'-ACCTGACTGACTACCTCATG-3',5'-GCAGCC GTGGCCATCTCTTG-3'。反应程序为:94℃5 min预变性;94℃30 s,60℃34 s,72℃30 s,40个循环。目的基因表达量按照2-ΔΔct法计算。miR-520及BAMBI的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 miR-520模拟物及miR-520抑制剂转染

HSC-T6细胞实验分组为对照组、miR-520模拟物组、模拟物对照组、miR-520抑制剂组、抑制剂对照组。miR-520模拟物、模拟物对照、miR-520抑制剂、抑制剂对照均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。HSC-T6细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基中,于37℃、5%CO2培养箱中培养。然后取对数生长期的HSC-T6细胞,以每孔1×104个接种于96孔培养板,培养24 h后,按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行转染,转染剂量根据前期预实验得到,为200 nmol·L-1,每组均重复6孔。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖

分别在转染后24、48、72 h后加入20μl MTT溶液,继续孵育4 h后弃上清,加入150μl DMSO溶液使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上检测各孔490 nnm处的吸光值。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测

实验分组为miR-520模拟物与BAMBI野生型共转染组、模拟物对照与BAMBI野生型共转染组、miR-520模拟物与BAMBI突变体共转染组、模拟物对照与BAMBI突变体共转染组。TargetScan Human 7.0软件预测得到miR-520为BAMBI的靶向调节基因,并构建BAMBI的种子区突变表达载体。取对数期生长的细胞以每孔1×104个的密度接种于96孔培养板,然后按照所述组别进行转染,miR-520模拟物、模拟物对照的转染浓度为200 nmol·L-1,BAMBI野生型及BAMBI突变体的转染浓度为50 nmol·L-1。24 h后根据荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行活性检测。

1.2.7 蛋白质印迹

取对数期生长的细胞,以每孔2×105个的密度接种于6孔培养板中,分别转染miR-520抑制剂及miR-520抑制剂对照,并重复3次独立实验。48 h后弃掉培养基,用PBS溶液清洗,然后每孔加入200μl RIPA裂解液,再将细胞放于冰上30 min后,12 000×g离心10 min。取30μg总蛋白先于10%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,再转移至聚偏氟乙烯膜上,经5%脱脂奶粉封闭后,加入相应的一抗于4℃孵育过夜,α-SMA抗体(1:1 000稀释);COL-I抗体(1:250稀释);TGF-β1抗体(1:2 000稀释);Smad3抗体(1:1 000稀释);Smad7抗体(1:1 000稀释)。最后加入二抗,室温孵育1 h后利用ECL液显影,扫描仪中成像。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析,所有数据均以均数±标准差表示。两组间均数比较用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝脏组织学染色

对比HE染色检测正常肝组织和肝硬化模型组织(图1)发现:正常组肝小叶结构完整,肝细胞索排列整齐,大小形态一致;模型组肝细胞浆出现大量空泡,肝细胞索排列紊乱,而且中央静脉区纤维间隔变大,出现假小叶。

2.2 大鼠肝硬化模型中miR-520及BAMBI的表达水平

实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比较,肝硬化模型组中的miR-520表达水平显著上升,BAMBI表达水平却显著下降(P<0.05),见图2。

2.3 miR-520对HSC-T6细胞增殖的影响

为了进一步研究miR-520对HSC-T6细胞增殖的影响,我们将miR-520转染到HSC-T6细胞。MTT法检测结果显示,与对照组比较,miR-520模拟物转染HSC-T6细胞48、72 h后,能够显著促进细胞的增殖,miR-520抑制剂可显著抑制细胞的增殖,P<0.05,见图3。

2.4 miR-520抑制剂对HSC-T6细胞中α-SMA、COL-I表达的影响

从上一步结果可知,miR-520抑制剂可显著抑制肝纤维化的形成,因此我们进一步研究了miR-520抑制剂对细胞外基质过渡沉积和纤维化的常用指标α-SMA、COL-I表达的影响。蛋白质印迹结果表明,与对照组相比较,miR-520抑制剂可显著抑制α-SMA、COL-Ⅰ等的表达(P<0.05),见图4。

2.5 miR-520靶向调节BAMBI

Targetscan软件预测得到has-miR-520可结合到BAMBI mRNA的3'UTR区域。荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-520模拟物转染HSC-T6细胞后,荧光素酶活性显著下降(图5A)。miR-520模拟物转染HSC-T6细胞后,可显著降低BAMBI的表达,miR-520抑制剂可显著增加BAMBI的表达(P<0.05,图5B)。

2.6 miR-520抑制剂抑制TGF-β/Smad通路

为了进一步研究miR-520抑制剂抑制HSC-T6细胞增殖的作用机制,我们检测了其对TGF-β/Smad信号通路蛋白的影响。蛋白质印迹结果显示,miR-520抑制剂转染HSC-T6细胞后,与对照组比较,TGF-β1、Smad3的表达显著下降,Smad7表达显著上升(P<0.05),见图6。

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的中心环节。近年来研究发现,肝纤维化可以逆转,肝硬化则难以逆转[15]。正常情况下,HSCs处于静止状态,而在肝脏受到物理、化学及病毒感染等因素的刺激时,HSCs会被激活并持续增殖,导致细胞外基质合成与降解失衡,并在肝脏内异常沉积,最终形成肝硬化甚至肝癌[16]。因此,抑制HSCs的增殖并且减少细胞外基质的生成是治疗肝硬化的重点。

α-SMA只在活化的HSCs中表达,被视为是HSCs活化的指标[17,18],COL-Ⅰ是细胞外基质的主要成分[19,20],二者常被作为肝纤维化发生的重要检测指标。本研究结果表明,miR-520在大鼠肝硬化组织中的表达显著升高,当miR-520抑制剂转染HSC-T6细胞后,HSC-T6细胞的增殖能力显著下降,而且α-SMA与COL-I的表达也显著下降,说明抑制miR-520的表达可以抑制HSCs的增殖及细胞外基质的生成。

有研究报道,BAMBI参与了肝纤维化的发生过程。如TLR4可以通过下调静息状态下HSCs中的BAMBI表达,从而增加TGF-β所介导的HSCs的活化与胶原的产生[21];本研究结果表明,在肝硬化模型组织中,BAMBI的表达显著下降,且为miR-520的靶向基因,抑制miR-520的表达后,BAMBI的表达显著上升,说明miR-520对HSCs的抑制作用是通过靶向调节BAMBI来实现的。

TGF-β及其信号通路已成为抗纤维化的主要靶点[9]。TGF-β在活化的HSCs中的表达显著增加[22];而Smad7是TGF-β1信号转导的抑制分子,能与Smad3竞争结合TGF-β1型受体,阻断Smad3被磷酸化及转位到细胞核,抑制TGF-β1信号转导[23]。另外有研究表明,BAMBI在肝纤维化组织中可以抑制TGF-β信号通路[21],本研究结果与其一致,miR-520抑制剂转染HSC-T6细胞后,BAMBI表达显著上升,TGF-β1、Smad3的表达也显著下降,Smad7的表达显著上升,因此,miR-520抗肝纤维化的作用机制可能是通过靶向上调BAMBI的表达,进而抑制TGF-β/Smad信号通路,最终抑制HSCs的增殖来实现的。

综上所述,本研究证明肝硬化HSCs中BAMBI的表达受miR-520的影响,且初步揭示了miR-520及BAMBI在肝硬化发生发展过程中的作用机制,为肝硬化治疗提供了新的理论基础。

摘要：目的:研究微小RNA-520(miR-520)对肝硬化过程中肝星状细胞增殖的影响及其作用机制。方法:采用CCl4法建立大鼠肝硬化模型,实时荧光定量PCR法检测肝脏组织中miR-520及骨形态发生蛋白(BMP)和其激活素膜结合抑制剂(BAMBI)的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测miR-520模拟物及抑制剂对肝星状细胞HSC-T6增殖的影响,双荧光素酶报告基因法检测miR-520与BAMBI的靶向关系,蛋白质印迹法检测miR-520抑制剂转染后BAMBI、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、转化生长因子β1(TGF-β1)、哺乳动物类似基因(Smad)3和Smad7的表达。结果:在大鼠肝硬化模型中,miR-520表达显著上升,BAMBI表达显著下降。MiR-520抑制剂可显著抑制HSC-T6细胞的增殖,miR-520模拟物作用则反之。而且miR-520模拟物转染可显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度(P<0.05)。蛋白质印迹结果表明,miR-520抑制剂可显著增加BAMBI和Smad7的表达,降低α-SMA、COL-1、TGF-β1、Smad3的表达。结论:miR-520抑制剂通过靶向上调BAMBI的表达,抑制TGF-β/Smad信号通路,进而抑制HSC-T6细胞的增殖,并且可能对肝硬化起到缓解作用。

《细胞的增殖》教案 第2篇

细胞的分裂

●教学过程

[课前准备]

教师准备一对染色体在有丝分裂过程中变化的模型剪贴图。如图612。

图611染色体的复制图612着丝点分裂，姐妹染色单体分开成两条染色体

学生用橡皮泥制作染色体的模型，以供上课用。

[情境创设]

教师：上节课我们观察植物细胞的有丝分裂，观察到的细胞是死的还是活的?为什么?

学生：是死的，解离的时候已经把细胞杀死了。

教师：为什么要对视野中的细胞进行计数?

学生：因为细胞已经被杀死，我们不能观察到细胞分裂的动态过程，只能用看到的视野中细胞的多少来说明细胞分裂的某个时期的长短。

教师：同学们回答得很精彩(掌声鼓励)。下面我们就一起来认识有丝分裂的过程。

[师生互动]

教师演示有丝分裂细胞周期的动画课件。

学生观察。

教师引导学生总结：

有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式。细胞进行有丝分裂具有周期性。即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期。

教师：同学们上节课的实验结果怎样呢?

学生：根据实验的计数，我们发现：细胞分裂间期的细胞最多，大约是其他各期细胞的8倍。

教师：非常好!引导学生观察课本p112表61不同细胞的细胞周期持续的时间(t/h)。在细胞周期里，哪一个时期长?

学生：细胞分裂间期。

教师：细胞分裂间期有什么特点呢?

教师和学生一起总结：从细胞在一次分裂结束之后到下一次分裂之前，是分裂间期。细胞周期的大部分时间处于分裂间期，大约占细胞周期的90%～95%。分裂间期为分裂期进行活跃的物质准备，完成dna分子的复制和有关蛋白质的合成，同时细胞有适度的生长。

教师：dna分子和蛋白质实际上是什么?

学生：染色质，也是染色体。

学生：用橡皮泥操作染色体的复制。

教师：用先剪好的剪贴图在黑板上贴出染色体复制图。如课前准备的图(一)。细胞分裂间期的活动是非常活跃的，它为细胞的分裂提供了物质的准备。这时候细胞核内染色体数目和状态如何?

学生：(1)染色体经复制成两条染色单体连于一个着丝点，形态为丝状，为染色质。见课本p113图64。

(2)染色体数目与分裂前比较数目不变，但dna数目加倍。

教师：下面我们一起结合同学们上一节课的实验来分析细胞的分裂期。人们为了研究的方便，把分裂期分为四个时期：前期、中期、后期、末期。下面以高等植物为例，认识有丝分裂的过程。

学生：观察课本p112图62，课本p113图63。

教师：用flash动画演示细胞分裂的前期。这是什么时期?染色体有哪些变化?

学生：(1)细丝状的染色质高度螺旋化，形成染色体。(2)核仁、核膜解体、消失。(3)出现纺锤丝，构成纺锤体。

学生用橡皮泥操作染色质染色体，教师引导学生总结：

细胞分裂前期的特征：

(1)核膜、核仁解体消失。

(2)纺锤体和染色体形成。(两消失，两出现)

(3)每条染色体会分开成为两条姐妹染色单体，染色体排列无序。

教师：用flash动画演示细胞分裂的中期。这是什么时期?这个时期的明显标志是什么?(引导学生根据染色体形状、数目、位置归纳特点)共3页，当前第1页123

学生：(1)染色体形态固定，数目清晰，着丝点与纺锤丝相连。

(2)染色体数目与前期、间期相同。

(3)染色体位置染色体的着丝点排列在细胞中央的赤道板上。

教师引导学生总结：

细胞分裂中期的特征：

(1)染色体缩得最短、最粗。

(2)染色体有规律地排列在赤道板上。

教师：用flash动画演示细胞分裂的后期。这个时期又有什么特点呢?用剪贴图操作。

学生：用橡皮泥操作着丝点分裂，一条染色体中的两条姐妹染色单体分开成为两条染色体。

教师：要求学生数一数这时细胞核中有多少染色体，并与间期、前期、中期作比较。

学生：(1)染色体形态每条染色体分开，无姐妹染色单体。

(2)染色体位置移至细胞的两极。

(3)染色体数目比间、中、前期加倍(因着丝点分裂加倍)。

教师引导学生总结：

细胞分裂后期的特征：

(1)着丝点分裂为二，姐妹染色单体分开成为染色体。

(2)染色体移至细胞的两极。

(3)染色体数目加倍，dna数目不变。

教师：用flash动画演示细胞分裂的末期。最后指导学生概括末期的特点，注意与前面各期对比。

学生：(1)染色体形态染色质呈丝状。

(2)染色体数目与间期、前期、中期细胞中相同。

(3)染色体位置散乱分布在细胞核中。

教师引导学生总结：

细胞分裂末期的特征：

(1)染色体成为丝状染色质。

(2)核仁、核膜出现。(两出现，两消失)

(3)细胞板形成，将一个细胞分裂成两个子细胞。

(4)染色体数目和dna数目都恢复原样。

(5)大多数子细胞进入下一个细胞周期的分裂间期状态。

[课堂反馈]

教师：下面我们一起来探讨动物细胞的有丝分裂，其实动物细胞的有丝分裂与植物细胞的分裂是有很多相似之处的，现在我们一起来观察它们的异同。用多媒体课件演示动物细胞有丝分裂和植物细胞有丝分裂的过程，提醒学生对照观察、分析比较。

学生：通过对比图中各时期变化特征，找出动植物细胞有丝分裂过程的异同点;学习通过观察分析得出结论，由推荐生回答教师问题。

教师和学生：

(1)相同点：

a、动植物细胞分裂过程染色体变化规律，即各时期特征相同。

b、动植物细胞有丝分裂过程经染色体复制，然后平均分配到两个子细胞的结果是相同的。

(2)不同点：主要有两点。

银幕显示：

动植物细胞有丝分裂过程不同点

植物细胞的有丝分裂

动物细胞的有丝分裂分裂

分裂前期(纺锤体的形成)

由细胞两极发出许多纺锤丝，纵行排列在细胞中央，形成梭形的纺锤体

中心体复制形成两组中心粒，分别移向细胞两极，两个中心粒发出星射线，在两组之间的星射线形成纺锤体

分裂末期

在细胞赤道板位置形成细胞板，并向周围扩展形成细胞壁，将细胞质分成两部分两个子细胞

不形成细胞板，细胞膜从细胞中部向内凹陷，最后将细胞质缢裂成两部分，其结果形成两个子细胞

学生：阅读教材p113最后一自然段。

教师：要求学生理解有丝分裂的特征、意义，并能回答问题。

银幕显示检测题：

细胞有丝分裂的重要特征是：亲代细胞的染色体_______后，________到两个子细胞中去。由于染色体上有________，因而在生物的__________之间保持了__________的稳定性。可见，

细胞的`有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。

答案：经过复制平均分配遗传物质亲代和子代遗传性状共3页，当前第2页123

教师：除了细胞的有丝分裂，还有其他的分裂方式吗?

学生：减数分裂和无丝分裂。

教师：无丝分裂是最简单的分裂方式。进行无丝分裂的生物是不多的，通常是单细胞生物，特别是原生动物的生殖方式，例如草履虫、变形虫主要靠这种方式进行。无丝分裂在高等生物中也较普遍存在，而且是一种分裂方式。主要是高度分化的细胞，例如肝细胞，肾小管上皮细胞等。无丝分裂的过程如何，有什么特点呢?请同学们回答。要求学生阅读教材p114第二自然段。

教师：银幕显示：草履虫的无丝分裂图、蛙的红细胞的无丝分裂图。

学生：分裂过程中没有纺锤丝和染色体出现。

[教师精讲]

通过今天的学习，同学们深刻认识到每种植物细胞和每种动物细胞，在有丝分裂过程中，都有这样的共同特征：染色体经过自我复制，然后平均分配到两个子细胞中去，使每个子细胞核中都含有与上代细胞数目相同、种类相同的染色体。例如高等动物体组织中，已分化组织在不断丧失的情况下，不断地进行有丝分裂，就角化的皮肤而言，不断地发生上皮细胞的有丝分裂，以提供恒定的细胞供应，因此它的意义就在于保证了动物染色体上遗传物质的相对稳定，从而对保持生物体前后代遗传性状的稳定性起了很大作用。另外，细胞有丝分裂的知识也是研究生物遗传规律的必要基础。

[课堂小结]

本节课主要认识真核细胞有丝分裂的过程，落实有丝分裂过程中dna和染色体的规律性变化。如下：

含四条染色体细胞为例

细胞周期

比较项目

间期

分裂期

前期

中期

后期

末期

dna含量(个)

48(逐步复制)

8

8

8

84

染色体数(条)

4

4

4

48

84

染色单体数(条)

08

8

8

0

0

纺锤体

无

出现

最清

较清

消失

[布置作业]

1、p114的练习一基础题1～5。

2、以体细胞里含有4条染色体为例，画一个处于有丝分裂中期的植物细胞。

《细胞增殖》第1课时 第3篇

（一）教学内容的地位

《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位——细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。

（二）教学目标

1、知识目标

知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。

识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。

应用有丝分裂过程各时期的特点。

2、能力目标

1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。

2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目DNA含量变化，培养学生的分析能力。

3）情感目标

细胞分裂——运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。

（三）教学重点、难点

1、教学重点

真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。

2、教学难点

真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。

二、教学对象分析

首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。

三、教学时间安排

由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。

四、教法和学法

学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教学中，采用自学法、讨论法和讲授法相结合，以问题贯穿本堂课，激发学生的求知欲，充分利用插图、挂图、坐标图，把抽象、微观的有丝分裂过程，形象、生动的展现在学生眼前，通过学生自己的阅读、比较、归纳获取知识，培养学生的识图能力、分析能力。

五、教学过程

（一）新课引入

回忆第一节学习了细胞的结构和功能，细胞是生命活动的基本单位，但大多数生物是由很多细胞构成，细胞的数目是如何增殖的呢？引入细胞增殖、板书课题（通过简洁地提问，引入新课，激发起学生的求知欲）。

（二）新课学习

1、细胞增殖的方式、意义

提问：细胞以什么方式增殖，真核细胞的分裂方式有几种？哪几种？增殖有何意义？

阅读教材第一、二自然段，并思考提出的问题，在教材中勾划出相关内容。给2分钟时间，抽同学回答并点评。（培养学生的自学能力，语言表达能力）

2、有丝分裂

有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式，用以增加体细胞数量，体细胞进行有丝分裂具有周期性，也就是具有细胞周期引出。

1）细胞周期

细胞周期的概念是什么？请同学阅读教材，并引导学生分析概念，是不是所有在分裂的细胞都有细胞周期？一个细胞周期的起点在哪儿？止点在哪儿？（以问题促进学生思考，培养学生的问题意识，进行探究学习，突破重点）

然后阅读插图2-19有丝分裂细胞周期图，引导学生得出一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期，结合起止点，知道分裂间期在前，分裂期在后，从弧线的长短上得出时间的长短，并用表2-1不同细胞的细胞周期持续时间来反证。追问：各阶段有何特点？对于植物细胞和动物细胞而言，它们是否一样？我们先分析植物细胞有丝分裂的特点引出：

2）植物细胞有丝分裂各时期的特点。

①分裂间期

利用挂图指出间期图例，观察结构，提问是不是间期就是“间歇期”？讲述完成DNA复制和有关蛋白质合成，回忆染色质的主要成分，说明实质是进行染色体复制，但并未分开仍由一个着丝点连在一起，画图 ：由一个着丝点连着的两结构称为姐妹染色单体，染色体数目不变。

②分裂期

人为地分为了四个时期：前、中、后、末。

前期：比较挂图上间期与前期的区别，学生自由交流。

老师归纳两出现两消失，中期：与前期比较，后期：与中期比较，末期：与后期比较。

依次进行，指导学生重点在于分析染色体的变化，老师用一、二句精炼的话归纳，并在黑板上画出特点（让学生把不易看见的变化与看得见的图结合起来，抓住特点，便于记忆，理解、突破重点、难点）。

然后，老师与学生一起对照挂图来描述变化过程，学生复述（通过重复强化学生记忆过程）。

分裂中染色体和DNA数量变化有何规律？用坐标图来反映，老师建立一个坐标图，引导学生据过程一起分析，得出染色体变化曲线。练习，由学生自己按照上述思路绘DNA变化曲线，抽一位同学到黑板前绘制，其他同学在草稿纸上绘，最后点评。（用坐标图更能直观反映出变化过程，引导学生分析，并知道变化规律的由来，加深对过程的理解，让学生积极参与到获取知识的过程中体验快乐）

（三）小结

指出重难点：细胞周期的概念，各时期的特点。（让学生明确需要掌握的内容）

（四）作业布置

预习动物细胞有丝分裂的过程，思考动物细胞有丝分裂与植物细胞有丝分裂有何异同。

（五）板书设计

第二节细胞增殖

一、细胞增殖方式、意义

二、有丝分裂

1、细胞周期

2、植物细胞有丝分裂过程

①分裂间期：DNA复制，有关蛋白质合成，形成姐妹染色单体

②分裂期有：

前：两出现，两消失

中：着丝点排在赤道极上

后：着丝点分裂，拉向两极

肝细胞增殖 第4篇

TLRs是一类天然免疫受体家族, 在机体的固有免疫反应中起重要作用。TLRs是一种模式识别受体, 能够识别不同的损伤相关分子模型 (damage-associated molecular patterns, DAMPs) 和病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) [5]。在肿瘤的发生发展过程中, 伴随肿瘤细胞的凋亡、坏死及胞吐 (exocytosis) , 有大量的DAMPs和PAMPs释放。越来越多的证据表明, TLRs通过识别肿瘤组织中的DAMPs和PAMPs参与包括肝癌在内的多种炎症相关肿瘤的发生和发展[6]。近年来在肝癌组织中TLRs的表达情况受到关注, 现有研究已经证实肝癌组织中TLR2和TLR4均有表达, 并且影响肝癌细胞的增殖等生物学行为[7]。但是, 目前关于TLRs在癌旁组织中的表达情况结论并不一致, TLRs表达与不同增殖相关蛋白表达的关系亦无定论[8]。

由于TLRs及其下游信号转导通路在炎症免疫、肿瘤免疫及肿瘤发生发展过程中发挥的重要作用已经成为治疗的潜在靶点。但新的治疗策略必须建立在对TLRs作用机制更清晰地揭示和更深入地理解的基础之上, 因此关于TLRs在肿瘤发生发展过程中的作用成为研究的热点。本实验通过免疫组化检测TLR2和TLR4蛋白在肝癌组织及癌旁组织中的表达, 并采用Western-blot与Real-time RT-PCR实验方法检测正常肝组织和肝癌组织中TLR2、TLR4和Cyclin D1、p70s6k等增殖相关因子蛋白及m RNA的表达, 以探讨TLR2、TLR4与各增殖相关因子在肝癌组织中表达的相关性, 并结合其表达与临床病理参数之间的关系, 初步探讨TLR2和TLR4在肝癌组织中表达的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及来源

鼠抗人TLR2多克隆抗体和鼠抗人TLR4多克隆抗体购于Abcam公司, 鼠抗人p70s6k多克隆抗体购于Cell signaling公司。兔抗人Cyclin D1多克隆抗体和鼠抗人Ki67单克隆抗体购于北京中杉生物技术有限公司。鼠抗人多克隆GAPDH抗体购于Sigma公司。HRP标记的羊抗鼠Ig G和HRP标记的羊抗兔Ig G购于武汉博士德生物有限公司。免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。PCR引物、DNA分子量标准和Real-time RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司。其他试剂如二甲苯、乙醇等化学试剂购自国药集团。显微镜购自Lesia。

1.2 标本及临床资料

收集中国医科大学附属盛京医院2008年3月-2010年9月手术切除102例肝癌标本。所有标本均经病理确诊为肝细胞癌, 术前均未进行化疗和放疗治疗。其中男性59例, 女性43例, 年龄在39~79岁之间, 平均55岁。组织学分化分级:高分化例43, 中分化例41例, 低分化18例。淋巴结转移35例, 未转移67例。按国际抗癌联盟 (UICC) 分期标准进行分期, I期+II期66例, III期+IV期36例。肝癌标本均为乙型肝炎病毒阳性, 同时取材癌旁组织标本 (距离肿瘤>2 cm) 作为炎症组织对照。102例肝癌病例均有完整的随访资料, 无复发生存时间的计算从手术日期到发现复发和转移的日期或随访日期 (2012年9月) 。术后半年内每3个月、半年后每6个月复查1次AFP、B超或CT。收集同期肝血管瘤瘤旁肝组织 (距离肿瘤>1 cm) 标本17例作为正常肝组织对照, 均无肝炎和肝硬化。102例肝癌组织标本手术取材后经甲醛固定, 常规脱水、包埋, 以供免疫组化分析。其中, 60例肝癌组织标本和17例肝血管瘤组织标本具备手术时立即取材的新鲜冰冻组织标本, 置液氮冷却后送-70℃冷冻冰箱保存, 以供Western-blot与Real-time RT-PCR检测。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化分析

所有标本蜡块做4μm连续切片, 用二甲苯及乙醇脱蜡处理, PBS洗片后, 用羊血清工作液封闭30 min, 分别加入TLR2、TLR4和Ki67抗体37℃孵育45 min, 生物素标记的二抗37℃孵育40 min, PBS洗片后DAB显色, 苏木精复染, 组织透明, 树胶封片。每次检测均以0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。

SP法免疫组化染色及结果判定:阳性判断标准以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性, 评分标准采用综合评价法, 每张切片随机观察100个细胞。染色范围评分标准:无阳性细胞为0分, 0%~30%阳性细胞为1分, 31%~60%阳性细胞为2分, >60%阳性细胞为3分。染色强度评分标准:无染色为0分, 染色颗粒黄、细、成堆为1分, 染色颗粒深黄、粗、成片为2分, 染色颗粒棕黄、粗大、成片为3分。两个评分相加即为肿瘤细胞的免疫组化染色得分, 0~3分为低表达, 4~6分为高表达[9]。

组织病理学评估:所有的切片苏木精-伊红染色结果均有两位病理专家独立观察, 在不了解患者其他临床数据情况下, 评估不同抗体的表达情况以及肿瘤分化程度, 如二者出现不一致, 则由另一位病理专家再次观察得到最终结果。

1.3.2 免疫印迹实验 (Western blot)

取蛋白样品30μg~0.5 m L EP管内, 加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×, 混匀后于沸水中煮5 min使蛋白变性。取蛋白上样进行SDS-PAGE, 以内参GAPDH作为蛋白上样量标准品。配制10%分离胶及4%浓缩胶进行电泳。恒压100 V×120 min。电泳后湿转至PVDF膜, 恒压50 V×120 min。转膜结束后, 小心取出膜至干净的玻璃平皿内, 以TBST缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Na Cl和0.05%Tween-20) 洗5 min×3次, 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜。弃去封闭液, TBST洗5 min×3次, 加入抗TLR2多克隆抗体 (1∶1 000, Abcam公司) 、抗TLR4多克隆抗体 (1∶2 000, Abcam公司) , 抗Cyclin D1多克隆抗体 (1∶1 000, 北京中杉生物有限公司) , 抗p70s6k多克隆抗体 (1∶1 000, Cell signaling公司) , 抗GAPDH多克隆抗体 (1∶2 000, Sigma公司) , 置4℃过夜。TBST摇床清洗5 min×5次, 最后加入HRP标记的相应二抗, 采用底物增强化学发光ECL法显色, 并利用软件Quantity One (BIO-RAD公司) 进行灰度分析。

1.3.3 Real-time RT-PCR

用Trizol试剂提取各组肝癌组织总RNA, 逆转录成c DNA第1链, 然后以c DNA为模板, 分别对TLR2基因、TLR4基因、Cyclin D1基因, p70s6k基因进行Real-time RT-PCR反应。反应体系为:c DNA 1μL, 20μmol/L的上下游引物各0.5μL, d NTP混合液3μL, Taq DNA聚合酶3 U, Mg Cl2溶液3μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, SYBR Green I 6.25μL, 去离子水补至25μL。PCR扩增条件94℃变性5 min, 35个PCR循环 (94℃20 s;58℃20 s;72℃20 s) , 72℃延伸5min, 75℃时检测荧光信号, 绘制标准曲线。引物序列见表1。根据绘制的标准曲线得到TLR2基因、TLR4基因、Cyclin D1基因及p70s6k基因表达的相对浓度, 以目的基因与GAPDH相对浓度的比值来反映目的基因的表达量。每个样品做2个平行管, 实验重复3次。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析, 分别采用秩和检验、Spearson相关分析、Kaplan-Meier法生存分析和多因素Cox比例风险模型进行分析。P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

2.1.1 染色情况

图1所示, TLR2和TLR4蛋白阳性染色主要位于细胞膜, 细胞质亦有少量表达。Ki67蛋白阳性染色主要位于细胞核。所有肝癌组织标本均可见TLR2和TLR4表达, 其中TLR2蛋白高表达33例 (32.4%) , 低表达69例 (67.6%) ;TLR4蛋白高表达42例 (41.2%) , 低表达60例 (58.8%) ;Ki67蛋白高表达40例 (39.2%) , 低表达62例 (61.8%) 。癌旁组织中TLR2蛋白高表达13例 (12.7%) , 低表达89例 (87.3%) ;TLR4蛋白高表达9例 (8.8%) , 低表达93例 (91.2%) ;Ki67蛋白高表达14例 (13.8%) , 低表达88例 (86.3%) 。正常肝组织中TLR2和TLR4蛋白仅有极低量的表达。TLR2、TLR4和Ki67蛋白在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织和正常肝组织。

A~C: (DAB×200) TLR2、TLR4和Ki67蛋白在低分化肝癌组织中的表达;D:HE;E~G: (DAB×200) TLR2、TLR4和Ki67蛋白在高分化肝癌组织中的表达;H HE;I~K (DAB×200 TLR2、TLR4、Ki67蛋白在癌旁组织中的表达;L:HE;M~O: (DAB×200) TLR2、TLR4、Ki67蛋白在正常肝组织组织中的表达;P:HE

2.1.2 肝癌组织中TLR2和TLR4蛋白表达与临床病理参数的关系

从表2中可以看出, 肝癌组织中TLR2、Ki67蛋白的表达均与肝癌的分化程度呈正相关 (r=0.355, P<0.05;r=0.263, P<0.05) , 即低分化的肝癌组织中TLR2、Ki67蛋白的表达均高于高分化的肝癌组织。肝癌组织中TLR4蛋白的表达与肝癌的分化程度无关 (r=0.096, P=0.338) 。三者的表达均与肝癌患者年龄、性别和肿瘤大小等临床病理参数无关。

注:1) TLR2蛋白表达与TNM分期相关, r=2.263, P=0.008;2) TLR2蛋白表达与肿瘤分化程度相关, r=0.355, P=0.000;3) TLR2蛋白表达与Ki67蛋白表达相关, r=0.518, P=0.000

2.1.3 肝癌组织中TLR2、TLR4与Ki67表达的关系

肝癌组织中TLR2蛋白的表达与Ki67蛋白的表达呈正相关 (r=0.518, P<0.05) 。TLR4蛋白的表达与Ki67蛋白的表达无明显相关性 (r=0.019, P=0.847) 。此外, TLR2蛋白与TLR4蛋白的表达无明显相关性 (r=0.060, P=0.546) 。

2.1.4 预后分析

结合免疫组化结果和随访信息对影响肝癌预后的因素进行单因素和多因素分析。截止至随访结束, 102例患者术后无复发生存时间为6~36月, 无复发中位生存时间为26.3月。KA-PLAN-MEIER法生存分析结果见表3, TLR2蛋白高表达和低表达的患者术后无复发中位生存时间分别为20.4月和29.3月, 两组相比较差异显著 (Log rank:P<0.05) , 由患者的生存函数曲线可以看出, TLR2蛋白的表达与患者预后生存率相关性很高 (图2) 。Ki67蛋白高表达和低表达的患者术后平均无复发生存时间分别为23和28.6月, 两组相比较差异显著 (Log rank:P<0.05) 。而TLR4蛋白高表达与低表达患者之间, 比较术后平均无复发生存时间无显著性差异。在临床病例参数中, TNM分期 (P<0.05) 、肝癌分化程度 (P<0.05) 和有无淋巴结转移 (P<0.05) 对术后平均无复发生存时间均有明显影响。

将TLR2蛋白表达、Ki67蛋白表达、TNM分期、肝癌分化程度和有无淋巴结转移进行多因素Cox比例风险模型分析, 结果见表4, 从表中可见TLR2蛋白表达 (P<0.05) 、Ki67蛋白表达 (P<0.05) 、TNM分期 (P<0.05) 与预后明显相关。肝癌分化程度 (P=0.217) 和有无淋巴结转移 (P=0.286) 与预后无明显相关。

2.2 Western Blot与Real-time RT-PCR结果

2.2.1 表达情况

Western Blot结果:TLR2和TLR4蛋白表达情况与免疫组化结果相似, 所有肝癌组织和癌旁组织标本均有表达, 分别于95 k D和93 k D处出现单一条带, 正常组织中分别2例和3例有表达, 表达率分别为11.7%和17.6%。Cyclin D1蛋白在32例肝癌组织均于36 k D处出现单一条带, 表达率53.3%;癌旁组织中2例出现阳性条带, 表达率3.3%;正常肝组织中1例出现阳性条带, 表达率1.7%。p70s6k蛋白在47例肝癌组织均于70 k D处出现单一条带, 表达率78.3%;癌旁组织中39例出现阳性条带, 表达率65%;正常肝组织中3例出现阳性条带, 表达率17.6%。TLR2、TLR4、Cyclin D1和p70s6k蛋白在肝癌组织中的表达相对含量显著高于癌旁组织和正常肝组织 (P<0.05) (图3) 。

1:低分化肝癌组织;2:高分化肝癌组织;3:癌旁组织;4:正常肝组织;柱形图依次TLR2、TLR4、Cyclin D1、p70s6k

Real-time RT-PCR结果:TLR2和TLR4 m R-NA在所有肝癌组织和癌旁组织标本均有表达, 正常组织中分别2例和4例有表达, 表达率分别为11.7%和23.5%。Cyclin D1 m RNA在34例肝癌组织有表达, 表达率56.7%;癌旁组织中3例有表达, 表达率5%;正常肝组织中1例有表达, 表达率1.7%。p70s6k m RNA在49例肝癌组织有表达, 表达率81.7%;癌旁组织中41例有表达, 表达率68.3%;正常肝组织中5例有表达, 表达率29.4%。以正常肝脏组织平均表达量为参照, 肝癌组织中TLR2、TLR4、Cyclin D1与p70s6k m RNA相对表达量显著高于癌旁组织和正常肝组织 (P<0.05) (图4) 。

2.2.2 TLR2、TLR4与Cyclin D1、p70s6k表达的关系

相关分析结果显示, TLR2、TLR4蛋白表达与增殖相关因子Cyclin D1和p70s6k蛋白的表达显著相关 (r=0.285, P<0.05;r=0.313, P<0.05;r=0.469, P<0.05;r=0.584, P<0.05) ;同时TLR2与TLR4 m R-NA的表达与增殖相关因子Cyclin D1和p70s6k m RNA的表达也显著相关 (r=0.627, P<0.05;r=0.261, P<0.05;r=0.324, P<0.05;r=0.174, P<0.05) 。

3 讨论

TLRs一词源于果蝇体内的Toll受体, 与人类的白介素-1受体 (interleukin-1 receptor, IL-1R) 有着相似的序列。TLRs是一类天然免疫受体家族, 其成员都是Ⅰ型跨膜蛋白, 其包膜外区参与PAMPs和DAMPs的识别;其胞内区通过髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary-response protein 88, My D88) 参与细胞内的信号转导过程。最近的研究表明, TLRs除了启动炎症反应, 在多种病理生理情况下可以直接调控细胞的增殖和组织修复, 因此其在肿瘤形成和癌变中的作用越来越受重视[10]。已经发现多种肿瘤组织表达不同的TLRs, 而且有证据表明这些表达的TLRs可能参与肿瘤增殖的调控[11]。关于TLRs如何调控肿瘤细胞的增殖, 两种机制值得关注:一是慢性炎症损伤过度修复机制, 二是肿瘤微环境致瘤分子模式识别机制。第一种机制为大家广泛接受, 在诸多与炎症相关的肿瘤中得到证实。自身免疫疾病或者病原微生物感染引起的许多慢性炎症是相应恶性肿瘤的癌前病变, 这些病原微生物包括幽门螺杆菌、人类乳头瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、EB病毒等, 它们感染机体促进消化系统肿瘤、宫颈癌、肝癌及造血系统肿瘤的发生发展[6]。TLRs信号转导通路的持续激活被认为是慢性炎症持续存在进而发展成为恶性肿瘤的重要因素[12]。第二种机制近年越来越引起人们的重视, 已有研究发现肿瘤细胞内的某些成分可以通过胞吐、分泌以及细胞坏死等方式释放到细胞外, 促进肿瘤的发生和发展[13]。这些致瘤分子模式包括S100家族蛋白复合物, 血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA) , 透明质酸的片段, 过氧化物酶基因1 (peroxiredoxin 1) , 以及需要热休克蛋白家族运载的各种活性短肽[14]。这些致瘤分子模式能够激活TLRs及其下游的信号转导通路, 调节肿瘤细胞的增殖、侵袭及其他生物学行为。肝细胞癌是一种公认的与炎症密切相关的恶性实体肿瘤, 其生长过程中常常伴有细胞的坏死和裂解, 因此TLRs与肝癌的发生发展关系密切。

本组研究选择了102例具有乙型肝炎背景的肝细胞癌组织作为免疫组化方法研究对象, 距离肿瘤组织>1 cm的癌旁组织作为炎症组织对照, 另外选择17例肝血管瘤距离肿瘤>2 cm的瘤旁组织作为正常肝组织对照。结果显示, TLR2、TLR4蛋白在肝癌组织中的表达显著高于癌旁炎症组织和正常肝组织 (P<0.05) , TLR2、TLR4蛋白在癌旁炎症组织中的表达显著高于正常肝组织 (P<0.05) 。说明TLR2和TLR4蛋白的表达与肝细胞癌的发生密切相关, 可能参与乙型肝炎病毒感染基础上的癌变。结合肝细胞癌组织学分级发现, 低分化肝细胞癌组织中TLR2蛋白的表达显著高于高分化的肝细胞癌组织。可见, TLR2蛋白与肝细胞癌的进展密切相关。本组结果TLR2和TLR4蛋白表达与有无淋巴结转移和TNM分期无关, 提示二者均不能作为临床分期的指标。我们通过KAPLAN-MEIER法生存分析和多因素Cox比例风险模型进行分析发现, TLR2蛋白阳性是一种危险因素, 其表达程度越高, 患者术后平均无复发生存时间越短。这说明, TLR2可能促进恶性细胞的增殖, 它表达增加时肝细胞癌术后易于复发, 预后不良。

《细胞增殖》教案 第5篇

(一)教材的地位与作用

《细胞通过分裂而增殖》选自《生物学》(北师大版)七年级上册第二单元第三章第三节。本节内容讲述细胞增殖是一种生命现象，体现了微观生物学知识。在学生掌握了细胞的结构和功能的基础上，本节课主要围绕“细胞体积为什么这么小?”这个问题展开教学，使学生在探究活动中理解细胞不能无限增大的原因，并为第二课时的教学提供平台，埋下伏笔。

(二)教学目标

根据初中生物课程的指导思想和新课程标准的的四项要求：①提高生物科学素养;②面向全体学生;③倡导探究性学习④注重与现实生活的联系。制定以下几个方面的教学目标。

1.认知目标：(1)解释细胞保持较小体积的主要原因;

(2)通过模型方法进行生物学的研究。

2.能力目标：(1)尝试利用数学方法探究细胞生长极限的问题;

(2)运用数学方法分析、归纳、推理、处理实验数据，得出细胞表面积与体积关系的规律。

3.情感与价值目标：(1)让学生体验模型实验法对获得知识和理解知识的重要作用; (2)让学生认同实事求是的科学态度，学会用批判性思维方法解决问题。

(三)教学重点、难点

重点: 通过两个活动来研究“细胞的体积为什么这么小?”的问题。

难点：活动“研究细胞体积与细胞表面积的关系”中学生提出预测、处理数据、得出结论。

二、学情分析

七年级学生刚步入中学，思维活跃，敢于质疑和讨论，具备一定的逻辑思维能力，但还不能完全离开实物的支持，且以往学习中较少涉及到细胞知识，同时学生在学习过程中由于观察、操作和分析能力的差异会产生不同层次的学习效果。而且七年级学生对“细胞大小与外界物质扩散的关系”的理解有一定难度，因此本节课设想通过教师引导，学生自主学习探究活动，来提高课堂效率。

三、教学策略

(一)教学用具

教具形式：制作教学课件;准备实验材料：酚酞琼脂块、氢氧化钠溶液、毫米尺。

使用方式：教师展示课件，指导学生用实验材料按活动二的目的要求探究细胞大小与物质扩散的关系。

效果预测：引起学生的兴趣，促进学生积极参与课堂活动，使他们由生动形象的感性知识逐步过渡到对抽象知识的理解。

(二)教法

依据：建构主义教学理论 (引导探究型学习，做中求学)

(直观教学法、比较归纳法、反馈法等)

①直观教学法：通过多媒体辅助教学，化静为动，化抽象为具体，增强了教学内容的直观性、启发性，使学生更好地从感性认识上升为理性认识。

②实验探究法：指导学生主动参与两项探究活动，锻炼学生的实验探究技能。

③通过师生互动，生生互动，对所获得数据和提出的问题进行分析、讨论、交流、处理，共同得出结论。

④课堂习题检测使教师发现问题，及时补充，进行教学反馈。

(三)学法

(观察法、讨论法、归纳分析法等)

本节内容理论性强、抽象复杂，所以课前要指导学生做好预习，课堂上让学生积极参与到教学活动中，使学生在动手操作，动脑思考中解决问题。

①指导学生以“细胞体积为什么这么小?”这一问题为主线，让学生进行自主探究。

②指导学生运用逻辑思维的方法处理分析实验数据,理解细胞体积与细胞表面积的关系。

③指导学生采用发散性思维的方法，联想的方法将模拟实验结果迁移到真实细胞，从而得出结论。

(四)重难点突破策略

重点的落实方案：教学中通过设置情景，引出问题“细胞的体积为什么这么小”引导学生思考、讨论。展示课件进行直观教学，组织学生参与探究活动，在实际操作中理解较小的细胞与其物质代谢的关系。

肝细胞增殖 第6篇

关键词：细胞外基质,血管平滑肌细胞,表型转化,细胞增殖

血管平滑肌细胞存在于血管壁中膜,是决定血管活性、血管构型及维持血管张力的重要因素。根据其结构和功能的不同可分为收缩型(分化型)和合成型(去分化)两种表型。收缩型VSMC呈分化状态,不能增殖;合成型VSMC呈去分化态,对外界各种有丝分裂原起反应而活跃增生[1]。VSMC保留有改变它们功能和结构的特性,作为对包括动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄、支架植入后再狭窄、静脉移植性疾病和移植性血管病变等血管增殖性疾病中生长因子和环境信号改变的应答,表现为VSMC从收缩型转化为合成型并获得增殖能力,这个过程称为表型转化(phenotypic modulation)[2,3]。VSMC表型受控于多种环境因素,包括生长因子、细胞外基质、机械性作用力、神经调节以及细胞间相互作用等。本文以平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,SMA-α)作为VSMC收缩型标志[2],骨桥蛋白(osteoponin,OPN)为VSMC合成型标志[4],就层粘连蛋白(Laminin,LN)、纤维连接蛋白(Fibronectin,LN)、Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ,ColⅣ)等细胞外基质成分对大鼠胸主动脉平滑肌细胞表型和增殖活性的影响进行了观察和探讨。现报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料

150~200 g健康SD大鼠,雌雄不限(10~12周龄),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。DMEM、胎牛血清、小牛血清(GIBCO);LN、LN、ColⅣ(BD discovery labware);Trizol(Invitrogen)Taq DNA聚合酶及缓冲系统、dNTP Mix(Fermentas)、RNasin(TaKaRa)。

1.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定

SD大鼠脱臼处死,全身用75%酒精浸泡后,无菌操作取出胸主动脉段,按贴壁法培养VSMC。原代培养获收缩表型细胞,传代培养获合成表型细胞(实验用4~6代细胞,细胞纯度达95%以上)。细胞鉴定:采用小鼠抗大鼠α-Actin免疫组织化学染色,鉴定血管平滑肌细胞肌动蛋白根据S-P法的常规操作,以胞浆棕黄色为阳性结果。运用S-P法对VSMCα肌动蛋白免疫组织化学染色,97%的细胞染色阳性。倒置显微镜下可见胞浆呈棕黄色,胞质中有较多的条丝状物,即为肌动蛋白,胞核为淡蓝色。

1.3 胞外基质包被培养板的制备

于24孔板中每孔分别加入500μL浓度为(20mg/m L的FN、LN和ColⅣ溶液(分别称FN、LN和ColⅣ组),对照孔加入500μL的0.2%牛血清白蛋白(BSA)溶液,4℃下过夜。吸弃未吸附的胞外基质,加入0.2%BSA溶液,置37℃、5%二氧化碳孵箱1h,以封闭非特异性结合位点,然后用PBS(0.01mol/L)冲洗3次备用。

1.4 不同基质对细胞表型影响

将原代培养收缩表型细胞以为2104的密度接种于胞外基质包被培养板,于24 h、48 h、72 h对VSMC表型标志基因和蛋白水平进行检测。

1.5 不同基质对细胞增殖能力的影响

将传代培养获得的合成表型细胞以2106的密度接种于细胞外基质包被24孔培养板中。在培养的24、48、72 h时每孔加入5 mg/m L的MTT溶液20μL,培养4 h后,弃液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL,避光振荡10 min,于酶标仪490nm处检测吸光度OD值。OD值与活细胞的增殖呈正比,OD值越大,表明细胞增殖越旺盛。

1.6 RT-PCR

参照说明书用Trizol试剂从培养细胞中抽提总RNA。在25μL逆转录体系中,加入总RNA 1μg,Oligo(dT)18 Primer 50 pmol,dNTP Mix(2.5 mmol/L)5μL,RNasin 25 U,M-MLV RT 200 U,5逆转录缓冲液5μL,42℃反应90 min以合成c DNA。PCR反应在Gene Cycler中进行,GAPDH作为内参照,总反应体积为25μL。含c DNA 1.0μL,上下游引物各25 pmol,dNTP Mix(2.5 mmol/L)2μL,Taq DNA聚合酶2.0 U,10Buffer 2.5μL。首先95℃预变性3 min,以后95℃变性45 s59.5℃退火60 s72℃延伸60 s,共35个循环,72℃再延伸7 min终止反应,4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μL,电泳完毕后在溴化乙锭(EB)中染色,在紫外灯下观察结果并照相。阳性条带以Gelpro4版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值,然后用其表达量与对应的GAPDH表达量的比值进行比较分析,以此代表目的片段的相对表达值。引物设计参照文献及核苷酸序列数据库,SMA-α上游引物:5'-GCATCCACGAAACCACCTA-3';下游引物:5'-CGCCGATCCAGACAGAATA-3'扩增片断210 bp;OPN上游引物:5'-GCTGAAGCCTGACCCATCT-3';下游引物:5'-GGTCTTCCCGTTGCTGTC-3'扩增片断:496 bp。

1.7 免疫印记分析(Western blot)

收集VSMC,按文献方法制备细胞裂解液,取20μL裂解液(含40μg蛋白)经SDS-PAGE分离后,通过电转移将蛋白印迹至硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉封闭膜上非特异性结合位点,继之分别与小鼠抗SM-a、OPN(1∶300,Santa Cruz),室温反应2 h,洗膜3次,随后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗(1∶80 000,Santa Cruz)室温反应2 h,于4-氯-1-萘酚,H2O2溶液中显色,显示蛋白条带。阳性条带以Gelpro4版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值,然后用其表达量与对应的GAPDH表达量的比值进行比较分析,以此代表目的片段的相对表达值

1.8 统计学处理

每组实验重复3次。数据以均数±标准差表示。各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。所有统计分析均用SPSS 16.0软件进行。

2 结果

2.1 不同基质成分对VSMC表型的影响

对照组及FN包被组细胞培养24 h后合成型标志OPN基因及蛋白显著表达,且FN包被组细胞明显高于对照组,收缩型标志SMA-α基因及蛋白则弱表达,FN包被组细胞明显弱于对照组,表明对照组及FN包被组VSMC迅速转化为合成表型细胞,并且FN可促进VSMC表型转换;ColⅣ包被组OPN表达弱于对照组,SMA-α则稍强于对照组,但无统计学意义,表明ColⅣ对于表型转换与对照组相比无明显的影响,LN包被组细胞培养24 h后SMA-α表达较强,显著高于对照组,OPN表达较弱,显著低于对照组,且可维持48 h以上,于72 h观察时SMA-α则显著降低,OPN则表达增强,与对照组基本一致。表明LN可显著延迟但并不能阻止VSMC表型转换(图1)。

2.2 不同基质对细胞增殖能力的影响

与对照组相比,FN组增殖活性显著增强,并与作用时间呈正比,LN包被组与ColⅣ包被组对VSMC增殖活性无明显影响(图2)。

A:SMA-α、OPNm RNA电泳图;B:SMA-α、OPNm RNA相对表达量;C:SMA-α、OPN蛋白Western blot电泳图;D:SMA-α、OPN蛋白相对表达量。覮与对照组相比,P<0.01。1:对照组;2:FN组;3:ColⅣ组,4:LN组

3 讨论

平滑肌细胞并非孤立的存在于血管壁上,它们与其周围的ECM和其他细胞通过自分泌、旁分泌因子和直接的物理接触相互作用。大量证据表明,环境因素诸如生长因子、ECM、脂质、与其他细胞的直接接触、机械压力可显著影响VSMC分化状态和功能,对血管壁的损伤性刺激可通过影响内皮功能、诱导免疫细胞的迁移和ECM的改变导致表型转换[3]。VSMC表型转化是高血压、动脉粥样硬化和血管成型术后再狭窄等心脑血管疾病VSMC增殖和迁移的关键性起始步骤,是该类疾病的共同的发病基础。由VSMC表型转化所引发的血管重构是血管再狭窄和动脉粥样硬化等血管病变发生发展的根本原因[5]。

HEDIN等发现FN可以诱导平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转换,而LN则维持平滑肌细胞的收缩表型[6]。本研究进一步显示LN可以显著促进VSMC收缩表型主要标志之一SMA-αm RNA表达水平及蛋白表达量显著增加,显著抑制VSMC合成表型主要标志OPN表达水平及蛋白表达量,但72h后SMA-α、OPN m RNA及蛋白水平逐渐与对照组水平趋于一致,表明LN可以延迟但并不能阻止VSMC表型转化,但LN对于VSMC增殖活性无明显影响。而ColⅣ对VSMC表型转化及增殖均无明显影响,FN则显著促进OPNmRNA及蛋白的表达,抑制SMA-αm RNA及蛋白的表达,表明FN可促进VSMC表型转化并且FN能够增强VSMC增殖活性并表现出作用时间的依赖性。

VSMC周围基膜主要是LN、ColⅣ、硫酸乙酰肝素蛋白多糖所构成,基膜在细胞和血管壁之间提供连续的结构支持用来转移由细胞产生的收缩力。基膜也可向VSMC提供信号使其保持于收缩表型,当血管壁受到损伤后,基膜完整性遭到破坏,蛋白水解活性增强,血浆中的FN渗入ECM,细胞也产生FN,导致ECM中FN大量增加[7]。体内研究发现,球囊损伤大鼠颈动脉后,在动脉中层的VSMC基底膜中LN消失,而在增殖和迁移的VSMC周围基质中富含FN;在成熟的新生内膜内,非增殖的VSMC周围LN重新出现,FN减少[8]。因此该研究人员认为,在正常血管壁中,LN可促进VSMC保持于分化状态,增殖活性极低,当血管损伤后,ECM中FN大量增加,促进VSMC表型转化并增强其增殖活性,从而促进血管病变的发生发展。

总之,细胞外基质成分LN、FN等对于VSMC表型及增殖活性具有十分重要的作用,其作用机制尚需进一步研究,阐明控制VSMC分化状态的调控机制对于理解参与血管疾病发生过程中的病理进程以及针对血管性疾病的干预有着极为重要的意义。

参考文献

[1]MACK CP.Signaling mechanisms that regulate smooth musclecell differentiation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(7):1495-1450.

[2]KAWAI-KOWASE K,OWENS GK.Multiple repressor pathwayscontribute to phenotypic switching of vascular smooth musclecells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,292(1):C59-69.

[3]ZHOU ZB,NIU JP,ZHANG ZJ.The role of lysophosphatidicacid receptors in phenotypic modulation of vascular smooth mus-cle cells[J].Mol Biol Rep,2010,37(6):2675-2686.

[4]WANG CL,COLUCCIO LM.New insights into the regulation ofthe actin cytoskeleton by tropomyosin[J].Int Rev Cell Mol Biol,2010,281:91-128.

[5]RZUCIDLO EM.Signaling pathways regulating vascular smoothmuscle cell differentiation[J].Vascular,2009,17(Suppl 1):S15-20.

[6]ULF HEDIN,BRADFORD A,BOTTGER,et al.Diverse effectsof fibronectin and laminin on phenotypic properties of culturedarterial smooth muscle cells[J].The Journal of Cell Biology,1988,107(1):307-319.

[7]ALEX O,MORLA,JON E,et al.Control of smooth muscle cellproliferation and phenotype by integrin signalig through focal ad-hesion kinase[J].Biochemical and Biophysical Research Commu-nications,2000,272(1):298-302.

AKT信号通路与干细胞增殖 第7篇

PI3-K/AKT信号通路最早被发现在胰岛素刺激及其应答的调控中起重要作用。随着研究的深入和下游底物的不断发现, PI3-K/AKT信号通路作为一条非常重要的细胞内信号转导通路被人们所认识。激素、生长因子、细胞因子、细胞外基质成分和应激等多种因素刺激后, AKT信号通路被活化, 在细胞周期调控、细胞生长与存活, 细胞增殖与凋亡, 细胞的迁移、分化及糖类代谢等的调控中扮演重要角色。AKT执行的复杂功能, 主要是通过磷酸化一系列特异性下游底物完成的。近年来对AKT信号通路的研究发现, 干细胞的增殖影响AKT及其下游信号分子的磷酸化表达水平, 这提示AKT信号系统在调控干细胞的增殖中起着重要的作用。

1.1 AKT的结构

AKT属于AGC蛋白激酶家族[1], 已经被证实是PI3-K/AKT信号通路的中心介导蛋白。1987年, Staal等[2]在小鼠的反转录病毒AKT8中找到一个癌基因, 命名为v-AKT。1991年, 3个独立的研究小组[3,4,5]先后成功克隆出AKT基因, 发现它是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 并认为AKT可能在酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸化途径中形成功能联系。AKT作为一种相对分子质量约60×103 (60KD) 的胞内信号蛋白, 因其激酶结构域与蛋白激酶A (PKA) 和蛋白激酶C (PKC) 具有高度同源性, 故又被称为蛋白激酶B (PKB) 。目前, 在哺乳动物中已发现的AKT家族至少包括三种亚型:AKT1, AKT2和AKT3, 也被称为PKBα, PKBβ和PKBγ。AKT1在真核细胞中广泛表达, 主要调控细胞存活和增殖;AKT2在胰岛素敏感组织中高度表达 (如肌肉、脂肪组织) , 参与胰岛素调节的代谢过程;而AKT3则主要分布在脑和睾丸组织, 调节细胞的大小以及数目[6]。它们在结构上具有高度的同源性和保守性, 其分子由氨基末端PH结构域、羧基末端调节结构域 (包含疏水基) 和中间的激酶催化结构域组成, 含有thr308、thr450、Ser473和Ser124四个磷酸化调节位点, 其中thr308 (位于催化结构域) 和Ser473 (位于调节结构域的疏水基) 的磷酸化与AKT活化有关, 并且双位点磷酸化才能使AKT完全激活。

1.2 AKT信号通路的调节

AKT是PI3-K/AKT信号通路中的关键信号转导分子, 其活化依赖于PI3-K, 因此研究中多以磷酸化的AKT (p-AKT) 作为衡量PI3-K活性的指标。PI3-K (phosphoinositide 3-kinase, 磷脂酰肌3-激酶) , 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶, 根据结构和底物的不同可以分为三型, 其中Ⅰ型P13-K参与生长因子和细胞因子激活的信号通路应答, 主要介导细胞的生存、增殖、分化等生物学功能[7]。Ⅰ型PI3-K是一种包含催化亚基和调节亚基的异源二聚体, 其中调节亚基由三个基因编码, 有五种亚型:p85α, p55α, p50α, p85β和p55γ;催化亚基有三种亚型, p110α, p110β和p110δ, 分别由不同基因编码。胰岛素或者生长因子等配体激活受体酪氨酸激酶 (RTKs) , 或者G-蛋白偶联受体受刺激后均能使P13-K磷酸化。在活化的PI3-K作用下, 细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸 (PIP2) 被磷酸化而转换成磷脂酰肌醇三磷酸 (PIP3) , 细胞质内的AKT因而被募集到细胞膜并通过氨基末端的PH结构域和PIP3结合并发生构象改变, PDK1 (3-phosphatide-dependent kinase, 磷脂酰激酶依赖激酶1) 得以靠近、催化AKT的thr308磷酸化。但是AKT的完全活化还需要Ser473的磷酸化, 后者的磷酸化相对复杂, 研究者们曾经推测其磷酸化调节可能与一种假想的名为PDK2的激酶有关, 但实际上后来的研究证明依据刺激和环境的不同[8,9], 参与催化该位点的酶是mTORC2或者DNA-PK。AKT完全激活后进一步介导其下游信号的级联反应, 参与调控细胞的存活、增殖、迁移、分化以及其他细胞代谢活动。随着研究的深入, 越来越多的蛋白分子被鉴定为AKT信号通路的特异性下游底物, 包括目前研究较多的:促凋亡因子BAD、胱天冬蛋白酶9 (caspase-9) , 促凋亡转录因子Forkhead家族, 促生存信号NF-κB, 雷帕霉素 (mTOR) 以及与糖代谢有关的糖原合成激酶-3 (GSK-3) 等。

PTEN则是AKT信号通路中重要的负性调节分子, 通过将PIP3去磷酸化为PIP2来实现对PI3-K的负调节, 此外, PP2A和PHLPP1/2分别通过诱导thr308、Ser473的去磷酸化而使AKT钝化, 也起到负性调节作用[10]。人工合成的LY294002是PI3-K的特异性抑制剂, 通过阻断PI3-K而实现对PI3-K/AKT信号通路的抑制。

2 AKT信号通路在干细胞增殖中的作用

干细胞可以分为三类:全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞;依据其所处的发育阶段则分为胚胎干细胞和成体干细胞。近年来干细胞在再生医学研究方面显示出广阔的临床应用前景, 成为其中最前沿, 最具活力和影响力的研究领域之一[11]。

尽管自我更新和增殖是干细胞的固有性质, 但目前对调控其增殖的信号通路及分子机制并不完全清楚。近年来的研究发现AKT信号通路及其下游蛋白的磷酸化表达水平可能决定着干细胞的命运, 在维持干细胞未分化状态、调节干细胞自我更新和增殖中起关键作用。

2.1 胚胎干细胞

1998年James等首次成功建立了人胚胎干细胞系, 将人卵体外受精培育至早期胚泡, 提取内细胞群, 最终得到了5个人胚胎干细胞系[12]。然而, 胚胎干细胞体外培养扩增时极易分化为其他细胞, 限制了干细胞移植的临床应用。

早在1999年, Sun等[13]在研究小鼠胚胎干细胞时就发现, PTEN基因缺陷的细胞完成一个细胞分裂周期的时间较正常时减少5%~10%。这项研究第一次使人们认识到PI3-K/AKT信号通路可能在胚胎干细胞的增殖调控中发挥重要作用。随后的研究进一步证实了这个发现, 当用PI3-K特异性抑制剂LY294002处理后, 胚胎干细胞的增殖减慢, 细胞富集于G1期[14]。周睿卿等[15]以胎鼠成纤维细胞作为饲养层, 二维培养的方法培养人胚胎干细胞并观察其生长状态, 以饲养层细胞、肿瘤细胞K562细胞株作为对照, 结果发现, 人胚胎干细胞在未分化状态时Pten抑制的PI3-K/AKT/mTOR信号通路下游磷酸化关键蛋白活性较低。研究者推测, PI3-K/AKT/mTOR信号通路在胚胎干细胞的自我复制和分化中起到重要作用, 更由此猜想如果抑制负调节蛋白PTEN或直接激活该通路正调节关键蛋白, 可能会加快人胚胎干细胞增殖、减少凋亡。

2.2 成体干细胞

脑缺血等损伤可以激活成年大脑内源性神经干细胞, 促使其增殖、产生新的神经元并向损伤部位募集, 这种现象在侧脑室外侧壁的室管膜下区 (SVZ) 和海马齿状回颗粒下层 (SGZ) 尤其明显[16,17]。但是这种调控机制至今仍未完全阐明, 研究表明微环境的改变、神经营养因子以及信号转导通路等可能都参与其中。1999年, Kitagawa等首次报导在永久性大鼠大脑中动脉缺血模型中观察到PI3-K/AKT信号通路的激活, 这提示AKT信号通路可能在神经干细胞的增殖方面起作用[18]。随后的大量研究证实这种内源性的干细胞增殖调控涉及多条信号通路, 其中由生长因子激活的PI3-K/AKT信号通路可能在干细胞生长、存活以及增殖中扮演重要角色[19,20,21]。这在赵宇等[22]体外培养的大鼠神经干细胞实验中也得到证实, 应用不同浓度梯度的PI3-K特异性抑制剂LY294002孵育后进行细胞存活、增殖等检测, 结果发现LY294002阻断AKT信号通路呈剂量依赖性, 且随着浓度升高, p-AKT含量降低, 大鼠神经干细胞的增殖受到明显抑制。

此外, 有关AKT信号通路参与其他成体干细胞如心脏干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等增殖调控的相关报道也有许多。成熟的心脏组织中仍然存在少量干细胞, 有研究表明其数量只占正常心肌细胞的1%[23]。赵岚等[24]证实, 心肌梗死同样促进内源性心脏干细胞增殖, PI3-K/AKT信号通路参与了大鼠心肌梗死后心脏干细胞的动员调节。在大鼠冠脉阻塞模型中观察到, 急性缺血诱导局部心肌AKT表达水平和干细胞数量同步进行性升高, AKT抑制剂显著抑制上述各项指标的动态演变, 使心肌梗死面积进一步恶化。Gharibi等[25]利用血小板源生长因子受体β体外培养人间充质干细胞, 发现P13-K/AKT/mTOR以及下游相关蛋白p70S6K和4E-BP1与干细胞增殖调控有关, 另一条信号通路ERK则介导间充质干细胞的分化。Perry等[26]揭示Wnt (β) -catenin和PI3-K/AKT信号通路的共同作用下, 造血干细胞才能实现自我更新和扩增。

同样有研究报导称AKT信号通路与干细胞的分化密切相关。Isomoto等[27]应用mTOR特异性抑制剂rapamycin阻断PI3-K/AKT/mTOR信号通路后发现成骨分化受抑制, 这提示PI3-K/AKT/mTOR信号通路的活化与成骨前体细胞即间充质干细胞的分化有关。国海东等[28]研究表明在骨形态发生蛋白-2 (BMP-2) 诱导的骨髓源性心肌干细胞向心肌细胞分化中, PI3-K/AKT信号通路发挥了重要的调控作用。成体干细胞在发育过程中, 既要维持自我增殖, 又要进一步分化为各种类型细胞, 在其分化和增殖之间应该存在着一种平衡调节机制, 可能AKT信号通路正是这种平衡途径之一。

3 AKT信号通路与肿瘤发生

近年来AKT信号通路与肿瘤发生的关系也日益受到人们的关注。AKT的过度表达或者PTEN等负调控机制的失活与恶性肿瘤的发生密切相关, 在多种恶性肿瘤中可以检测到该通路信号蛋白及其调节分子的异常表达[29,30]。蔓小红等[31]研究发现, 尖锐湿疣和宫颈鳞状细胞癌中PI3-K/AKT信号通路被异常激活, HPV有可能通过影响PI3K和P-AKT的表达上调进而引起感染上皮的异常增殖。研究已经证实PI3-K/AKT信号通路参与调节肿瘤细胞的增殖、存活和迁移, 目前以该通路及其关键分子为治疗靶点的肿瘤治疗新策略也成了研究热点。张辉等[32]的研究表明, AKT激酶在前列腺癌生长、发展以及激素依赖性向激素非依赖性的转变过程中起着重要作用。p-AKT蛋白磷酸化水平在AKT磷酸化激活过程中占主导地位, 是AKT激活的必要过程。米非司酮抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖, 诱导细胞凋亡, 其机制可能是通过抑制AKT信号转导通路, 从而激活Caspase。

4 中医中药

最近天津中医药大学的一个研究小组从传统中药丹参中提取出了45种活性成分[33], 一一检测其对于体外培养的神经干/祖细胞的增殖诱导能力, 筛选结果提示丹酚酸B对神经干/祖细胞具有促进增殖作用, 并且这种促进作用呈时间-剂量依赖关系, 其调控的分子机制可能与PI3-K/AKT信号通路有关;动物实验也证实丹酚酸B可以通过干预PI3-K/AKT信号通路介导短暂性脑缺血大鼠模型大脑神经干细胞的自我更新和增殖。丹参抗肝纤维化的作用已经被证实, 丹参的水溶性有效成分丹参素具有保护肝细胞, 显著抑制肝星状细胞增殖并促进其凋亡的作用[34]。王珏等[35]研究提示不同浓度的丹参素和渥曼青霉素作用于肝星状细胞24h后, 细胞中磷酸化AKT (p-Akt) 表达随药物浓度增加表达逐渐减弱, 这说明丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞增殖的抑制作用与其抑制PI3-K/Akt信号通路中AKT的活化有关。赖真等[36]研究发现, 黄芪可刺激PI3-K/AKT信号通路的表达, 减轻大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡。

5 展望

目前的研究揭示AKT信号通路参与了干细胞的自我更新和增殖调控, 未来研究的一个方向极有可能以此为调控靶点, 筛选药物, 提高干细胞的增殖率, 进而为干细胞治疗和再生医学提供更多的细胞来源, 使干细胞疗法在“不治之症”的治疗方面得到更广泛的应用。Jun等[37]研究发现, 原钒酸钠通过干预AKT和ERK信号通路促进中风大鼠大脑SVZ区的神经前体细胞增殖。由此推测, 原钒酸钠可能因此成为治疗脑中风的潜在药物。但是这种调控机制是非常复杂的, 可能不止涉及一条信号通路, 而是多条通路的相互作用、相互影响。有关干细胞增殖的精确调控机制以及胞内信号通路间的相互作用尚有待进一步的研究证实。

肝细胞增殖 第8篇

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为江汉大学动物中心提供的Wistar雄性大鼠 (4个月龄200～250g) ;重组人粒细胞集落刺激因子 (商品名:瑞白) 为山东齐鲁制药有限公司产品;一抗购自Santa Cruz Biotechnology公司 (Santa Cruz, CA, USA) ;图象分析软件Motic Images Advanced 3.2 (Motic中国) 。

1.2 动物模型的建立及分组

采用胶原酶Ⅶ定位注射诱发大鼠尾壳核脑出血模型。造模后的40只大鼠随机分为2组, 分别为阴性对照组 (20只) 和G-CSF治疗组 (20只) 。造模24h后G-CSF治疗组开始腹腔注射G-CSF, 按15μg/kg给药, 每日1次连续给药5d, 阴性对照组同时给予相同容积的生理盐水。造模2周后处死取材。

1.3 免疫组织化学法染色

切片常规脱蜡至水, 0.01M柠檬酸钠缓冲液微波修复10min;滴加一抗 (PBS作阴性对照) , 4°C过夜, PBS液漂洗2min3;加二抗, 37°C孵育30min, PBS漂洗2min3;DAB显色, 中性树胶封片。

1.4 统计学分析

2 组数据间差异显著性检测采用t检验。用SPSS 13.0统计分析软件处理数据, (P<0.05) 有显著性差异。

2 结果

2.1 G-CSF可促进脑出血大鼠的细胞增殖

我们用免疫组化的方法检测了造模2周后处死的2组大鼠出血灶周边细胞增殖的情况。我们检测的是增殖细胞核抗原 (Proliferating cell nulear antigen, PCNA) , 结果显示, 2组大鼠出血灶周边均可见PCNA阳性细胞表达。采用图象分析软件Motic Images Advanced 3.2进行细胞计数定量, 我们发现给予了G-CSF的大鼠阳性细胞密度高于对照组 (P<0.01, 见表1) 。结果提示, G-CSF可促进出血灶周边的细胞增殖。

2.2 G-CSF可促进出血灶周边星形胶质细胞的增殖

我们进一步检测了星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) 。实验结果可见, 2组大鼠出血灶周围均可见大量GFAP阳性细胞, 提示脑出血可刺激星形胶质细胞增生。采用图象分析软件Motic Images Advanced 3.2进行GFAP阳性细胞计数定量, 结果提示, G-CSF治疗组大鼠出血灶周围星形胶质细胞密度高于对照组 (P<0.01) , 见表1。结果提示G-CSF可增强脑出血后出血灶周围星形胶质细胞的增殖作用。

3 讨论

近年来不断有研究发现, G-CSF对局部脑缺血的大鼠模型具有神经保护作用[1]。临床上也逐渐有证据显示G-CSF对缺血性中风的患者 (如脑梗死) 有一定的治疗效果[2]。对于这种细胞因子的新功能的发现, 为中风性疾病的治疗提供了一条新思路。但G-CSF是否对脑出血也有治疗作用目前鲜见报道。

我们通过前期研究发现, G-CSF的确也可以促进脑出血后神经功能的恢复[3]。本实验的目的是进一步研究其作用机制。增殖细胞核抗原 (PCNA) 的主要生物学作用是促进细胞核中DNA链的合成与延伸, 促进细胞的生长与增殖, 因而可作为细胞增殖的标志物。检测出血灶周围PCNA的表达情况, 可反映脑出血后细胞增殖的状态。我们的实验证实, G-CSF可明显促进细胞增殖, 这种作用可能参与了G-CSF对脑出血大鼠的保护作用。

胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 是星形胶质细胞的标志物[4]。神经受损时可刺激星形胶质细胞增殖, 它们通过缓冲细胞外谷氨酸、分泌神经营养因子、促进抗氧化的机制调节神经元的活性的[5]。我们的实验结果发现, 给予了G-CSF的大鼠病灶周围GFAP的表达明显高于对照组, 证实了G-CSF具有促进星形胶质细胞增殖的作用。我们有理由相信G-CSF可通过直接与星形胶质细胞表面的G-CSF受体结合后促进其增殖。这些增殖的星形胶质细胞分泌一些神经营养因子参与G-CSF对脑出血大鼠的神经保护作用。

综上所述, 我们证实:G-CSF对脑出血大鼠神经保护作用的机制可能与粒细胞集落刺激因子促进细胞增殖, 尤其是星形胶质细胞的增殖有关系, 但其具体机制仍需深入研究揭示。

摘要：目的研究粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 对脑出血神经保护作用的机制。方法胶原酶定位注射构建脑出血大鼠模型, 然后给予G-CSF腹腔注射连续5天, 造模2周后通过免疫组化检测出血灶周边组织PCNA阳性细胞与GFAP阳性细胞的表达情况。结果给予G-CSF的大鼠PCNA阳性细胞与GFAP阳性细胞计数均明显高于未给药组。结论G-CSF能够促进大鼠脑出血后细胞 (尤其是星形胶质细胞) 的增殖, 该作用可能参与其对脑出血大鼠的神经保护作用。

关键词：粒细胞集落刺激因子,脑出血

参考文献

[1]Shyu WC, Lin SZ, Yang HI, et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colony-stimulating factor-stimulated stem cells[J].Circulation, 2004, 110:1847～1854.

[2]Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke, 1990, 21:801～807.

[3]Zhang L, Shu XJ, Zhou HY, et al.Protective Effect of Granulocyte Colony-stimulating Factor on Intracerebral Hemorrhage in Rat[J].Neurochem Res, 2009, 34:1317～1323.

[4]Virgin CE Jr, Ha TP, Packan DR, et al.Glucocorticoids inhibit glu-cose transport and glutamate uptake in hippocampal astrocytes:implications for glucocorticoid neurotoxicity[J].J Neurochem, 1991, 57:1422～1428.

肝细胞增殖 第9篇

1 材料与方法

1.1 材料

人慢性粒细胞白血病急变期K562细胞株，购于中国科学院上海细胞库。酪氨酸激酶抑制剂PTK787由瑞士诺华公司惠赠。MTT购于美国Sigma公司。RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

K562细胞在含10%小牛血清，100μmol/L的青、链霉素的RPM1640培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于各项实验。

1.2.2 PTK787对K562细胞增殖作用的细胞形态学观察

使用分别加入10μl不同浓度的PTK787作用K562细胞48 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长变化情况，并拍照。

1.2.3 MTT法检测PTK787对K562细胞的增殖作用

取对数生长期、生长良好的白血病K562细胞用于实验，调整各组细胞浓度为1×104个/ml，每组设3个复孔。各实验组加入含10μl不同浓度PTK787的细胞培养液。接种完毕后在37℃，5%CO2条件下孵育培养12、36、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml)10μl，混匀后37℃，5%CO2条件下孵育4 h，加入三联细胞裂解液（SDS 10 g，异丁醇5 ml,10M HCl 0.1 ml用双蒸水溶解配成100 ml溶液）100μl,37℃温育12～20 h，用丹尼酶标仪检测各组细胞的吸光度，测定波长为570 nm。细胞抑制率=1-（实验组光密度-空白对照组光密度）/（阴性对照组光密度-空白对照组光密度）×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测PTK787对K562细胞周期作用

6孔板每孔加入等量细胞以及10μl不同浓度的PTK787，培养48 h，冷PBS洗涤离心2次，弃PBS。用70%冰乙醇固定12 h，调整细胞浓度1×106个/ml；用冷PBS洗涤2次，弃PBS。加入PI染液0.6 ml，避光染色半小时后上流式细胞仪检测。打印DNA含量直方图，自动拟合细胞周期各时相比例。重复5次。

1.3 统计学处理

使用SPASS 13.0统计软件进行统计描述，本实验数据资料以（±s）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较根据方差齐性检验，当总体方差齐同时选择LSD法；当总体方差不齐时，选择Tamhane T2法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTK787对K562细胞增殖作用情况的细胞形态学观察

以下为不用浓度PTK787作用K562细胞48 h后相差显微镜下细胞生长变化图。阴性对照组为生长48 h的K562细胞：细胞生长旺盛，形态规则，密集平铺在培养板。加入不同浓度的PTK787作用细胞48 h，且药物浓度逐渐升高，发现细胞生长明显受抑制，细胞数量、形态均有改变，呈浓度相关性。见图1。

2.2 PTK787对K562细胞增殖的作用

不同浓度的PTK787作用于K562细胞12、36、48、72 h后，用MTT法检测结果见表1。表明PTK787对K562细胞有明显的抑制作用。随着PTK787浓度增加与作用时间延长，K562的增殖抑制率逐渐升高。同一时间不同浓度组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。同一浓度不同时间组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。提示PTK787作用48 h，浓度为320μmol/L对细胞抑制最明显。继续增加浓度或延长作用时间抑制率增加不明显。（图1）。

2.3 PTK787对K562细胞周期的作用

流式细胞仪检测细胞周期表明，PTK787显著改变G1期与S期细胞比例。加入20、40、80、160、320μmol/L PTK787的细胞组分别与阴性对照组相比较，G1期细胞比率均高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。G1期细胞组与S期细胞组各组间比较差异有统计学意义（P<0.05），但是PTK787浓度由160μmol/L继续升高时，G1期与S其细胞比率改变不明显。提示PTK787抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与减慢G1/S期的转换有关。见表2。

%

3 讨论

蛋白酪氨酸激酶按其结构可分为受体酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinases,RTKs）和非受体酪氨酸激酶（non-receptor protein tyrosine kinases,nrPTKs）[2]。PTK787/ZK222584是一种新型血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。国外研究发现，PTK787可抑制多种实体肿瘤细胞的生长[3,4,5]，研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[6]。酪氨酸激酶在肿瘤形成过程中起着重要作用，这一方面究已经取得很多进展。酪氨酸激酶功能的失调，会导下游信号途径激活，引起细胞增殖调节紊乱，最终导致肿瘤形成[7]。本实验通过研究不同浓度PTK787作用于K562细胞后，观察对细胞增殖，细胞周期作用的影响。结果表明，PTK787具有明显抗白血病作用，主要表现在：（1）抑制K562细胞增殖，药物浓度从20μmol/L升高到320μmol/L，细胞的增殖抑制率明显升高（P<0.05），其中药物浓度以320μmol/L，作用时间为48 h时细胞的抑制率最高。继续提高药物浓度和延长药物作用时间细胞抑制无明显改变；（2）阻止K562细胞周期G1期想S期转换；S期是细胞周期的关键时刻，DNA复制、蛋白合成均在S期，所以S期细胞数目降低表明细胞增殖受到抑制。

PTK787对K562细胞的生长抑制机理可能为：（1)PTK787可抑制所有已知的VEGFR酪氨酸激酶。通过与VEGFR上的三磷酸腺苷结合位点竞争性结合，抑制VEGF介导的信号传导通路，阻断新生血管的形成而抑制肿瘤的生长[8]。药物尼罗替STI571为作用于该类受体的酪氨酸激酶抑制剂。体外研究表明，STI571可降低CML细胞系的K562细胞系和KU812F细胞系以及表达野生型BCR-ABL的前B细胞系Ba/F3的BCR-ABL自主磷酸化，抑制细胞增殖[9]。（2）通过下调Bcl-2和Bcl-xL的表达诱导肿瘤细胞凋亡增加。（3）作用于肿瘤细胞生长周期的G1期、部分G2/M期，从而抑制肿瘤细胞生长[10]。（4)PTK787可下调白血病细胞FAK基因的表达，而FAK类似于癌基因的作用。从而达到抗肿瘤的作用。（5)PTK787可能通过纠正ph（﹢）CML细胞异常蛋白表达，使细胞恢复正常生长状态。以往的抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常的组织细胞也有杀伤作用。随着分子生物学技术的发展和从细胞受体与增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制认识的进一步深入，针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗开始进入临床，人们称其为“分子靶向治疗”。临床的酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用机制可能是通过抑制肿瘤细胞的损伤修复、使细胞分裂阻滞在G1期、诱导和维持细胞凋亡、抗新生血管形成等途径实现。分子靶向对抗肿瘤细胞不仅对肿瘤细胞有很强的杀伤力，并且可使正常细胞免受损害，可大大减少化疗的副作用。

最新研究进展表明，作为促使细胞通过G1/S期限制点的细胞周期蛋白Cyclin D1的表达失常与多种肿瘤的癌变相关。在转基因动物中证明，Cyclin D1的变异参与了间变等癌变早期病理变化过程。酪氨酸激酶促进肿瘤细胞增殖的机制可能为增加细胞DNA合成和加快G1/S期的转换。酪氨酸激酶是通过增加Cyclin D1的表达与抑制p21的协同作用来促进DNA合成的，应用酪氨酸激酶抑制剂可以阻断这些过程[11]。这些结果均提示诱导酪氨酸激酶的表达对于细胞周期的调节是正性的，而Cyclin D1可能是酪氨酸激酶调节细胞周期的基本功能靶点，这为下一步的研究提供了理论基础。

摘要：目的:观察酪氨酸激酶抑制剂PTK787对K562细胞增殖、细胞周期的作用,探讨PTK787抗急性髓系白血病的作用机制。方法:应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察不同浓度PTK787在不同时间对K562细胞增殖作用的影响;用流式细胞仪检测浓度PTK787对K562细胞周期的抑制作用。结果:随着PTK787浓度增加与作用时间延长,K562细胞的增殖抑制率逐渐升高。同一时间不同浓度组之间比较,或者同一浓度不同时间组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中PTK787作用48h,以浓度320μmol/L对细胞抑制率最强。随着PTK787浓度增加,G1期细胞比例逐渐升高,S期细胞比例逐渐下降,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PTK787可以抑制K562增殖,阻止K562细胞由G1期向S期转化,从而达到抗白血病的作用。

肝细胞增殖 第10篇

1 材料与方法

1.1 Hepa1-6肝癌细胞株培养

小鼠肝癌细胞株Hepa1-6购自中国科学院上海细胞库, 培养于含有10%小牛血清的DMEM (高糖) 培养基中, 实验所用细胞均处于对数增长期。

1.2 MTT法检测si RNA对Hepa1-6细胞增殖的影响

MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法) 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒[2]。

1.2.1 实验分组

根据实验设计如下分组:50 nmol CDC20干扰组, 50 nmol HPSE干扰组, 联合干扰组1 (50 nmol CDC20+50 nmol HPSE) , 联合干扰组2 (50nmol HPSE+50 nmol CDC20) , 50 nmol CDC20+50nmol阴性对照 (N.Cont) 干扰组, 50 nmol HPSE+50nmol N.Cont干扰组, 对照组1 (空白) , 对照组2 (50nmol N.Cont) , 对照组3 (100 nmol N.Cont) 。CDC20和HPSE si RNA引物合成同前期[1]研究。

1.2.2 si RNA的转染与细胞增殖抑制率的检测

取对数生长期Hepa1-6细胞以1×104个/孔接种于96孔板, 培养至细胞贴壁后转染 (分组同上) , 采用脂质体Lipofectamine 2000包埋的si RNA转染48h后, 每孔加入20μL MTT (5 g/L) , 37℃5%二氧化碳 (CO2) 条件下孵育4 h。再向每孔中加入200μL的DMSO, 振荡10 min, 用酶标仪于570 nm处测定吸光度 (A) 值。根据公式:细胞增殖抑制率 (%) = (空白对照组吸光度-si RNA组吸光度) /空白对照组吸光度×100%, 测定si RNA对细胞增殖的抑制率。每组均设3个复孔, 并重复3次实验。

1.3 流式细胞术检测si RNA对Hepa1-6细胞周期的影响

细胞周期包含G1期 (DNA合成前期) 、S期 (DNA合成期) 、G2期 (DNA合成后期) 、M期 (有丝分裂期) 4个阶段, 见图1。流式细胞仪通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测得到该细胞的光散射和荧光指标, 分析出其体积、内部结构、DNA、RNA等[3]物理及化学特征。细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化, 如G0/G1期的DNA含量为2C, 而G2期含量是4C。利用PI (碘化丙啶, 一种可对DNA染色的细胞核染色试剂) 标记的方法, 通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定可分析细胞周期各时相的百分比。

1.3.1 实验分组

实验分组如下:50 nmol CDC20si RNA干扰组, 50 nmol HPSE si RNA干扰组, 终浓度为50 nmol的CDC20 si RNA+HPSE si RNA联合干扰组 (即混合组) , 空白对照组以及50 nmol N.Cont对照组。

1.3.2 流式细胞术细胞周期分析

将转染48 h的Hepa1-6细胞消化后离心 (250 g, 5 min) 后, 弃上清, 加入300μL含10%小牛血清的PBS振荡重悬, 再振荡加入700μL无水乙醇固定, 40℃放置30 min。250 g, 5 min离心去除上清液, 用预冷PBS洗1次, 加入PI溶液 (50 mg/L, 购自Sigma, USA) 、0.1%Triton X-100、0.1 mmol/L EDTA及50 mg/L RNase A, 室温避光染色30 min, 然后用流式细胞术分析细胞周期 (注:流式检测细胞数为1×105个) 。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析, 数据以均数±标准差 (±s) 表示, 多个样本间比较行方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 si RNA对Hepa1-6细胞增殖的影响

与3个对照组相比, 3个CDC20 si RNA干扰组和3个HPSE si RNA干扰组细胞的增殖受到明显的抑制 (P<0.05) , 且CDC20与HPSE联合干扰组细胞增殖受抑制更明显。此外, 单纯CDC20 si RNA干扰组比单纯HPSE si RNA干扰组细胞增殖受抑制更显著 (P<0.01) 。结果见表1及图2。

注:与各对照组相比, 各si RNA干扰组细胞的增殖受到显著抑制, P<0.05

2.2 各组si RNA对Hepa1-6细胞周期的影响

与对照组相比较, si RNA各组细胞G2/M期DNA含量显著增高 (P<0.01) , 但混合组G2/M期DNA含量最高, 说明si RNA各组细胞周期在G2/M期有明显的阻滞, 且混合组更明显。见表2。

与对照组相比, si RNA干扰组细胞的增殖受到明显的抑制

注:与空白对照组、N.Cont对照组比较, si RNA各组G2/M期DNA显著增高P<0.01

3 讨论

RNA干扰作用 (RNAi) 是生物界一种古老且进化高度保守的现象, 其主要通过双链RNA被核酸酶切割成2l~25 nt的干扰性小RNA即si RNA, 由si RNA介导识别并特异性切割同源性靶m RNA分子而实现。RNA干扰技术是近年发现的一种通过双链RNA介导的特异、高效抑制特定基因表达的新途径[4]。

HPSE是参与细胞外基质和血管基底膜中的硫酸乙酰肝素降解的关键酶, 对于肿瘤细胞的侵袭和生长具有重要作用;其在正常肝组织中无明显表达, 但在肝癌、乳腺癌等组织中的表达明显升高[5]。CDC20是肝细胞复制周期后期进程中泛肽蛋白酶复合体APC的激活中介物。LIAO等[6]研究表明, 肝细胞复制在通过细胞周期后期检查点之前, CDC20基因的表达显著升高;阻断该基因的表达, 将导致APC失活, 从而使细胞周期停止在M期。但下调该基因的表达, 特别是同时联合下调CDC20和HPSE的表达对肝癌细胞生长、增殖的影响尚未见报道。

我国是全球肝癌发病率最高的国家, 每年肝癌发病和死亡例数占全球所有肝癌病例的一半以上。癌细胞无节制复制、增殖的生物学行为是目前攻克肝癌主要难题之一。本研究尝试利用RNA联合干扰技术同时下调肝癌细胞侵袭生长和增殖复制的关键基因CDC20和HPSE的表达, 观察其对小鼠Hepa1-6肝癌细胞体外增殖的影响, 结果表明, 与对照组相比, CDC20 si RNA干扰组和HPSE si RNA干扰组细胞的增殖受到明显的抑制 (P<0.05) , 且CDC20与HPSE联合干扰组细胞增殖受抑制更明显。此外, 单纯CDC20 si RNA干扰组比单纯HPSE si RNA干扰组细胞增殖受抑制更显著 (P<0.01) 。流式细胞术细胞周期分析结果表明, 与对照组相比较, si RNA各组细胞G2/M期DNA含量显著增高 (P<0.01) , 但联合干扰组G2/M期DNA含量最高, 说明si RNA各组细胞周期在G2/M期有明显的阻滞, 且联合干扰组更明显, 亦即RNA联合干扰使小鼠Hepa1-6细胞体外增殖复制明显受阻。

文献报道[6,7]CDC20和HPSE基因均与肝癌细胞的增殖有关, 但前者侧重于细胞的增殖, 后者侧重于促进肿瘤的生长和转移。本实验观察到的结果是: (1) CDC20和HPSE的si RNA各组细胞的增殖均受到显著的抑制, 联合干扰组更加显著, 表明联合干扰有协同效应, 但协同效应的分子机制有待进一步研究。 (2) 与HPSE干扰组相比, CDC20干扰组对Hepa1-6肝癌细胞增殖的抑制效果更加明显, 说明CDC20基因对肝癌细胞增殖的影响更大, 该结果与LIAO等[6]在正常肝细胞再生的复制周期研究中报道相一致。后续的研究将观察同时下调CDC20和HPSE的表达对小鼠Hepa1-6肝癌细胞体外侵袭转移能力的影响。

摘要：目的 探讨RNA联合干扰 (RNAico) 对肝癌细胞株Hepa1-6增殖的影响。方法 设计针对小鼠肝癌细胞Hepa1-6 CDC20和HPSE mRNA的小干扰RNA, 以阳离子脂质体包埋后转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6, 即RNAico;转染48 h后, 采用MTT法和流式细胞术检测小干扰RNA对肝癌细胞体外生长和复制的影响。结果 与对照组相比, 联合干扰组肝癌细胞体外生长和复制均明显受抑制 (P<0.05) 。结论 RNAico可显著抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6的增殖。

关键词：RNA干扰,小鼠,肝癌,增殖

参考文献

[1]廖允军, 王成友, 罗成蓉, 等.RNA联合干扰对肝癌细胞CDC20和HPSE表达的影响.中国现代医学杂志, 2012 (30) :18-20.[1]LIAO YJ, WANG CY, LUO CR, et al.The effect of combined siRNA on the expression of CDC20 and Heparanase mRNA in mouse Hepa1-6 hepatocarcinoma cell lines[J].China Journal of Modern Medicine, 2012 (30) :18-20.Chinese

[2]赵嘉惠, 张华屏, 王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报, 2007 (3) :262-263.[2]ZHAO JH, ZHANG HP, WANG CF.Investigate on the cell proliferation by MTT[J].Journal of Shanxi Medical University, 2007 (3) :262-263.Chinese

[3]李靖, 李成斌, 顿文涛.流式细胞术 (FCM) 在生物学研究中的应用[J].中国农学通报, 2008 (6) :107-111.[3]LI J, LI CB, DUN WT.Aplication of flow cytometry on biology[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2008 (6) :107-111.Chinese

[4]王俊霞, 郑金枝, 常灏, 等.RNA干涉的临床前实验研究进展[J].生命科学, 2009 (4) :566-573.[4]WANG JX, ZHENG JZ, CHANG H, et al.New advances in preclinical applications of RNA interference[J].Chinese Bulletin of Life Sciences, 2009 (4) :566-573.Chinese

[5]廖允军, 王成友, 张敏杰, 等.RNA干扰对肝癌细胞CDC20表达的影响[J].中华实验外科杂志, 2009, 26 (1) :47-49.[5]LIAO YJ, WANG CY, ZHANG MJ, et al.The effect of siRNA on the expression of CDC20 in hepatocarcinoma cell lines[J].Chinese Journal of Experimental Surgery, 2009, 26 (1) :47-49.Chinese

[6]LIAO YJ, OLGA NS, EYAL S, et al.Delayed hepatocellular mitotic progression and impaired liver regeneration in Early Growth Response-1 deficient mice[J].J Biol Chem, 2004, 279:43107-43116.